一种治疗牛乳房炎的药剂及其应用
【专利摘要】一种治疗牛乳房炎的药剂及其应用，包括乳房注射剂和乳房喷雾剂；所述乳房注射剂中乳铁蛋白质量浓度为1.5%~8.0%，所述乳房喷雾剂中乳铁蛋白质量浓度为1.0%~5.0%。本发明是采用注射剂和喷雾剂相结合从而达到治疗目的，采用天然乳汁提取物乳铁蛋白取代抗生素治疗牛乳房炎的药物，具有广谱高效抑菌、不产生耐药性，见效快且无药物残留，奶牛无停奶期等特点。并且药物原料来源广泛，原料丰富，用药安全，无毒副作用，制备的药物具有个体及群体防治的双重作用，具有双向调节作用，不产生抗药性，且效果持久，无残留。
【专利说明】
-种治疗牛乳房炎的药剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及牛乳房炎治疗药物领域，一种W低铁饱和度乳铁蛋白为有效成分的治 疗牛乳房炎的药剂及其应用。
【背景技术】
[0002] 牛乳房炎是一种牛常见多发病，发病率达40%，是世界范围内奶牛易患并给牛奶生 产企业造成巨大经济损失的疾病。牛乳房炎是由多种非特定的病原微生物感染引起的，其 中80%~90%W上是由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌引起。治疗牛乳房炎的方法目前国内主要采 用抗生素局部注射法，国外主要采用疫苗预防加抗生素治疗的方法。由于国内和国外奶牛 饲养方法的不同，国外集中规模化养殖疫苗作用相对明显，国内分散养殖感染源相对复杂， 疫苗推广还需进一步研究，且疫苗研究目前依然处于探索阶段，价格昂贵，周期长，作用慢， 专属性强。而长期使用抗生素或滥用抗生素使受体产生很强的抗药性，治疗效果下降，如采 用加大剂量将进入新的恶性循环。牛乳中残留抗生素会对人体产生很大危害。长期饮用含 抗生素乳制品，会使人体积累抗生素，造成生理素乱，使细菌对抗生素产生耐药性，给疾病 防治造成困难;对抗生素敏感者，还会造成过敏性休克，甚至危及生命。2008年9月，农业部 更新发布实施《无公害食品生鲜乳》行业标准，对新鲜牛乳的卫生指标明确了 "抗生素不得 检出"。我国已开始逐步严格运一行业标准。国外欧美国家多年前即已法规禁止抗生素残留 超限量的牛奶上市（对青霉素类药物残留的限量为〇.4ppm至Ippm左右）。如何减少经济损 失，如何有效解决牛乳及乳制品中抗生素残留问题，世界一直在寻找可取代抗生素治疗牛 乳房炎的药物。
【发明内容】
[0003] 针对现有抗生素药物治疗牛乳房炎的缺陷，本发明提供一种用天然乳汁提取制备 的低铁饱和度乳铁蛋白（blf)取代抗生素治疗牛乳房炎的药物，其通过采用注射剂和喷雾 剂相结合从而达到治疗目的，其具有广谱高效抑菌、不产生耐药性、见效快且无药物残留、 奶牛无停奶期等特点。
[0004] 本发明中治疗牛乳房炎的药剂，包括乳房注射剂和乳房喷雾剂； 所述乳房注射剂中乳铁蛋白质量浓度为1.5%~8.0%，其中各组分配比如下： 乳铁蛋白2.25~16g 碳酸氨钢1.5g~2. Og 去离子水 182~196ml 所述乳房喷雾剂中乳铁蛋白质量浓度为1.0%~5.0%，其中各组分配比如下： 乳铁蛋白1.5g~lOg 碳酸氨钢1.5g~2. Og 去离子水 188~197ml。
[0005] 进一步的，所述乳房注射剂和乳房喷雾剂中的乳铁蛋白均为铁饱和度为5~8%的低 铁饱和度乳铁蛋白。
[0006] 进一步的，所述乳房注射剂和乳房喷雾剂的抑均控制为5-7。
[0007] 进一步的，所述所述乳房注射剂和乳房喷雾剂中碳酸氨钢浓度控制为lOOmmol/L。
