一种与奶牛乳房炎抗性相关的cnv片段及其应用
【专利摘要】本发明涉及分子生物学，具体公开了一种与奶牛乳房炎抗性相关的CNV片段及其应用。所述CNV片段位于中国荷斯坦牛TRAPPC9基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。此处片段为低拷贝数的中国荷斯坦牛的乳房炎抗性显著高于高拷贝数的中国荷斯坦牛。本发明还提供了用于检测所述片段的引物及含有该引物的试剂盒。本发明还提供了所述CNV片段在鉴定乳房炎抗性优势品种中的应用，以及在中国荷斯坦牛分子标记辅助育种中的应用。
【专利说明】
-种与奶牛乳房炎抗性相关的CNV片段及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及分子生物学，具体地说，设及一种与奶牛乳房炎抗性相关的CNV片段。
【背景技术】
[0002] 奶牛乳房炎是奶牛最常见、危害最大的疾病之一，也是影响世界奶牛养殖的主要 疾病之一，全世界每年因该病引起的牛奶生产损失高达380万吨。奶牛乳房炎不仅会影响奶 牛的产奶量，降低原料奶的品质，还会影响奶牛正常生理功能，延长产后发情时间，严重的 会造成奶牛过早淘汰。目前奶牛乳房炎主要采用抗生素等药物进行治疗，然而效果并不理 想而且会造成其它负面影响，因此众多专家学者正在寻求通过其他途径来解决该问题，而 遗传途径被认为是一种降低奶牛乳房炎发病率的长期策略。
[0003] 然而奶牛乳房炎的遗传力较低，仅为0.02-0.04，导致传统的育种方法遗传进展 慢，选择效果不明显。随着分子遗传学、数量遗传学和分子生物学技术的飞速发展，W基因 组选择技术为代表的分子育种技术逐步应用到畜禽育种中去，并产生巨大的影响。拷贝数 变异(Copy Number Variation,CNV)是指与基因组参考序列相比，基因组中大于化b的DNA 片段插入、缺失或扩增及其互相组合衍生出的复杂变异。在模式动物和人类医学研究表明 CNVs与复杂疾病、疾病的易感性等有重要关系。因此，可将CNVs作为一个分子遗传标记应用 于分子育种。
[0004] 分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子遗传标记对育种材料进行 选择，综合改良畜禽重要经济性状。分子育种综合利用了遗传标记信息、系谱信息和个体表 型信息，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。遗传标记是指能够遗传 的、可识别的并能准确反映遗传多态性的生物特征。分子育种为畜禽育种开辟了一条新的 途径，随着分子生物学技术的发展，检测成本的降低，目前分子遗传标记已经应用于畜禽育 种，并取得了巨大的影响。在奶牛育种中，通过选择与奶牛重要经济性状关联显著，且与数 量性状基因座紧密连锁的DNA分子标记，来实现早期选择、加快遗传进展和提高选择准确性 等目标，从而加快育种进程。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与奶牛乳房炎抗性相 关的CNV片段。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0007] 第一方面，本发明首先提供一种与奶牛乳房炎抗性相关的CNV片段，所述CNV片段 的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。该片段位于中国荷斯坦牛TRAPPC9基因，存在拷贝数变 异。
[000引本发明经试验发现，所述片段拷贝数低的中国荷斯坦牛乳房炎抗性显著高于该片 段拷贝数高的中国荷斯坦牛。
[0009]进一步地，本发明提供用于扩增所述CNV片段的引物，所述引物的核巧酸序列如 SEQ ID NO.2-3所示，该引物可W高特异性地扩增目标片段。
[0010]进一步地，本发明提供了含有前述引物的试剂盒。
[00川所述试齐Ij盒还可包括其他常规组分，如SYBR Green Master，d地20等。
[0012] 实际应用中，为了实现对奶牛乳房炎抗性的鉴定或检测，所述试剂盒还包括扩增 内参基因 BTF3基因的引物，W便在检测时通过与内参基因的比较，更好的对结果进行判断。 所述内参基因 BTF3基因的拷贝数稳定，其引物的核巧酸序列如SEQ ID NO.4-5所示，该引物 能够高特异性地扩增BTF3基因。
[0013] 所述内参基因也可W使用已被证明具有稳定拷贝数的基因作为内参基因的。
[0014] 第二方面，本发明提供了前述CNV片段在鉴定乳房炎抗性奶牛品种中的应用。
[0015] 所述应用非疾病的诊断和治疗目的，仅用于鉴定奶牛的乳房炎抗性性状。
