厚朴提取物在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用图
厚朴提取物在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属天然化合物的用途，具体涉及从植物提取的厚朴酚与和厚朴酚的一种新 的药理用途，尤其是在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 奶牛乳房炎（Mastitis)由金黄色葡萄球菌和链球菌引起，是奶牛乳房伴有物理、 化学、微生物学的一种炎性变化，多发生于产后哺乳期，是奶牛场危害最大、最常见、经济损 失最严重的疾病之一。据报道，在法国、芬兰、瑞典、丹麦和英国，奶牛乳房炎的发病率分别 为20 %、10. 9%、11. 1 %、21 %、22 %，世界每年临床乳房炎发病率可达50 %，芬兰、挪威、瑞 典每年因乳房炎问题而淘汰的奶牛分别占淘汰奶牛的35%、19%、22%。目前我国临床型奶 牛乳房炎的发病率在30 %左右，其中隐形乳房炎占50-70 %，个别牛群发病率甚至更高。因 此造成每年产奶量减少约15%。每头牛每年损失1000元左右，全国奶牛每年因乳房炎造 成的损失达100多亿元。除了经济损失外，奶牛乳房炎对公众健康的重要影响也不容忽视。 乳房炎是乳和乳制品中有害细菌的主要来源，对人类造成的健康危害无法估计。因此奶牛 乳房炎的预防和治疗具有重要的经济意义和公共卫生学意义。
[0003] 厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd. et Eils、凹叶厚朴 Magnolia officinalis Rehd.et Eils.Var.biloba Rehd.et Wils.的干皮、根皮及枝皮。 厚朴味苦、辛，性温。归脾、胃、肺、大肠经。具有燥湿消痰、下气除满等功能。用于湿滞伤中、 脘痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘、痰饮喘咳。因此厚朴历代以来均用于治疗消化系统疾病。
[0004] 厚朴提取物的活性成分研究主要侧重于木质素类化合物和生物碱类化合物。厚朴 酚、和厚朴酚为厚朴中的主要有效成分，以往的研究表明其具有肌肉松弛、抗焦虑和中枢抑 制、抗菌抗炎活性、抗心律失常、抗氧化、抗肿瘤等多种活性。迄今为止，尚未见有关厚朴提 取物预防和治疗奶牛乳房炎的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了厚朴提取物用于制备预防或治疗奶牛乳房炎的药物中的用途，尤其 是厚朴酚、和厚朴酚或其混合物或其药学可接受的盐或其衍生物用于制备预防或治疗奶牛 乳房炎的药物中的用途。
[0006] 本发明所述的化合物厚朴酚英文名为magnolol，CAS号为528-43-8,分子量为 266.334320，化学名为5,5'-(11&1171-2-卩1'〇卩61171-[1，1'-131卩1161171]-2,2'-(1;[01，分子 式为 C1SH1S02。
[0007] 本发明所述的化合物和厚朴酚英文名为honokiol，CAS号为35354-74-6,分子量 为266.33432,化学名为：3,5' -diallyl-2-propenyl-[l，l' -biphenyl]_2,4' -diol，分 子式为C1SH1S02。
[0008] 厚朴酚与和厚朴酚治疗奶牛乳房炎的机理在于其具有良好的抗炎抑菌作用。
[0009] 本发明首先测定了厚朴提取物体外对奶牛乳腺炎病原菌的抑制效果，实验结果表 明，不同浓度的厚朴提取物、厚朴酚与和厚朴酚均对奶牛乳腺炎病原菌有显著的抑制作用， 随着浓度的提高，对奶牛乳腺炎的病原菌的抑制作用也随之增强。