[0008] 进一步的，所述低铁饱和度乳铁蛋白是通过W下工艺获得的低饱和度乳铁蛋白， 其步骤为： 第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解吸;所述解吸过程是采 用二级解吸，第一级解吸是采用1~2.5%的盐溶液解吸，解吸液是乳过氧化物酶蛋白，弃去； 第二级解吸是采用3.5~7%的盐溶液解吸，解吸液送入第2步处理;所述的盐溶液是指钢盐、 钟盐或者巧盐溶液； 第2步，对第1步得到的解吸液采用分离膜进行浓缩;所述的分离膜是截留分子量在 1000~30K的超滤膜； 第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+馨合树脂进行吸附，再采用分离膜对浓缩 液进行浓缩;所述吸附操作时需要在浓缩液中加入醋酸、醋酸盐W及构祿酸盐，配制其吸附 环境中构祿酸盐浓度为0. lmol/l~0.5mol/L，并调节pH至5.0~6.7;所述的分离膜是截留分 子量在1000~30K的超滤膜。
[0009] 进一步的，所述的弱酸型阳离子树脂是指CM树脂;所述的不溶性Fe3+馨合树脂是指 D403馨合树脂。
[0010] 进一步的，所述的第2步得到的浓缩液在送入第3步之前，需要再经过一次弱酸型 阳离子树脂的吸附、解吸和超滤膜的浓缩处理。
[0011] 进一步的，所述的第3步中，根据权利要求1所述的从牛乳中提取高纯度低铁饱和 度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第3步中，树脂的吸附时间20~120分钟，吸附时揽 拌奖转速速率为20~15化pm，吸附溫度在3~30°C。
[0012] 进一步的，所述第1步中，阳离子交换树脂的制备步骤为： 第1步，取lOg氯乙酷化聚苯乙締-二乙締基苯微球载体PS-ac^-Cl，加入60ml四氨巧喃 溶胀12 h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比PS-a巧1-C1:乙二胺:碳酸氨钢为1:8:0.7，依 次加入乙二胺和碳酸氨钢，在于80°C下揽拌反应2地，反应结束后，将产物倒入砂忍漏斗中， 用蒸馈水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联邸A微球载体； 第2步，称60g取交联邸A微球载体，置于Ξ颈烧瓶中，加入二甲基甲酯胺溶胀12 h后，加 入2-丙締酷胺基-2-甲基丙烷横酸16g、N-下氧基甲基丙締酷胺3g、丙締酸双环戊締基醋、 K2C03 5g、四下基漠化锭12g，揽拌下于一定溫度的油浴中回流反应，反应结束后将反应产物 转移至沙忍漏斗中，用5wt%的肥1清洗4遍后用蒸馈水滤洗至中性，最后用甲醇洗滤后抽干， 真空干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。
[0013] 所述牛乳房炎的药剂在治疗牛乳房炎药物中的应用;所述药物被制备为乳腺管注 射、肌肉注射、皮下注射、口服、外喷给药的形式;所述牛乳房炎为急性牛乳房炎或慢性牛乳 房炎。
[0014] 所述牛乳房炎为急性牛乳房炎或慢性牛乳房炎。
[0015] 本发明是采用注入剂和喷雾剂相结合从而达到治疗目的，采用天然乳汁提取制备 的低铁饱和度乳铁蛋白取代抗生素治疗牛乳房炎的药物，具有广谱高效抑菌、不产生耐药 性，见效快且无药物残留，奶牛无停奶期等特点。并且药物原料来源广泛，原料丰富，用药安 全，无毒副作用，制备的药物具有个体及群体防治的双重作用，具有双向调节作用，不产生 抗药性，且效果持久，无残留。本发明提供的乳铁蛋白制备方法具有乳铁蛋白提取与制备纯 度高的优点，同时能够降低乳铁蛋白中Fe3+离子含量，使铁饱和度降低至5-8%，从而明显提 高了乳铁蛋白的抗菌活性。此外通过调整化馨合树脂吸附的时间、揽拌速度W及媒介的浓 度、pH，可W对乳铁蛋白处理后的铁饱和度进行控制，W满足不同产品应用对乳铁蛋白铁饱 和度的要求。
【附图说明】
[0016] 图1是金黄色葡萄球菌的乳铁蛋白杀菌曲线； 图2是大肠杆菌的乳铁蛋白杀菌曲线； 图3是不同NaHC03浓度下乳铁蛋白抑菌曲线。
【具体实施方式】
[0017] W下结合具体实施例对本发明做进一步的描述。
