一种病原微生物感染诊断型细胞芯片的制作程序的制作方法

专利名称：一种病原微生物感染诊断型细胞芯片的制作程序的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种病原微生物感染诊断型细胞芯片的制作程序。
背景技术：
感染性疾病是危害人民健康和生命的常见病和多发病。其感染的普遍性、致病的复杂性使临床上对该类疾病的诊断和治疗非常困难，迫切需要一种有效、快速的诊断技术。 对于病毒性疾病病原体的检测，由于病毒的培养比较困难，且时间较长，阳性率低、不易操作，因此临床上主要依靠血清学方法和分子生物学方法诊断病毒的感染。但上述两类方法不同程度地存在有缺点或不足。例如中和试验法、补体结合试验法、血凝抑制试验法存在取材及可检测范围狭窄等局限性；酶联免疫吸附法通常采用间接法，由于生产厂家的质量标准不统一，所以假阳性率高；放射免疫分析法对操作人员的技术水平要求较高，且对环境有一定的污染。细菌、真菌等病原微生物主要依靠培养的方法进行诊断，所需时间较长。前述方法的缺陷还在于其对病原微生物的检测均是一对一的检测，而临床上病原微生物与疾病的关系是一种疾病可以由多种病原微生物引起；一种病原微生物又可以引起多种疾病。因此，其无法满足临床对多种病原微生物的高通量、快速检测的需要。目前国内外已有基因芯片、蛋白芯片用于病原微生物检测，尚无用于病原微生物诊断的细胞芯片。基因芯片是基于临床病原微生物核酸水平的检测，临床标本中病原微生物的含量很低，核酸必须经PCR扩增放大后才能用于基因芯片检测，多种病原体检测需多重PCR技术，而目前多重PCR技术的应用范围有限，不能满足高通量芯片的需要，且PCR容易出现假阳性，因此其对实验条件和操作者的要求较高，条件一般的医院难以开展。国内已有对肿瘤进行诊断的蛋白芯片产品，一般来讲，蛋白芯片的制作需要高纯度的特异性抗原或特异性单克隆抗体，而高纯度的特异性抗原或特异性单克隆抗体制备工艺复杂，造价高， 导致采用其制作的蛋白芯片价格昂贵。南京益来基因医学有限公司关于细胞芯片的中国专利“细胞微阵列芯片及其制备方法”，专利申请号00122065. 9。该技术的细胞芯片上包被的是培养的正常细胞，仅用于化合物、生物分子或药物的高通量筛选及功能基因组学研究，而无法用于病原微生物检测。

发明内容
本发明解决了背景技术中低通量、高成本、检测速度慢、准确性差的技术问题。本发明的技术解决方案是一种病原微生物感染诊断型细胞芯片，包括基片1和反应槽2，其特征在于所述的基片1上设置有反应槽2，反应槽2内设置有细胞薄片3。上述细胞薄片3是将含有病原微生物的菌涂片或包被有被病毒感染的真核细胞的细胞片切割成的与反应槽2形状相应的薄片。上述反应槽2的设置凹于或凸于基片1表面均可。上述反应槽2可为一个、两个或多个，所述设置于反应槽2内的细胞薄片3相应的为一个、两个或多个。上述多个反应槽2以阵列排布为佳。上述基片1可为有机高分子材料、金属或硅等；所述的细胞薄片3的材料可为玻璃、塑料或硝酸纤维素薄膜等。
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一种如上所述病原微生物感染诊断型细胞芯片的制备方法，其特征在于该
1).基片的制备
采用机高分子材料、金属或硅制备出基片1，在基片1表面上采用微加工技术制作出反应槽2 ；
2).细胞薄片的制备
根据检测病原微生物，制备病毒感染细胞薄片或病原微生物细胞薄片；
3).细胞芯片的制备
将细胞薄片粘接在反应槽2内。上述病毒感染细胞薄片的制备可包括
(1).细胞复苏；根据检测病毒选择特异的宿主细胞；
(2).细胞传代培养；
(3).制备细胞悬液；
(4).制作单层细胞片；
(5).病毒感染；
(6).固定；