[0010] 在体外抑菌实验的基础上，本发明进行了对小鼠乳腺炎模型上观察了厚朴酚与和 厚朴酚的抗炎效果，通过金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌诱导得到小鼠乳腺炎模型，观察厚 朴酚与和厚朴酚对小鼠乳腺炎的治疗作用，实验结果表明，所述的厚朴酚与厚朴酚及其混 合物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌诱导的小鼠乳腺炎模型有确实的抑菌、抗炎效果。
[0011] 本发明还开展了厚朴提取物对临床奶牛乳房炎的治疗效果实验，研究发现，厚朴 提取物临床奶牛乳房炎具有很好的治疗效果，有效率大于80%。
[0012] 本发明所采用厚朴酚、和厚朴酚根据现有技术从植物提取或化学合成，制备的药 物可含有其他治疗奶牛乳房炎的药物，以及药物赋形剂或载体。本发明所述的厚朴酚、和厚 朴酚与制剂允许的药物赋形剂和载体按本制剂领域已知方法制成口服或注射给药的剂型。 制成的制剂形式包括散剂、片剂、丸剂、颗粒剂、软膏剂、流浸膏剂、合剂、灌注剂或注射剂。 口服制剂包括缓释剂。制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。
[0013] 本发明的有益效果是：
[0014] 本发明提出了厚朴酚、和厚朴酚及其组合物的新用途；厚朴酚与和厚朴酚毒性低， 对于奶牛正常细胞几乎无毒，是一种潜在的高效、低毒、无残留、无弃奶期的治疗奶牛乳腺 炎药物。因此，厚朴酚、和厚朴酚及其组合物具有很好的临床治疗奶牛乳腺炎的应用前景。
【具体实施方式】
[0015] 以下通过实施例对本发明做进一步的说明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
[0016] 实施例1厚朴提取物的制备
[0017] 以厚朴药材为原料，将厚朴药材粉碎，在55°C -60°C条件下，以6倍厚朴粗粉重量 的正己烷浸提，提取3次，每次浸提2h，过滤，将3次滤液合并减压浓缩成浸膏。将膏体重量 25%的硅胶加入浸膏中搅拌均匀后在真空干燥，加入真空干燥粉重量5倍的环己烷于80°C 水浴提取，提取3次，每次30min，将环己烷提取液浓缩至原体积的1/5,抽滤得粗结晶，将粗 结晶晾干去除残存环己烷，再加入粗结晶重量40倍的石油醚，于70°C水浴上加热至上清液 澄清透明，倾出上清液，放冷析出结晶，真空干燥，得到高纯的厚朴提取物，经测定，提取物 中厚朴总酚的含量为98. 6%，其中，厚朴酚的含量为51. 2%，和厚朴酚的含量为47. 4%。
[0018] 实施例2厚朴酚与和厚朴酚的分离
[0019] 按照专利《一种自厚朴粗提取物中提取和厚朴酚与厚朴酚的方法》（专利申请公 布号：CN 103922899A)的方法分离实施例1中的厚朴提取物中的厚朴酚及和厚朴酚。具体 方法如下：取实施例1中的厚朴提取物lkg，加环己烷10L，于100L反应釜中80°C加热回流 3h ;另取纯化水100kg置敞口锅中加入至80°C，加入氢氧化钠90g、碳酸氢钠210g，搅拌使 充分溶解成PH10. 5的缓冲液。开启反应釜搅拌机，边搅拌边加入50kg缓冲液，再搅拌15min 后，静置，分层。同法操作，共萃取五次，取残留液点样检测无厚朴酚斑点，取纯化水配制1 % 氢氧化钠溶液，萃取二次即可。将下层缓冲液层加入4M盐酸（每1L缓冲液加入10ml4M盐 酸），使pH值在3左右，充分搅拌后静置析晶，既得厚朴酚粗晶；将下层氢氧化钠溶液加入 4M盐酸（每1L氢氧化钠溶液加入70ml 4M盐酸），使pH值在2-3左右，充分搅拌后静置析 晶，既得和厚朴酚粗晶。将厚朴酚粗晶加入4L石油醚（60-90°C)于80°C水浴回流溶解，可 看到下层有部分油层和污物，趁热将上层干净石油醚倾入结晶皿中，冷置析晶，晶体以80°C 干燥，得厚朴酚纯品，含量为99. 23% ;将厚朴酚粗晶加入4L石油醚（60-90°C )于80°C水 浴回流溶解，析出下层油层，趁热将上层干净石油醚倾入结晶皿中，冷置析晶，晶体以65°C 干燥，得和厚朴酚纯品，含量为98. 83%。