[001引实施例1 一种治疗牛乳房炎的药剂，包括乳房注射剂和乳房喷雾剂； 乳房注射剂中乳铁蛋白质量浓度为1.5%~8.0%，其中各组分配比如下： 乳铁蛋白2.25~16g 碳酸氨钢1.5g~2. Og 去离子水 182~196ml 乳房喷雾剂中乳铁蛋白质量浓度为1.0%~5.0%，其中各组分配比如下： 乳铁蛋白1.5g~lOg 碳酸氨钢1.5g~2. Og 去离子水 188~197ml。
[0019]实施例2 根据实施例1提供的药剂组成，分别选择铁饱和度7%的乳铁蛋白、铁饱和度20%的乳铁 蛋白配置为乳房注射剂或者乳房喷雾剂样品进行体外抑菌试验;具体步骤如下:实验菌种 为金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠杆菌(ATCC25922)，将其制备浓度为lOVml菌悬 液。采用滤纸法进行抑菌试验，平皿内底层均匀铺平琼脂，菌液加入琼脂后涂布均匀，将铁 饱和度7%的乳铁蛋白、铁饱和度20%的乳铁蛋白的blf试验浓度分别为5.Omg/ml、2.5mg/ml、 2.25mg/ml、2. Omg/ml、1.75mg/ml、1.5mg/ml进行点种试验培养24小时，用W进行金黄色葡 萄球菌抑菌试验；将铁饱和度7%的blf、铁饱和度20%的blf试验浓度分别为3. Omg/ml、 1.5mg/ml、1.35mg/ml、1.2mg/ml、1.05mg/ml、0.9mg/ml、0.75mg/ml进行点种试验培养24小 时，用W进行大肠杆菌抑菌试验用直尺测量抑菌圈大小。结果如下： 表1对金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的抑菌圈直径结果：
通过表1和表2可见，铁饱和度7%的乳铁蛋白的抑菌效果比铁饱和度20%的乳铁蛋白更 好，在一定范围内，blf浓度浓度高抑菌效果也更好。
[0020] 实施例3 根据实施例1提供的药剂组成，分别选择铁饱和度7%的乳铁蛋白、铁饱和度20%的乳铁 蛋白配置为乳房注射剂或者乳房喷雾剂样品进行抑菌试验 (1)实验菌株为金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，并制备浓度为lOVml的菌悬液。采用 平板计数法进行抑菌试验，分别配置浓度为6. Omg/ml，5. Omg/ml，4. Omg/ml，3. Omg/ml的铁 饱和度7%的乳铁蛋白溶液，然后与平皿内琼脂混匀铺平，使菌液划线接种于平皿中，37°C培 养，然后于 15min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min和 120 min各时间点，计 数平板上的菌落数(取Ξ块平皿的平均值），结果见表3。并绘制金黄色葡萄球菌经不同浓度 bLf作用后，不同时间点的杀菌曲线，见图1。
[0021] 表3金黄色葡萄球菌
(2)实验菌株为大肠杆菌(ATCC25922)，并制备浓度为lOVml的菌悬液。采用平板计数 法进行抑菌试验；分别配置浓度为6mg/ml，5mg/ml，4mg/ml，3mg/ml的铁饱和度为7%blf溶 液，然后与平皿内琼脂混匀铺平，使菌液划线接种于平皿中，37°C培养，然后于15min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min和120 min各时间点，计数平板上的菌落数 (取Ξ块平皿的平均值），见表4。并绘制大肠杆菌经不同浓度化f作用后，不同时间点的杀菌 曲线，见图2。
[0022] 表4大肠杆菌菌株
实施例4 根据实施例1提供的药剂组成，选择铁饱和度7%的乳铁蛋白配置为浓度为5%的乳房注 射剂或者乳房喷雾剂样品进行抑菌试验，将其抑分别调整至5、7、9Ξ种抑值，然后与培养基 混合，测定该药物平板对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌菌株的最小抑菌浓度(MIC)变化，见表 5;结果在抑5和7时，乳铁蛋白对金黄色葡萄球菌的MIC均为2.0 mg/ml，乳铁蛋白对大肠杆 菌的MIC均为1.2 mg/ml;当抑卵寸，乳铁蛋白对金黄色葡萄球菌的MIC增高至4 mg/ml，对大 肠杆菌的MIC增高至3 mg/ml，表明乳铁蛋白对化的抑菌作用受抑影响。