(7).切割成细胞薄片；
上述病原微生物细胞薄片的制备可包括
(1).细菌、真菌等其他病原微生物的纯培养；
(2).制备菌悬液；
(3).制作菌涂片；
(4).固定；
(5).切割成细胞薄片。本发明具有以下优点
1.高通量。临床上病原微生物与疾病的关系是一种疾病可以由多种病原微生物引起；一种病原微生物又可以引起多种疾病。因此，本发明可同步地检测出多种病原微生物， 满足临床对病原微生物的高通量检测的要求；
2.低成本。芯片材料造价低，且材料易得，制备工艺简单，价格低廉；
3.操作简单，易于掌握，检测无需特殊条件，便于普及；
4.检测快速、准确，可对感染性疾病进行快速确诊；
5.对环境无污染；
6.应用范围广。不但可为临床提供诊断依据，还可用于畜禽的微生物检疫。


图1、2、3分别为本发明的结构示意图。
具体实施例方式参见图1、2、3，本发明的病原微生物感染诊断型细胞芯片主要由基片1、 反应槽2、细胞薄片3构成。基片1可采用有机高分子材料、金属或硅等，其上上加工有
放置细胞薄片3的反应槽2，反应槽2据检测需要可为一个、两个或多个，以设置为阵列排布的多个为佳。细胞薄片3是将细菌、真菌、螺旋体等病原微生物的菌涂片或包被有被病毒感染的真核细胞的细胞片，切割成的与反应槽2形状相应的细胞薄片3，细胞薄片的材料可以是玻璃、塑料或硝酸纤维素薄膜等。将细胞薄片3嵌于反应槽2内。细胞薄片上包被有针对某一种病原微生物的特异性抗原，所以可直接用于病原微生物的检测。使用时，可以将盖玻片覆盖于反应槽2上。本发明的具体制作方法如下 1.基片的制备
采用透光有机高分子材料如聚苯乙烯等制备出基片1，在其上采用微加工技术制作出方形或长方形的反应槽2。2.细胞薄片的制备
根据检测病原微生物的不同，可制备不同的细胞薄片。1].病毒感染细胞薄片的制
备.细胞复苏。检测病毒时，根据不同的病毒选择特异的宿主细胞。[2].细胞传代培养。[3].制备细胞悬液。[4].制作单层细胞片。[5].病毒感染。[6].固定。[7].切割成细胞薄片。2].细菌、真菌类其他病原微生物细胞薄片的制备.细菌、真菌等其他病原微生物的纯培养.制备菌悬液.制作菌涂片.固定.切割成细胞薄片 3.细胞芯片的制备
将细胞薄片3用光学透明胶粘接在反应槽2内。本发明制作方法实施例 1.基片的制备
采用有透光度强的有机高分子材料如聚苯乙烯制备出基片1，基片1的边缘区较中间区略高并呈台阶状，小台阶用来固定盖玻片。基片1上采用微加工技术根据需要制备出若干反应槽2，反应槽2的四壁略高于细胞薄片3的厚度并与小台阶同高，可用以支撑盖玻片。 反应槽3内固定细胞薄片3。反应槽2还可以凹陷于基片1中。2.细胞薄片的制备
1).病毒感染细胞薄片的制备
根据感染病毒的不同，可采用不同的细胞系，如H印-2、Vero— E。2BS、NS1、SP_2 / 0寸。(1).细胞复苏将装有冻存细胞的塑料冻存管自液氮罐中取出后，立即放入37°C 水浴箱中，3分钟；离心，1000rpm，5分钟；弃上清，加入培养液含胎牛血清的RPM11640培养液，用吸管瓶底把细胞吹打下来，制成悬液。(2).细胞传代培养在CO:保湿培养箱中37°C，5%C0。进行培养。细胞传代培养2—3代，直至性状稳定。(3).制备细胞悬液吸出旧的培养液，向培养瓶内加入含0. 25%胰蛋白酶的消化液，轻轻摇动培养瓶使消化液流过所有细胞表面，37°C，作用2分钟后，吸出消化液。然后加入培养液终止消化，再用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁细胞，制成细胞悬液。(4).制作单层细胞片将经过清洗和消毒灭菌的盖玻片放入无菌的培养皿中，用吸管吸取细胞悬液滴加在盖玻片上，使细胞悬液均勻地覆盖在盖玻片上。