[0016] 进一步地，所述应用为利用前述CNV片段的拷贝数变异(拷贝数高低)来鉴定奶牛 乳房炎抗性。
[0017] 具体操作为：W待测样品的基因组DNA为模板，利用前述引物与前述内参基因 BTF3 基因的引物进行巧光定量PCR反应，利用方法计算待测样品CNV片段的拷贝数，所述 CNV片段拷贝数低的奶牛乳房炎抗性显著高于该片段拷贝数高的奶牛，低拷贝数的个体为 乳房炎抗性优势个体。
[0018] 更进一步地，本发明针对巧光定量PCR反应提供优选的扩增体系和反应条件。
[0019] 其中，所述扩增体系为20化:50ngAiL基因组DNA模板化LaOpmol/化正向引物F化 L和反向引物R IiiUSYB Green MasterlOiiUd地2〇 7化。
[0020] 具体而言，扩增CNV时，使用SEQ ID NO.2-3所示的引物，扩增内参基因时，使用SEQ ID NO.4-5所示的引物。
[002。 其中，所述反应条件为:①预变性95°C，IOmin;②扩增反应:95°C变性IOs，60°C退 火 10s，72°C 延伸 103,45个循环;@融解曲线生成:951：53,65°(：1111111，97°(：103;@40°(：冷却。
[0022] 第=方面，本发明提供了前述CNV片段在奶牛辅助育种中的应用。具体为利用巧光 定量PCR方法检测前述CNV片段的拷贝数，根据拷贝数的高低筛选乳房炎抗性优势品种进行 选育。
[0023] 作为优选，所述奶牛为中国荷斯坦牛。
[0024] 本发明的有益效果在于：
[0025] 本发明对中国荷斯坦奶牛的TRAPPC9基因的拷贝数进行检测，并对该基因的拷贝 数与奶牛的乳房炎抗性进行关联分析，通过SAS9.0软件的卡方检验和Excel的T检验分析发 现，乳房炎患病牛TRAPPC9基因的拷贝数显著高于健康牛(P<0.05)，利用SAS9.0软件进行方 差分析也发现TRAPPC9基因的拷贝数显著影响奶牛体细胞评分。该拷贝数变异的检出为中 国荷斯坦奶牛乳房炎抗性的分子标记辅助选择提供了科学依据。
[0026] 本发明提供的CNV片段不受奶牛个体年龄、性别等限制，可用于中国荷斯坦牛的早 期选育，从而大大加快了中国荷斯坦奶牛的育种进程。
【附图说明】
[0027] 图巧TRAPPC9基因拷贝数在所检测中国荷斯坦牛群体中分布。
[002引图2为不同乳房健康状态中国荷斯坦牛TRAPPC9基因拷贝数。
【具体实施方式】
[0029] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是W下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可W对本发明进行各种修改和替换。
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 实施例1与中国荷斯坦奶牛乳房炎抗性相关的CNV标记的检测
[0033] 1.1待测中国荷斯坦奶牛血液DNA提取
[0034] 尾静脉采集待测中国荷斯坦奶牛血液，常溫放置3-4小时待血液凝固，此时血液分 为血清和凝血块两部分，血清呈清亮黄色，凝血块为暗红色，牛血液中只有白细胞内含有 DNA，存在于凝血块中。
[0035] 利用天根血液/细胞/组织基因组DNA样品提取试剂盒从凝血块中提取基因组DNA， 具体步骤如下：
[0036] 用眼科剪剪取0.2-0.3mL的凝血块放入已灭菌的2mL圆底离屯、管中，加入5(K)化的 细胞裂解液化；
[0037] 利用手持匀浆仪将血块充分匀浆，振荡15s，120(K)rpm离屯、Imin,弃去上层暗红色 上清液；
[003引再次加入700iiL细胞裂解液化，充分振荡使下层沉淀散开悬浮，12000rpm离屯、 Imin,弃去上清液；
[0039] 加入20化L缓冲液GS，充分满旋至沉淀充分悬浮；
[0040] 加入20化蛋白酶K和25化L缓冲液GB，充分混匀；
[0041] 将离屯、管用封口膜封好放入到56°C杂交炉中消化3-4小时，为确保充分消化，消化 过程中需要颠倒混匀数次，最终溶液变成清亮透明，简短离屯、；
[0042] 加入20化L冰镇无水乙醇，上下颠倒混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀；
[0043] 将上一步所得溶液转入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12000巧m离屯、30s，弃 去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