[0023] 表5不同抑值对MIC的影响
实施例5 根据实施例1提供的药剂组成，将铁饱和度为20%、15%、10%、7%的乳铁蛋白均配制成浓 度为2.5mg/ml的乳铁蛋白溶液，其中化HC03浓度分别控制为25mmol/L、50mmol/L、75mmol/ L、100mmol/L，测定对S. aureus的抑菌圈直径，结果见图3。图3表明HC03-的浓度为 lOOmmol/L时，产生的抑菌圈直径几乎是对照组的1.8~2倍。运证明肥03-的浓度增加会提高 blf铁结合能力。
[0024] 实施例6 根据实施例1提供的药剂组成，将乳铁蛋白lOg、碳酸氨钢2.Og、去离子水188ml配置为 乳铁蛋白溶液，分成两部分分别作为乳房注射剂和乳房喷雾剂;将上述药剂对80例临床型 牛乳房炎患者进行治疗观察。
[0025] 试验奶牛选择娟姗、荷斯坦两品种奶牛，临床诊断为无全身性反应临床型急、慢性 牛乳房炎，均为一个乳区患病。设乳房注射剂治疗组、乳房注射喷雾混合治疗组和抗生素对 照组。其中： 乳房注射剂治疗组，急、慢性牛乳房炎各20例，采用导乳针导入乳池后注射，每日2次。
[0026] 乳房注射喷雾混合治疗组，急、慢性牛乳房炎各20例，先用乳房喷雾剂对乳房局部 喷洒进行抑菌杀菌，再用导乳针导入乳池后注射，每日2次。
[0027] 试验结果如下： 单独使用注射剂治疗急性牛乳房炎20例，平均用药7日，治愈18例，治愈率90%;治疗慢 性牛乳房炎20例，平均用药8日，治愈17例，治愈率85%。
[0028] 使用注射剂和喷雾剂联合治疗急性牛乳房炎20例，平均用药7日，治愈20例，治愈 率100%;治疗慢性牛乳房炎20例，平均用药8日，治愈20例，治愈率100%。
[0029] 通过W上对比可见，同时实用注射剂和喷雾剂，治疗效果最佳，比单一的注射治疗 效果有明显改进。本方法乳房注射剂和乳房喷雾剂用药剂量小，使用方便，见效快，不产生 耐药性且治愈率高，未见任何不良反应;治愈后跟踪观察15天，未见复发。
[0030] W下的实施例提供一种低饱和度乳铁蛋白的制备工艺;它分别用放置阳离子交换 树脂的揽拌罐来吸附、解附牛乳中乳铁蛋白，并辅W膜分离技术将其分离、浓缩，可W实现 对乳铁蛋白的高度纯化;接下来，将所得乳铁蛋白浓缩液放置不溶性化馨合树脂(如D403 馨合树脂）的揽拌罐来吸附铁离子使其失去铁离子变为不饱和状态，并辅W膜分离将其浓 缩纯化。
[0031] 在使用阳离子交换树脂对乳铁蛋白进行吸附、解吸时，揽拌罐可调揽拌奖转速速 率为20~10化pm;罐内侧壁有增满流挡板，罐底设置带过滤板的树脂床，在树脂床上的树脂 层上方8~12cm高度处设置快速导流抽滤管。罐内设置供自动控制的各种传感器P的十，重量 计，电导率计及溫度计，罐内液体保溫溫度为3~60°C。乳铁蛋白吸附树脂为阳离子交换树 月旨，树脂吸附解附的次数和条件可W根据不同产品和产品纯度的要求设定;树脂的吸附时 间为20~1200分钟，吸附溫度在3~30°C。树脂的解附采用两级盐浓度分别解附乳过氧化物 酶蛋白、乳铁蛋白。第一级盐浓度为1~2.5%，解附乳过氧化物酶蛋白，解附时间为20~120 分钟;第二级盐浓度为3.5~7%，解附乳铁蛋白，解附时间为20~120分钟;解附的揽拌速率 为20~15化pm。树脂解附的时间为20~120分钟，树脂解附所用的盐为钢盐、钟盐、巧盐;乳 铁蛋白解附液通过0.05~1.0微米的微滤膜将乳铁蛋白解附液除菌，去残余的脂肪与其他 小颗粒;再用化~30K分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。