37°C，培养卜2 天，观察细胞长成单层，吸去细胞悬液。(5).病毒感染将一定滴度的病毒悬液滴加至单层细胞片上，在CO 保湿培养箱中37°C，吸附1.证后，吸去病毒悬液，加入培养液的维持液，在CO。保湿培养箱中37°C，培养2—3天，吸去病毒悬液，取出经病毒感染的细胞片。(6).固定用丙酮溶液固定2小时以上。(7).切割成细胞薄片用PBS缓冲液及双蒸水洗去病毒感染的细胞片上的残余固定液，晾干。用手工或自动化切割仪将病毒感染的细胞片切割成数毫米见方的细胞薄片。2].细菌、真菌等其他病原微生物细胞薄片的制备
(1).细菌、真菌等其他病原微生物的纯培养采用细菌、真菌等其他病原微生物的标准株或临床分离培养株，固体培养基分离培养。(2).制备菌悬液收集单菌落，制成菌悬液。(3).制作菌涂片取无菌的盖玻片，滴加适量菌悬液，均勻涂布，待其自然干燥。(4).固定用丙酮溶液固定2小时以上。(5).切割成细胞薄片用手工或自动化切割仪将菌涂片切割成数毫米见方的细胞薄片。3.细胞芯片的制备
将切好的细胞薄片用胶粘剂粘接到基片相应的反应槽上。4°C保存。本发明根据临床需要可将临床常见的病原微生物分别组合成中枢神经系统系列、 呼吸系统系列、泌尿生殖系统系列、优生优育系列、心血管系统系列、眼鼻耳喉系列检测芯片。
权利要求
1.一种病原微生物感染诊断型细胞芯片的制作程序，其特征在于包括基片(1)和反应槽O)，其特征在于所述的基片(1)上设置有反应槽0)，反应槽O)内设置有细胞薄片 ⑶，(1).所述的细胞薄片( 是将含有病原微生物的菌涂片或包被有被病毒感染的真核细胞的细胞片切割成的与反应槽(2)形状相应的薄片；(2).所述反应槽O)的设置凹于或凸于基片(1)表面；(3).所述的反应槽(2)为一个、两个或多个，所述设置于反应槽O)内的细胞薄片(3) 相应的为一个、两个或多个；(4).所述的多个反应槽O)为阵列排布；(5).所述的基片(1)为有机高分子材料、金属或硅；所述的细胞薄片(3)的材料为玻璃、塑料或硝酸纤维素薄膜。
2.一种如权利要求1所述的一种病原微生物感染诊断型细胞芯片的制作程序，其特征在于该方法包括1)基片的制备采用机高分子材料、金属或硅制备出基片(1)，在基片(1)表面上采用微加工技术制作出反应槽O)；2)细胞薄片的制备根据检测病原微生物，制备病毒感染细胞薄片或病原微生物细胞薄片；3)细胞芯片的制备将细胞薄片粘接在反应槽O)内。
3.如权利要求2所述病原微生物感染诊断型细胞芯片的制作程序，其特征在于所述病毒感染细胞薄片的制备包括(1)细胞复苏；根据检测病毒选择特异的宿主细胞；(2)细胞传代培养；(3)制备细胞悬液；(4)制作单层细胞片；(5)病毒感染；(6)固定；(7)切割成细胞薄片。
4.如权利要求3所述病原微生物感染诊断型细胞芯片的制备方法，其特征在于所述病原微生物细胞薄片的制备包括(1)细菌、真菌等其他病原微生物的纯培养；(2)制备菌悬液；(3)制作菌涂片；(4)固定；(5)切割成细胞薄片。
全文摘要
一种病原微生物感染诊断型细胞芯片的制作程序，其基片上设置有反应槽，反应槽内设置有细胞薄片。 病毒感染细胞薄片的制备包括1．基片的制备，采用有机高分子材料、金属或硅制备出基片，在基片表面上采用微加工技术制作出反应槽；2．细胞薄片的制备，根据检测病原微生物，制备病毒感染细胞薄片或病原微生物细胞薄片；3．细胞芯片的制备，将细胞薄片粘接在反应槽内。 本发明提供了一种高通量、低成本、快速、准确的病原微生物感染诊断型细胞芯片及其制备方法。
文档编号C12Q1/02GK102477456SQ20101055346
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者王爽 申请人:大连创达技术交易市场有限公司