[0044] 向吸附柱CB3中加入50化L去蛋白缓冲液GD,静置2min，12000巧m离屯、30s，弃去收 集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
[0045] 向吸附柱CB3中加入700化漂洗液PW，12000rpm离屯、30s，弃去收集管中的废液，将 吸附柱放入收集管中；
[0046] 向吸附柱CB3中加入50化L漂洗液PW，1200化pm离屯、30s，弃去收集管中的废液；
[0047] 将吸附柱放入收集管中，12000rpm离屯、2min，弃去废液，将吸附柱置于室溫放置数 分钟，彻底挥发吸附柱上残余的乙醇；
[004引将吸附柱转入至一个新的离屯、管中，加入10化L 56°C预热的TE缓冲液，室溫放置 5min，12000巧m离屯、2min，基因组DNA则存在于离屯、管中。
[0049] 利用化no化OP2000紫外分光光度计检测基因组DNA提取的质量与浓度，并取出一 部分DNA，稀释到统一的浓度。
[0化0] 1.2引物设计
[0051 ] 采用Primer 3.0和Oligo 6.0软件分别设计目的基因 TRAPPC9和内参就BTF3的巧 光定量PCR引物，对于CNV区段(CNVR)分成上下两段，每段取10肺的序列来筛选合适的引物； 对于基因表达，采取跨越不同外显子的方法进行设计，引物设计过程中遵循W下原则：
[0化2] (1 )PCR扩增片段长度100-200之间；
[0053] (2)引物G/C含量在40-60%之间；
[0化4] (3)引物长度在18-24bp之间，退火溫度(化值)在58-62 r ;
[0055] (4)引物的3'末端尽可能不要WA或T结尾，同时3'端避免发生连续3个碱基相连的 情况，避免发卡结构和引物二聚体；
[0056] (5)尽量避免上下游引物或引物自身出现发卡结构或引物二聚体。
[0057] 对于拷贝数的引物，需要利用UCSC PCR进行引物特异性检测。
[0化引1.3引物检测
[0059] 利用梯度PCR进行引物扩增特异性和退火溫度检测，特异性强的引物目的条带明 亮，没有二聚体和非特异性杂带;对退火溫度不敏感的引物在很大溫度范围内扩增结果变 化不大。
[0060] 利用等倍比稀释而成的标准品进行巧光定量PCR扩增来绘制标准曲线检测引物的 扩增效率，同时结合扩增曲线、融解曲线和融解峰来综合评判引物是否合适。具体步骤如 下：
[0061 ] ①将DNA样品用Nuclease-打ee water按照5倍比稀释4个梯度，即1、1/5、1/25、1/ 125；
[0062] ②W此模板为标准品，对每对引物进行巧光定量PCR反应；
[0063] ③根据仪器的操作说明进行扩增效率的计算、标准曲线和融解曲线的绘制。
[0064] 巧光定量PCR反应体系为:标准品基因组DNA模板化L，1化mol/化正向引物F 1化和 反向引物R化USYB Green MasterlOiiL，cklH2〇化L。反应条件为①预变性95°C，10min;② 扩增反应:95°C变性10sec，60°C退火10sec，72°C延伸10sec，45个循环;③融解曲线生成:95 °C 5sec，65 °C Imin，97 °C IOsec;④ 40 °C 冷却。
[0065] 具体而言，扩增CNV时，使用SEQ ID NO.2-3所示的引物，扩增内参基因时，使用SEQ ID NO.4-5所示的引物。
[0066] 1.4待测样本拷贝数变异检测
[0067] 将稀释到统一浓度的待检测DNA样品分别进行目的基因 TRAPPC9和内参基因 BTF3 的巧光定量PCR反应，每个样本3个重复，反应体系和条件与上一步相同。根据仪器的操作说 明得到CT值，然后利用2-AAet方法计算待测中国荷斯坦牛TRAPPC9基因的拷贝数。
[0068] 1.5上述CNV标记在中国荷斯坦牛乳房炎抗性优势品种选育中的应用
[0069] 该CNV标记可作为分子遗传标记对奶牛直接进行基因选择或者标记辅助选择，从 而加快中国荷斯坦牛乳房炎抗性优势品种的选育。
[0070] 实施例2中国荷斯坦奶牛TRAPPC9基因拷贝数与乳房炎抗性的关联分析与检测应 用
[0071] 按照实施例1的方法，对采自中国北方地区不同养殖场的133头中国荷斯坦牛进行 TRAPPC9基因拷贝数的分析，分析结果如表1、图1所示，TRAPPC9基因拷贝数为4个的个体在 荷斯坦牛群体中频率最高，达36.8%，其次是5个拷贝数的个体，占荷斯坦牛群体的27.8%， 最低的是8个拷贝数的个体，频率仅0.8%。