[0032] 在一个实施方式中，为了提高乳铁蛋白的纯度，可W对经上述工艺吸附解附脱盐 浓缩的乳铁蛋白浓液再经过一次弱酸型阳离子树脂(如CM树脂)的吸附、解吸和超滤膜的浓 缩获得的。
[0033] 上述得到的浓缩液再放置于不溶性化馨合树脂如D403馨合树脂，加入醋酸溶液、 醋酸盐、构祿酸盐作为媒介，配制其吸附环境浓度为0.1111〇1/1~0.5111〇1/1，调抑5.0~6.7， 加 W揽拌吸附乳铁蛋白中铁离子，树脂吸附揽拌时间、媒介浓度、转速、抑可根据产品饱和 度的要求设定;树脂的吸附时间20~120分钟，揽拌奖转速速率为20~15化pm，吸附溫度在3 ~30°C。吸附后清液用化-30K分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。将乳铁蛋白浓液进行 真空冷冻干燥制成冻干粉。
[0034] 树脂经吸附工艺过程后，所吸附的铁离子用Imol/L~3mol/L盐酸浸泡即可将树脂 解附再生，再用R0水冲洗即可供下一批次吸附之用。
[0035] 实施例7阳离子交换树脂的制备 本发明所使用的阳离子交换树脂可W通过如下的方法制备得到： 第1步，取lOg氯乙酷化聚苯乙締-二乙締基苯微球载体(PS-ac^-Cl)，加入60ml四氨巧 喃溶胀12 h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比(PS-acyl-Cl):乙二胺(EDA):碳酸氨钢为1: 8:0.7,依次加入乙二胺和碳酸氨钢，在于80°C下揽拌反应2地，反应结束后，将产物倒入砂 忍漏斗中，用蒸馈水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联邸A微球载体； 第2步，称60g取交联邸A微球载体，置于Ξ颈烧瓶中，加入二甲基甲酯胺溶胀12 h后，加 入2-丙締酷胺基-2-甲基丙烷横酸(AMPS)16g、N-下氧基甲基丙締酷胺(NBMA)3g、丙締酸双 环戊締基醋(DCPA)、K2C03 5g、四下基漠化锭(TBAB) 12g，揽拌下于一定溫度的油浴中回流 反应，反应结束后将反应产物转移至沙忍漏斗中，用5wt%的HC1清洗4遍后用蒸馈水滤洗至 中性，最后用甲醇洗滤后抽干，真空干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。
[0036] 实施例8阳离子交换树脂的制备 与实施例7的区别在于第2步中未加入NBM。
[0037] 本发明所使用的阳离子交换树脂可W通过如下的方法制备得到： 第1步，取lOg氯乙酷化聚苯乙締-二乙締基苯微球载体(PS-ac^-Cl)，加入60ml四氨巧 喃溶胀12 h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比(PS-acyl-Cl):乙二胺(EDA):碳酸氨钢为1: 8:0.7,依次加入乙二胺和碳酸氨钢，在于80°C下揽拌反应2地，反应结束后，将产物倒入砂 忍漏斗中，用蒸馈水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联邸A微球载体； 第2步，称60g取交联邸A微球载体，置于Ξ颈烧瓶中，加入二甲基甲酯胺溶胀12 h后，加 入2-丙締酷胺基-2-甲基丙烷横酸(AMPS)16g、丙締酸双环戊締基醋(DCPA)、K20)3 5g、四下 基漠化锭(TBAB) 12g，揽拌下于一定溫度的油浴中回流反应，反应结束后将反应产物转移 至沙忍漏斗中，用5wt%的HC1清洗4遍后用蒸馈水滤洗至中性，最后用甲醇洗滤后抽干，真空 干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。
