厚朴提取物在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用图_2

施例3中从市场上分离的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌各一株。
[0037] 实验动物：昆明小鼠，SPF级别，雌雄各半，体重（20±2)g，天津实验动物中心购 买。
[0038] 试验菌株毒力的测定：37°C恒温培养受试的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌至对数 期，采用2倍稀释法用生理盐水分别对其进行稀释，配置成不同浓度梯度的菌液。取不同浓 度梯度的菌液1份，按0. 5ml/18g体重的菌液量腹腔注射SPF小鼠，并以无菌生理盐水做对 照。在对照小鼠不死亡的前提下，记录小鼠24~48h内的死亡率，测定SPF小鼠全部死亡 的最低细菌量（稀释度），即该菌液的最小致死量（MLD)。
[0039] 实施例1中制得的厚朴提取物的体内有效剂量预试实验：采用二倍稀释法对厚朴 提取物70%乙醇溶液进行稀释，设置6个不同剂量组对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌所引 起的感染模型小鼠进行肌内注射，其中每组4只小鼠，1次/d，连续给药6d，并在第6d进行 攻毒，观察动物14d内的死亡情况，以动物100%存活的最小剂量确定为正式试验的高剂 量，其尚剂量的1/2和1/4分别为正式试验的中剂量和低剂量。
[0040] 体内抗菌活性实验：取（20±2)g SPF级昆明小鼠，雌雄各半，每组10只。分别为正 常组（既不给药也不攻毒）、模型对照组（以生理盐水代替厚朴提取物）、硫酸庆大霉素组 (以10mg/kg硫酸庆大霉素代替厚朴提取物）、厚朴提取物低浓度组、中浓度组、高浓度组。 各组小鼠每天灌胃一次，连续给药6d，正常对照组和模式对照组给予等量的生理盐水，在第 6d给药的同时进行攻毒，即分别金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌最小致死菌液量进行小鼠腹 腔注射。定时观察7d内动物的生存数。
[0041] 实验结果：预实验结果表明，金黄色葡萄球菌对SPF小鼠的MLD为6X 10sCFU/kg， 大肠埃希菌对SPF小鼠的MLD为1. 5 X 107CFU/kg。厚朴提取物在0. 12g/kg时对金葡菌和 大肠埃希菌耐药菌感染模型小鼠保护率达100 %，采用二倍稀释法原理，确定厚朴提取物体 内抗菌试验的高、中、低剂量分别为120mg/kg、60mg/kg、30mg/kg。厚朴提取物对金黄色葡萄 球菌和大肠杆菌感染模型小鼠的体内保护作用见下表：
[0042] 表3厚朴提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染模型小鼠的体内保护
[0043]
[0044] 由上表可知，厚朴提取物高、中、低剂量对分别由金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌诱 导的感染模型小鼠均由不同程度的保护力，且呈现剂量关系。
[0045] 实施例6厚朴酚与和厚朴酚对小鼠乳腺炎模型的保护作用
[0046] 动物模型的建立与分组：分娩后7d出产、泌乳母鼠，腹腔注射乌拉坦麻醉后，仰卧 于体视显微镜下，对腹部乳腺及其周围皮肤进行75%酒精消毒。充分暴露乳头，用无菌眼科 剪剪去乳头尖端约1_左右，露出乳导管。使用微量注射器通过乳导管灌注金黄色葡萄球 菌菌，每个乳腺注射100 μ L菌重悬液，以制造乳腺炎模型。金黄色葡萄球菌菌液为经50mL 培养基重选后用PBS洗涤并重悬在1000 μ LPBS中，浓度达到2 X 10SCFU/ μ L。治疗组用厚朴 提取物治疗，将厚朴提取物溶于丙二醇中，在乳腺感染24小时后，分别于第6、12、18和24h 分四次进行腹腔注射。实验分组情况如下：
[0047] a细菌接种组：金黄色葡萄球菌菌感染的小鼠乳腺炎模型，不给予任何治疗。
[0048] b厚朴提取物给药组：金黄色葡萄球菌菌感染的小鼠乳腺炎模型，并分别以20mg/ kg体重的剂量对小鼠进行腹腔注射。.