[0020] 实施例3厚朴提取物乳剂的制备
[0021] 称取实施例1中的厚朴提取物5g、丙二醇10g，大豆油30g、维生素 E 0.0 lg，在水 浴超声条件下不断搅拌l〇min溶解，得油相；称取大豆卵磷脂2g，加入注射用水适量，在水 浴下搅拌溶解得到水相；在70°C搅拌的条件下，将油相缓慢注入水相中，加入注射用水定 容至100mL，得初乳。然后将初乳过胶体磨20min，最后分装、充氮气，121°C灭菌15min，既 得。
[0022] 实施例4厚朴酚与和厚朴酚对奶牛乳腺炎主要致病菌的体外抑菌实验
[0023] 药液准备：分别将厚朴酚、和厚朴酚以及厚朴提取物用20%的二甲基亚砜溶液稀 释成浓度为6. 4mg/mL药液备用。
[0024] 菌株准备：（1)标准菌株：大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 35218)、金黄色葡 萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923)、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae CVCC1886)购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。（2)受试菌株：分离于包头、吉林地区 的不同规模化奶牛场，并经过16SrDNA系列分析鉴定的6株奶牛乳腺炎病原菌（见表1)。
[0025] 体外抑菌试验：采用琼脂平板二倍稀释法测定厚朴提取物对奶牛乳腺炎病原菌和 质控菌的体外抑菌活性。
[0026] 含药平板的制备：采用倍比稀释法用无菌水对受试药进行倍比稀释，分别将厚朴 酚、和厚朴酚药液稀释成1:2、1:4、1:8、1:16、1 :32、1 :64、1 :128、1 :256共8个梯度，在一 次性无菌培养皿中分别加入不同浓度梯度的稀释药液lml和19ml灭菌的MH培养基，培养 基中厚朴酚、和厚朴酚以及厚朴总酚（厚朴酚与和厚朴酚的含量之和）的实际浓度分别为 160 μ g/mL、80 μ g/mL、40 μ g/mL、20 μ g/mL、10 μ g/mL、5 μ g/mL、2. 5 μ g/mL、L 25 μ g/mL〇 充 分混匀，烘干后备用。以平板内加入lml 20%的二甲基亚砜代替药物制备阳性对照平板。
[0027] 菌液配置：各种菌种经复壮、重新划板分离单个菌落，接种到2ml适宜的培养基 中，于37°C培养12h。以平板计数法进行细菌计数，用相应的培养基稀释使菌液最终浓度为 lX106CFU/mL〇
[0028] 体外抑菌活性测定：采用多点接种仪将受试菌株的菌液5 μ L加入不同浓度梯度 的含药平板和阳性对照平板，并以5 μ L生理盐水代替菌液作阴性对照。37°C恒温培养18~ 24h后观察各菌株在不同浓度梯度及不同药物中的生长情况。
[0029] 结果判定：在阴性和阳性对照成立的条件下，以平板内无细菌生长的药物最小浓 度为此药对该菌株的最低抑菌浓度（MIC)。
[0030] 表1实验菌株的种类及数量
[0031]
[0032] 实验结果见表2。结果表明，厚朴提取物的主成分厚朴酚与和厚朴酚均对奶牛乳腺 病原菌具有良好的抑制作用。
[0033] 表2厚朴酚、和厚朴酚对奶牛乳腺炎病原菌的最小抑菌浓度（μ g/mL)
[0034]
[0035] 实施例5厚朴提取物对奶牛乳腺炎主要致病菌的体内抑菌实验
[0036] 试验菌株：实
【技术领域】