[0038] 实施例9乳铁蛋白的吸附、解附试验 配备3份100ml 1.6wt%乳铁蛋白溶液于250ml烧杯中，各取20μ1进高效液相色谱仪检 ii，峰面积分别为1240.0034(万）、1241.6533(万）和1240.0535(万），分别将100旨5?070树 月旨、实施例1和实施例2中的阳离子交换树脂分别lOOg置于上述盛有250ml乳铁蛋白溶液的 烧杯中，吸附揽拌速率为60rpm，每lOmin取样一次进行检测，实验数据如下表看出实施例1 和2中阳离子树脂提高生产回收率，改善吸附解附所消耗的时间。另外，再经过盐溶液淋洗、 解附后计算蛋白含量。
[0039] 淋洗、解附的操作是:采用两级盐浓度分别解附乳过氧化物酶蛋白、乳铁蛋白。第 一级盐浓度为1.5%，采用的是化C1水溶液，解附乳过氧化物酶蛋白，解附时间为70分钟;第 二级盐浓度为5.0%，采用的是化C1水溶液，解附乳铁蛋白，解附时间为80分钟;解附的揽拌 速率为10化pm。乳铁蛋白解附液通过0.2微米的微滤膜将乳铁蛋白解附液除菌，去残余的脂 肪与其他小颗粒;再用2000分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。
[0040] 从上表可W看出，采用SPC70树脂、实施例1和实施例2中的阳离子交换树脂都可W 较好地获得乳铁蛋白的吸附、解吸效果，不过回收率上还是有所区别。
[0041] 实施例10乳铁蛋白的提取试验 半脱脂牛奶1890L，P册.7，总蛋白为3.38g/L，乳铁蛋白浓度为126mg/L，将SP口0树脂加 入揽拌罐，吸附80min，揽拌速率为60rpm，收集已吸附后的牛奶并用R0水冲洗树脂，加入第 一级10化2.5%NaCl水溶液解附40min，揽拌转速40rpm，收集解附液后用R0水淋洗收集;加 入第二级10化5.5%NaCl水溶液解附40min，揽拌转速40rpm，收集解附液后用R0水淋洗收集 树脂3次。第二级的解吸液W及第二次R0淋洗液合并收集共18化，输送到0.1 wii的微滤膜设 备中进行除菌、除杂；用30K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，取样检测其铁饱和度 为20%;将乳铁蛋白浓液输入到装有CM树脂罐中除去杂蛋白，收集已吸附杂蛋白后的乳铁蛋 白溶液继续用lOK分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，将其中的少量浓液进行冷冻干 燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0%，灰分1.1%，总蛋白为96.3%，铁饱和度20%;再将剩余的 乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403馨合树脂罐中进行脱铁，加入O.lmol/L构祿酸盐，并醋 酸-醋酸钢缓冲液调抑至6.0，加 W揽拌吸附铁离子，树脂吸附时间120分钟，揽拌奖转速速 率60rpm。收集W吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱 盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0%，灰分1.0%，总蛋白为 96.3%，铁饱和度7%。
[0042] 实施例11乳铁蛋白的提取试验 半脱脂牛奶1890L，p册.7,总蛋白为3.38g/L，乳铁蛋白浓度为126mg/L，采用实施例1中 描述的步骤操作生产阳离子交换树脂，将树脂加入揽拌罐，吸附80min，揽拌速率为60rpm， 收集已吸附后的牛奶并用R0水冲洗树脂，加入第一级10化2.5%NaCl水溶液解附40min，揽 拌转速40rpm，收集解附液后用R0水淋洗收集；加入第二级100L 5.5%化C1水溶液解附 40min，揽拌转速40rpm，收集解附液后用R0水淋洗收集树脂3次。第二级的解吸液W及第二 次R0淋洗液合并收集共18化，输送到Ο.?