[0049] c对照组：小鼠未做任何处理。
[0050] 受试乳区眼观病变：肉眼观察各组母鼠受试乳区的变化。主要对乳腺大小、性状， 乳腺的颜色变化，乳腺组织有无出血点、出血斑，是否有坏死病灶等进行观察。
[0051] 乳腺组织中细胞因子测定：将母鼠整个右侧乳腺组织与PBS按照l:9(w/v，g/mL) 加到玻璃组织匀浆器中进行匀浆，充分匀浆后将匀浆液转移到干净离心管中2000g，4°C离 心40min，除去上层脂肪，将上清液转移到新的离心管中2000g，4°C离心20min，弃去剩余的 脂肪，收集上清液转移到新的离心管中。通过小鼠 TNF-α、IL-Ιβ和IL-6ELISA试剂盒检 测乳腺组织中TNF-a、IL-1 β和IL-6的含量。
[0052] 实验结果：经注入金黄色葡萄球菌菌液24h之后，乳腺组织出现明显的发红、月中 胀、充血等炎症变化，而空白对照组则没有发现任何肉眼可见的病理变化。与细菌接种组相 比，厚朴提取物给药组可以减轻这些眼观的病理变化。
[0053] 经注入金黄色葡萄球菌菌液24h之后，三种细胞因子与对照组相比显著上升，而 厚朴提取物给药组3种细胞因子显著低于细菌接种组（见表4)。在诱发乳腺炎的细菌接种 组中，炎性细胞因子TNF-a、IL_li3和IL-6显著升高，这些细胞因子可以启动、放大及延续 炎症反应，可对机体造成严重损伤。这些因子能够在动物机体内形成网络，相互调节并控制 乳腺炎症的发生和转归。另外，TNF-a能够调节中性粒细胞的活性和渗出，刺激血管内皮 细胞，上调细胞黏附分子的表达，促进氧化自由基的分泌，造成乳腺组织的损伤。IL-Ιβ和 IL-6也能调节内皮细胞黏附分子的表达和中性粒细胞的趋化性，控制中性粒细胞向乳腺组 织的聚集。本实验结果表明厚朴提取物可以显著抑制乳腺组织中TNF-a、IL_li3和IL-6的 产生，说明厚朴提取物可能通过抑制炎性细胞因子的产生而对小鼠乳腺炎起到保护作用。
[0054] 表4厚朴提取物对乳腺组织中TNF- a、IL-1 β和IL-6的影响
[0055]
[0056] 实施例7厚朴酚与和厚朴酚的制剂对奶牛乳腺炎的治疗效果
[0057] 试验药物：实施例3制得的厚朴提取物的乳剂。
[0058] 临床试验1 :某乳牛场饲养的200头中60头重症奶牛，临床症状：奶牛乳汁呈淡 黄色水样或带红色水样，同时出现不同程度的全身症状，如食欲减退或废绝，体温高至41°C 以上，呼吸和心跳加快，精神萎靡，遂用实施例3制得的乳剂治疗，按每头每次肌肉注射 20-30mL，每天给药2次，连续用药5天后采集乳汁检测鉴定疗效。结果证明本药物的有效 率为81. 7% (49/60)，表明本药物对重症乳房炎有治疗作用。
[0059] 临床试验2 :自某大型奶牛场选取体况相近，患有乳房炎的奶牛36头（体重350kg 左右），随机分成三组，即对照组、厚朴提取物组和西药组（灌注乳酸环丙沙星，每lOOmL含 0. 2g环丙沙星）。给药组按照每天20mL/头的剂量乳房灌注两次，连续用药5天。
[0060] 临床观察：每天灌注药物前对奶牛进行感官和LMT检测。感官检测主要表现为乳 房和乳汁均有肉眼可见的异常。乳区肿胀、皮肤发红，触诊乳房发热、有硬块、疼痛敏感，产 奶量减少，乳汁异常，黄白色或血清样，内有凝乳块；经细菌学检测链球菌、金黄色葡萄球菌 或大肠杆菌阳性。
[0061] 疗效评价标准：
[0062] 治愈：病牛精神食欲恢复正常，乳区红、肿、热、痛等症状消除；泌乳量和乳色恢复 正常，用中国农业科研中兽医研究所药厂生产的兰州隐性乳房炎诊断液试剂（LMT)检测呈 阴性，停药观察7天以上无复发现象，细菌性检查阴性。
[0063] 有效：病牛精神食欲恢复正常，乳区红、肿、热、痛等症状明显好转；乳色和泌乳量 正常，LMT检测仍为阳性，细菌性检查阳性。