[0001] 本发明属天然化合物的用途，具体涉及从植物提取的厚朴酚与和厚朴酚的一种新 的药理用途，尤其是在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 奶牛乳房炎（Mastitis)由金黄色葡萄球菌和链球菌引起，是奶牛乳房伴有物理、 化学、微生物学的一种炎性变化，多发生于产后哺乳期，是奶牛场危害最大、最常见、经济损 失最严重的疾病之一。据报道，在法国、芬兰、瑞典、丹麦和英国，奶牛乳房炎的发病率分别 为20 %、10. 9%、11. 1 %、21 %、22 %，世界每年临床乳房炎发病率可达50 %，芬兰、挪威、瑞 典每年因乳房炎问题而淘汰的奶牛分别占淘汰奶牛的35%、19%、22%。目前我国临床型奶 牛乳房炎的发病率在30 %左右，其中隐形乳房炎占50-70 %，个别牛群发病率甚至更高。因 此造成每年产奶量减少约15%。每头牛每年损失1000元左右，全国奶牛每年因乳房炎造 成的损失达100多亿元。除了经济损失外，奶牛乳房炎对公众健康的重要影响也不容忽视。 乳房炎是乳和乳制品中有害细菌的主要来源，对人类造成的健康危害无法估计。因此奶牛 乳房炎的预防和治疗具有重要的经济意义和公共卫生学意义。
[0003] 厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd. et Eils、凹叶厚朴 Magnolia officinalis Rehd.et Eils.Var.biloba Rehd.et Wils.的干皮、根皮及枝皮。 厚朴味苦、辛，性温。归脾、胃、肺、大肠经。具有燥湿消痰、下气除满等功能。用于湿滞伤中、 脘痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘、痰饮喘咳。因此厚朴历代以来均用于治疗消化系统疾病。
[0004] 厚朴提取物的活性成分研究主要侧重于木质素类化合物和生物碱类化合物。厚朴 酚、和厚朴酚为厚朴中的主要有效成分，以往的研究表明其具有肌肉松弛、抗焦虑和中枢抑 制、抗菌抗炎活性、抗心律失常、抗氧化、抗肿瘤等多种活性。迄今为止，尚未见有关厚朴提 取物预防和治疗奶牛乳房炎的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了厚朴提取物用于制备预防或治疗奶牛乳房炎的药物中的用途，尤其 是厚朴酚、和厚朴酚或其混合物或其药学可接受的盐或其衍生物用于制备预防或治疗奶牛 乳房炎的药物中的用途。
[0006] 本发明所述的化合物厚朴酚英文名为magnolol，CAS号为528-43-8,分子量为 266.334320，化学名为5,5'-(11&1171-2-卩1'〇卩61171-[1，1'-131卩1161171]-2,2'-(1;[01，分子 式为 C1SH1S02。
[0007] 本发明所述的化合物和厚朴酚英文名为honokiol，CAS号为35354-74-6,分子量 为266.33432,化学名为：3,5' -diallyl-2-propenyl-[l，l' -biphenyl]_2,4' -diol，分 子式为C1SH1S02。
[0008] 厚朴酚与和厚朴酚治疗奶牛乳房炎的机理在于其具有良好的抗炎抑菌作用。
[0009] 本发明首先测定了厚朴提取物体外对奶牛乳腺炎病原菌的抑制效果，实验结果表 明，不同浓度的厚朴提取物、厚朴酚与和厚朴酚均对奶牛乳腺炎病原菌有显著的抑制作用， 随着浓度的提高，对奶牛乳腺炎的病原菌的抑制作用也随之增强。
[0010] 在体外抑菌实验的基础上，本发明进行了对小鼠乳腺炎模型上观察了厚朴酚与和 厚朴酚的抗炎效果，通过金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌诱导得到小鼠乳腺炎模型，观察厚 朴酚与和厚朴酚对小鼠乳腺炎的治疗作用，实验结果表明，所述的厚朴酚与厚朴酚及其混 合物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌诱导的小鼠乳腺炎模型有确实的抑菌、抗炎效果。