μπι的微滤膜设备中进行除菌、除杂；用30K分子截留 量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，取样检测其铁饱和度为20%;将乳铁蛋白浓液输入到装有CM 树脂罐中除去杂蛋白，收集已吸附杂蛋白后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤 膜设备进行脱盐浓缩，将其中的少量浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.2%， 灰分1.1%，总蛋白为96.7%，铁饱和度20%;再将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403馨 合树脂罐中进行脱铁，加入O.lmol/L构祿酸盐，并调抑至6.0,加 W揽拌吸附铁离子，树脂吸 附时间120分钟，揽拌奖转速速率60rpm。收集W吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用10K分 子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水 量3.1 %，灰分1.0%，总蛋白为96.7%，铁饱和度7%。
[0043] 实施例12乳铁蛋白的提取试验 与实施例10的区别在于:将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403馨合树脂罐中进 行脱铁，加入0.5mol/L构祿酸盐，并醋酸-醋酸钢缓冲液调pH至5.0，加 W揽拌吸附铁离子， 树脂吸附时间20分钟，揽拌奖转速速率15化pm。收集W吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续 用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉 末含水量3.0%，灰分1.0%，总蛋白为96.4%，铁饱和度8%。
[0044] 实施例13乳铁蛋白的提取试验 与实施例11的区别在于:将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403馨合树脂罐中进 行脱铁，加入0.3mol/L构祿酸盐，并醋酸-醋酸钢缓冲液调pH至6.7，加 W揽拌吸附铁离子， 树脂吸附时间70分钟，揽拌奖转速速率80rpm。收集W吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用 10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末 含水量3.0%，灰分1.0%，总蛋白为96.5%，铁饱和度7%。
[0045] 本发明W生鲜乳、乳清粉为原料分离提取乳铁蛋白，根据给药途径调配不同配方 制成的化学药物。用于治疗急、慢性牛乳房炎。本发明讲述两种给药途径的配方，乳房注入 剂和喷雾剂抑菌能力强，对引起牛乳房炎的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有抑菌作用，具有 高效、快速治疗作用且治疗后奶牛无停奶期特点，牛乳房直接注入，无刺激作用、无不良反 应。
【主权项】
1. 一种治疗牛乳房炎的药剂，其特征在于，包括乳房注射剂和乳房喷雾剂； 所述乳房注射剂中乳铁蛋白质量浓度为1.5%~8.0%，其中各组分配比如下： 乳铁蛋白2.25~16g 碳酸氢钠1.5g~2.0g 去离子水 182~196ml 所述乳房喷雾剂中乳铁蛋白质量浓度为1.0%~5.0%，其中各组分配比如下： 乳铁蛋白1.5g~10g 碳酸氢钠1.5g~2.0g 去离子水 188~197ml。2. 根据权利要求1所述的治疗牛乳房炎的药剂，其特征在于，所述乳房注射剂和乳房喷 雾剂中的乳铁蛋白均为铁饱和度为5~8%的低铁饱和度乳铁蛋白。3. 