[0064] 无效：病牛精神食欲状态未见恢复，乳区红、肿、热、痛等症状未见好转甚至更加恶 化；泌乳量下降甚至停奶，乳汁性状仍明显异常。
[0065] 表5LMT法的结果判定标准
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[0067] 表6三组奶牛灌注药物后的实验结果
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[0069] 实验结果见表5。从表中可以看出，厚朴总酚灌注液组和西药组对治疗奶牛乳房炎 的有效率基本一致，但是使用西药治疗奶牛乳房炎容易产生耐药性和药物残留而造成奶质 下降，运用中药治疗不易产生耐药性，没有滞奶期，可以使奶农及奶牛养殖企业获得较好的 经济效益。
【主权项】
1. 厚朴提取物在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用途，其特征在于所述厚朴提取物为厚 朴酚、和厚朴酚、厚朴酚与和厚朴酚的混合物、或其药学可接受的盐或其衍生物用于制备预 防或治疗奶牛乳房炎的药物中的用途。2. 根据权利要求1所述的厚朴提取物在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用途，其特征在 于所述的化合物厚朴酚英文名为magnolol，CAS号为528-43-8,分子量为266. 33432,化学 名为 5,5' -diallyl-2-propenyl-[l，l' -biphenyl]_2,2' -diol，分子式为 C1SH1S02〇3. 根据权利要求1所述的厚朴提取物在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用途，其特征在 于所述的化合物和厚朴酚英文名为honokiol，CAS号为35354-74-6,分子量为266. 33432， 化学名为：3, 5 ' -diallyl-2-propenyl-[l, 1 ' -biphenyl]_2, 4 ' -diol，分子式为 〇18氏8〇2。4. 根据权利要求1-3任一所述的厚朴提取物在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用途，其 特征在于所述厚朴酚、和厚朴酚根据现有技术从植物提取或化学合成，制备的药物可含有 其他治疗奶牛乳房炎的药物，以及药物赋形剂或载体。5. 根据权利要求1-3任一所述的厚朴提取物在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用途，其 特征在于所述的厚朴酚、和厚朴酚与制剂允许的药物赋形剂和载体按本制剂领域已知方法 制成口服、注射给药的剂型，制剂形式为散剂、片剂、丸剂、颗粒剂、软膏剂、流浸膏剂、合剂、 灌注剂、注射剂，制剂的给药形式为口服给药、注射给药。
【专利摘要】本发明公开了厚朴提取物在制备治疗奶牛乳房炎药物中的用途，尤其是厚朴酚、和厚朴酚或其混合物或其药学可接受的盐或其衍生物用于制备预防或治疗奶牛乳房炎的药物中的用途。本发明通过体外对奶牛乳房炎主要病原菌抗菌实验、体内对小鼠乳房炎的治疗实验以及厚朴提取物对临床奶牛乳房炎的治疗效果实验的研究发现，厚朴提取物对奶牛乳房炎主要致病菌具有显著的抑制作用，对小鼠乳房炎具有很好的治疗效果，具有良好的预防或治疗奶牛乳房炎的能力。
【IPC分类】A61K31/05, A61K36/575, A61P15/14
【公开号】CN105726631
【申请号】CN201410756252
【发明人】谢玲玲, 李旭东, 刘爱玲
【申请人】瑞普（天津）生物药业有限公司
【公开日】2016年7月6日
【申请日】2014年12月10日