[0011] 本发明还开展了厚朴提取物对临床奶牛乳房炎的治疗效果实验，研究发现，厚朴 提取物临床奶牛乳房炎具有很好的治疗效果，有效率大于80%。
[0012] 本发明所采用厚朴酚、和厚朴酚根据现有技术从植物提取或化学合成，制备的药 物可含有其他治疗奶牛乳房炎的药物，以及药物赋形剂或载体。本发明所述的厚朴酚、和厚 朴酚与制剂允许的药物赋形剂和载体按本制剂领域已知方法制成口服或注射给药的剂型。 制成的制剂形式包括散剂、片剂、丸剂、颗粒剂、软膏剂、流浸膏剂、合剂、灌注剂或注射剂。 口服制剂包括缓释剂。制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。
[0013] 本发明的有益效果是：
[0014] 本发明提出了厚朴酚、和厚朴酚及其组合物的新用途；厚朴酚与和厚朴酚毒性低， 对于奶牛正常细胞几乎无毒，是一种潜在的高效、低毒、无残留、无弃奶期的治疗奶牛乳腺 炎药物。因此，厚朴酚、和厚朴酚及其组合物具有很好的临床治疗奶牛乳腺炎的应用前景。
【具体实施方式】
[0015] 以下通过实施例对本发明做进一步的说明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
[0016] 实施例1厚朴提取物的制备
[0017] 以厚朴药材为原料，将厚朴药材粉碎，在55°C -60°C条件下，以6倍厚朴粗粉重量 的正己烷浸提，提取3次，每次浸提2h，过滤，将3次滤液合并减压浓缩成浸膏。将膏体重量 25%的硅胶加入浸膏中搅拌均匀后在真空干燥，加入真空干燥粉重量5倍的环己烷于80°C 水浴提取，提取3次，每次30min，将环己烷提取液浓缩至原体积的1/5,抽滤得粗结晶，将粗 结晶晾干去除残存环己烷，再加入粗结晶重量40倍的石油醚，于70°C水浴上加热至上清液 澄清透明，倾出上清液，放冷析出结晶，真空干燥，得到高纯的厚朴提取物，经测定，提取物 中厚朴总酚的含量为98. 6%，其中，厚朴酚的含量为51. 2%，和厚朴酚的含量为47. 4%。
[0018] 实施例2厚朴酚与和厚朴酚的分离
[0019] 按照专利《一种自厚朴粗提取物中提取和厚朴酚与厚朴酚的方法》（专利申请公 布号：CN 103922899A)的方法分离实施例1中的厚朴提取物中的厚朴酚及和厚朴酚。具体 方法如下：取实施例1中的厚朴提取物lkg，加环己烷10L，于100L反应釜中80°C加热回流 3h ;另取纯化水100kg置敞口锅中加入至80°C，加入氢氧化钠90g、碳酸氢钠210g，搅拌使 充分溶解成PH10. 5的缓冲液。开启反应釜搅拌机，边搅拌边加入50kg缓冲液，再搅拌15min 后，静置，分层。同法操作，共萃取五次，取残留液点样检测无厚朴酚斑点，取纯化水配制1 % 氢氧化钠溶液，萃取二次即可。将下层缓冲液层加入4M盐酸（每1L缓冲液加入10ml4M盐 酸），使pH值在3左右，充分搅拌后静置析晶，既得厚朴酚粗晶；将下层氢氧化钠溶液加入 4M盐酸（每1L氢氧化钠溶液加入70ml 4M盐酸），使pH值在2-3左右，充分搅拌后静置析 晶，既得和厚朴酚粗晶。将厚朴酚粗晶加入4L石油醚（60-90°C)于80°C水浴回流溶解，可 看到下层有部分油层和污物，趁热将上层干净石油醚倾入结晶皿中，冷置析晶，晶体以80°C 干燥，得厚朴酚纯品，含量为99. 23% ;将厚朴酚粗晶加入4L石油醚（60-90°C )于80°C水 浴回流溶解，析出下层油层，趁热将上层干净石油醚倾入结晶皿中，冷置析晶，晶体以65°C 干燥，得和厚朴酚纯品，含量为98. 83%。
[0020] 实施例3厚朴提取物乳剂的制备