根据权利要求1或2所述的治疗牛乳房炎的药剂，其特征在于，所述乳房注射剂和乳 房喷雾剂的pH均控制为5~7。4. 根据权利要求1或2所述的治疗牛乳房炎的药剂，其特征在于，所述乳房注射剂和乳 房喷雾剂中碳酸氢钠浓度控制为100mm〇l/L。5. 根据权利要求1或2所述的治疗牛乳房炎的药剂，其特征在于，所述乳铁蛋白是通过 以下工艺获得的低铁饱和度乳铁蛋白，其步骤为： 第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解吸;所述解吸过程是采 用二级解吸，第一级解吸是采用1~2.5%的盐溶液解吸，解吸液是乳过氧化物酶蛋白，弃去； 第二级解吸是采用3.5~7%的盐溶液解吸，解吸液送入第2步处理;所述的盐溶液是指钠盐、 钾盐或者妈盐溶液； 第2步，对第1步得到的解吸液采用分离膜进行浓缩；所述的分离膜是截留分子量在 1000~30K的超滤膜； 第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂进行吸附，再采用分离膜对浓缩液 进行浓缩;所述吸附操作时需要在浓缩液中加入醋酸、醋酸盐以及枸橼酸盐，配制其吸附环 境中枸橡酸盐浓度为0. lmo 1 /L~0.5mo 1 /L，并调节pH至5.0~6.7;所述的分离膜是截留分子 量在1000~30K的超滤膜。6. 根据权利要求5所述的治疗牛乳房炎的药剂，其特征在于，所述的弱酸型阳离子树脂 是指CM树脂;所述的不溶性Fe3+螯合树脂是指D403螯合树脂。7. 根据权利要求5所述的治疗牛乳房炎的药剂，其特征在于，所述的第3步中，根据权利 要求1所述的从牛乳中提取高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第3步 中，树脂的吸附时间20~120分钟，吸附时搅拌桨转速速率为20~150rpm，吸附温度在3~30 Γ。8. 根据权利要求5所述的治疗牛乳房炎的药剂，其特征在于，所述第1步中，阳离子交换 树脂的制备步骤为： 第1步，取10g氯乙酰化聚苯乙烯-二乙烯基苯微球载体PS-acyl-Cl，加入60ml四氢呋喃 溶胀12 h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比PS-acyl-Cl:乙二胺:碳酸氢钠为1:8:0.7，依 次加入乙二胺和碳酸氢钠，在于80°C下搅拌反应24h，反应结束后，将产物倒入砂芯漏斗中， 用蒸馏水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联EDA微球载体； 第2步，称60g取交联EDA微球载体，置于三颈烧瓶中，加入二甲基甲酰胺溶胀12 h后，加 入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸16g、N-丁氧基甲基丙烯酰胺3g、丙烯酸双环戊烯基酯、 K2C03 5g、四丁基溴化铵12g，搅拌下于一定温度的油浴中回流反应，反应结束后将反应产物 转移至沙芯漏斗中，用5wt%的HC1清洗4遍后用蒸馏水滤洗至中性，最后用甲醇洗滤后抽干， 真空干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。9. 权利要求1-8任一项所述治疗牛乳房炎的药剂在治疗牛乳房炎药物中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述药物被制备为乳腺管注射、肌肉注 射、皮下注射、口服、外喷给药的形式;所述牛乳房炎为急性牛乳房炎或慢性牛乳房炎。
【文档编号】A61K47/02GK105999236SQ201610526444
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】宗学花, 于胜龙, 方雅悯, 孔繁智, 陈新凯, 方存林
【申请人】方雅悯, 方存林