[0072 ]利用SAS9.0软件ANOVA程序分析TRAPPC9基因的拷贝数与体细胞等级的关联关系， 分析时W个体的体细胞数作为划分标准为:SCC ^ 20万，等级为1; 20万。0：巧0万，等级为2; SCC > 50万，等级为3。W等级作为表型值，采用如下模型：
[0073] y=]i+hys+p+m+邑+e
[0074] 其中，y:观察值，y:群体均值，hys:场年季效应，P:胎次效应，m:泌乳阶段效，g:拷 贝数效应，e:随机残差效应。分析结果如表2所示。
[0075] 表1TRAPPC9基因的拷贝数
[0076]
[0077] 关联分析 [007引
[0079] 表2中的数值表示为最小二乘均值±标准误，表中相同字母表示差异不显著，不同 字母表示差异显著(P<〇. 05)，*表示显著相关(P<0.05)。
[0080] 通过Excel的T检验分析发现，乳房炎患病牛TRAPPC9基因的拷贝数显著高于健康 牛(P<0.05)，结果如图2所示。
[0081 ]由表2、图2可知，TRAPPC9基因的拷贝数对中国荷斯坦牛乳房炎抗性的影响达到显 著水平(P<0.05)。低拷贝数牛乳房炎抗性显著高于高拷贝数的牛。
[0082]实施例3用于扩增本发明所述CNV片段的引物 [00削所述引物包括：
[0084]正向引物Fl: 5 ' -CAAGACTCTGCTGAGATGACG-3 ' ；
[00化]反向引物Rl: 5 ' -CGACCATCACCCAGACTATGC-3 '。
[0086] 实施例4试剂盒
[0087] 所述试剂盒包括：
[00则 1、实施例3所述的引物；
[0089] 2、内参基因 BTF3基因的引物：
[0090] BTF3正向引物F2:5 ' -TCAGGGAGATTACTAAGGGT-3 ' ；
[0091 ] BTF3反向引物R2:5 ' -GAAGCAGAAGTCTAAGCAAC-3 '。
[0092] 3、SYB Green Master:购自ROCHE公司。
[0093] 4、(1地2〇。
[0094] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种与奶牛乳房炎抗性相关的CNV片段，其特征在于，所述CNV片段的核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 所示。2. 用于扩增权利要求1所述CNV片段的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO .2-3所示。3. 含有权利要求2所述引物的试剂盒。4. 权利要求1所述的CNV片段在鉴定乳房炎抗性奶牛品种中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用权利要求1所述CNV片段的拷贝数高低 来鉴定奶牛乳房炎抗性。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，以待测样品的基因组DNA为模板，利用权利 要求2所述引物与内参基因引物进行荧光定量PCR反应，利用2^^方法计算待测样品CNV片 段的拷贝数，所述CNV片段拷贝数低的奶牛乳房炎抗性显著高于该片段拷贝数高的奶牛;所 述内参基因为BTF3基因，内参基因引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR反应的扩增体系为20yL: 50ng/yL基因组DNA模板lyL，10pmol/yL正向引物F lyL和反向引物R lyL，SYB Green Master 10uL，ddH2〇7uL; 荧光定量PCR反应的反应条件为:①预变性95°C，lOmin;②扩增反应:95°C变性10s，60 。(:退火 10s，72°C 延伸 1〇8,45个循环;@融解曲线生成：951€58,65°(：1111丨11，97°(：1〇8 ;@4〇1€ 冷却。8. 权利要求1所述的CNV片段在奶牛辅助育种中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，利用荧光定量PCR方法检测权利要求1所述 CNV片段的拷贝数，根据拷贝数的高低筛选乳房炎抗性优势品种进行选育。10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述奶牛为中国荷斯坦牛。
【文档编号】C12N15/11GK105861657SQ201610221988
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】俞英, 董易春, 王晓
【申请人】中国农业大学