[0021] 称取实施例1中的厚朴提取物5g、丙二醇10g，大豆油30g、维生素 E 0.0 lg，在水 浴超声条件下不断搅拌l〇min溶解，得油相；称取大豆卵磷脂2g，加入注射用水适量，在水 浴下搅拌溶解得到水相；在70°C搅拌的条件下，将油相缓慢注入水相中，加入注射用水定 容至100mL，得初乳。然后将初乳过胶体磨20min，最后分装、充氮气，121°C灭菌15min，既 得。
[0022] 实施例4厚朴酚与和厚朴酚对奶牛乳腺炎主要致病菌的体外抑菌实验
[0023] 药液准备：分别将厚朴酚、和厚朴酚以及厚朴提取物用20%的二甲基亚砜溶液稀 释成浓度为6. 4mg/mL药液备用。
[0024] 菌株准备：（1)标准菌株：大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 35218)、金黄色葡 萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923)、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae CVCC1886)购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。（2)受试菌株：分离于包头、吉林地区 的不同规模化奶牛场，并经过16SrDNA系列分析鉴定的6株奶牛乳腺炎病原菌（见表1)。
[0025] 体外抑菌试验：采用琼脂平板二倍稀释法测定厚朴提取物对奶牛乳腺炎病原菌和 质控菌的体外抑菌活性。
[0026] 含药平板的制备：采用倍比稀释法用无菌水对受试药进行倍比稀释，分别将厚朴 酚、和厚朴酚药液稀释成1:2、1:4、1:8、1:16、1 :32、1 :64、1 :128、1 :256共8个梯度，在一 次性无菌培养皿中分别加入不同浓度梯度的稀释药液lml和19ml灭菌的MH培养基，培养 基中厚朴酚、和厚朴酚以及厚朴总酚（厚朴酚与和厚朴酚的含量之和）的实际浓度分别为 160 μ g/mL、80 μ g/mL、40 μ g/mL、20 μ g/mL、10 μ g/mL、5 μ g/mL、2. 5 μ g/mL、L 25 μ g/mL〇 充 分混匀，烘干后备用。以平板内加入lml 20%的二甲基亚砜代替药物制备阳性对照平板。
[0027] 菌液配置：各种菌种经复壮、重新划板分离单个菌落，接种到2ml适宜的培养基 中，于37°C培养12h。以平板计数法进行细菌计数，用相应的培养基稀释使菌液最终浓度为 lX106CFU/mL〇
[0028] 体外抑菌活性测定：采用多点接种仪将受试菌株的菌液5 μ L加入不同浓度梯度 的含药平板和阳性对照平板，并以5 μ L生理盐水代替菌液作阴性对照。37°C恒温培养18~ 24h后观察各菌株在不同浓度梯度及不同药物中的生长情况。
[0029] 结果判定：在阴性和阳性对照成立的条件下，以平板内无细菌生长的药物最小浓 度为此药对该菌株的最低抑菌浓度（MIC)。
[0030] 表1实验菌株的种类及数量
[0031]
[0032] 实验结果见表2。结果表明，厚朴提取物的主成分厚朴酚与和厚朴酚均对奶牛乳腺 病原菌具有良好的抑制作用。
[0033] 表2厚朴酚、和厚朴酚对奶牛乳腺炎病原菌的最小抑菌浓度（μ g/mL)
[0034]
[0035] 实施例5厚朴提取物对奶牛乳腺炎主要致病菌的体内抑菌实验
[0036] 试验菌株：实
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0186732... 来自[中国] 2020年05月22日 16:12我们厚朴提取物，做得非常好， 可以联系我：13548561509
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