一种水产迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗，其中包括海藻酸钙?壳聚糖释控微胶囊以及包封于所述微胶囊中与黄芪多糖混合的迟钝爱德华氏菌甘油醛?3?磷酸脱氢酶、外膜蛋白及鞭毛蛋白3种重组蛋白?脂多糖偶联物。口服微胶囊的包封率为78％，蛋白载量为102mg/g，粒径为150±10μm。本发明所制备的口服微胶囊疫苗使用方便，粒径合适，具有良好的缓释性和抗原保护性，且能有效刺激鱼体肠道免疫系统产生免疫应答，使鱼体获得对迟钝爱德华氏菌的特异性免疫保护力，可用于鱼类迟钝爱德华氏菌病的防治。CGMCC No.1127020150824
【专利说明】
-种水产迟钟爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗
技术领域
[0001] 本发明属于水产养殖疫苗技术领域，具体设及一种水产迟纯爱德华氏菌亚单位口 服微胶囊疫苗。
【背景技术】
[0002] 近年来随着水产养殖业的快速发展，水产养殖动物病害问题也日益突出，其中细 菌性疾病已在世界范围内对渔业经济造成了巨大的损失。迟纯爱德华氏菌化dwardsiella tarda)是一种水产动物重要的致病菌，可W感染包括淡水与海水养殖的多种鱼类，并能在 短期内引起大量死亡，给我国水产养殖业带来了巨大经济损失。疫苗的使用可提高养殖鱼 类特异性免疫水平，使鱼体产生抵抗特定病原微生物感染的免疫力，不污染环境，无药物残 留等问题，是今后鱼类疾病防控的主流发展方向。目前国内外的渔用疫苗大多W注射或浸 浴方式接种为主，口服免疫的少有报道。大规模的集约化养殖模式采用注射方式接种疫苗 需要耗费大量的人力和时间，同时注射接种往往会对鱼体造上生理损伤，且注射接种对小 规格鱼体难W实施。而通过口服免疫接种则操作简便，安全实用，不受鱼体大小的限制，且 疫苗的使用量比浸浴免疫更为节省，同时也不存在因浸浴免疫给水体造成的潜在污染问 题。因此，口服疫苗的研制和应用已逐渐成为当前鱼类疫苗研究的热点。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于开发一种在鱼体消化系统中保持相对稳定，粒径合适，具有缓 释性和抗原保护性，且能有效刺激鱼体肠道免疫系统产生免疫应答，使鱼体形成对迟纯爱 德华氏菌具有特异性免疫保护力的口服微胶囊疫苗。
[0004] 本发明首先提供一种疫苗，其中抗原蛋白包含有氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的甘 油醒-3-憐酸脱氨酶(GAPDH)、氨基酸序列为SEQ ID ^):2的外膜蛋白（〇1119￥)和氨基酸序列 为 SEQ ID NO: 3 鞭毛蛋白（flic);
[0005] 其中鞭毛蛋白（flic)全部或部分用氨基酸序列为SEQ ID N0:4的鞭毛蛋白（flic) 来取代；
[0006] 上述的蛋白用脂多糖进行了偶联；
[0007] 所述的脂多糖是从保藏编号为CGMCC齡.11270的迟纯爱德华氏菌61'-1008菌株中 分离的；迟纯爱德华氏菌化dwardsiella tarda化T-1008株，于2015年8月24日保藏在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏 编号为CGMCC No. 11270。
[000引本发明再一个方面提供一种微胶囊疫苗;是将巧巾LPS偶联的蛋白与黄巧多糖W3: UW/W)比例混合，然后将抗原混合物与海藻酸钢混合，用蒸馈水配制成乳浊液，其中海藻酸 钢终浓度为2%，在混匀器的揽拌作用下包埋30min;将该乳浊液利用喷雾式锐孔凝固浴法， 直接喷入经混匀器揽动的含3%CaCl2的溶液中，形成海藻酸巧微胶囊，喷雾完毕后继续揽 拌20min;离屯、收集海藻酸巧微胶囊，然后将微胶囊分散到0.2 %的壳聚糖溶液中，充分揽拌 30min，离屯、收集海藻酸巧-壳聚糖微胶囊，蒸馈水洗涂3次，再将收集的微胶囊分散在8 %的 甘露醇溶液中，混匀后冷冻，经冷冻干燥后，封盖包装，即为微胶囊疫苗。
[0009]本发明的口服微胶囊疫苗可用作饲料添加剂来使用。
[0010]本发明存在W下优点：
[0011] 1)制作工艺简单，所用材料为天然高分子材料，来源广泛，价格低廉，且有良好的 免疫增强效果。
[0012] 2)操作方便，免疫效果好。口服免疫对个体较小的鱼体应激小，人力成本低，便于 规模化推广应用。该疫苗无异味，适口性好，鱼体易采食。
[0013] 3) 口服微胶囊形状较为理想，粒径大小合适，能表现出较好的缓释性，又能保护免 疫原遭到鱼体胃肠道的破坏。同时在微胶囊中加入了黄巧多糖，能增强鱼体的非特异性免 疫力。
[0014] 4)储存方便，本疫苗在室溫条件下保存8个月W上能保持良好的免疫原性。
【附图说明】
[0015] 图1:迟纯爱德华氏菌菌株ET-1008的甘油醒-3-憐酸脱氨酶(GAPDH)、外膜蛋白 ompW及鞭毛蛋白flic的原核重组表达蛋白的纯化产物电泳图；
[0016] 图2:迟纯爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗的表观特性图（X200);
[0017] 图3:迟纯爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗对牙解的免疫保护效果图；
[0018] 图4:本发明的flic蛋白与NCBI中的氨基酸序列为SEQ ID N0:3的flic基因的序列 比较图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0020] 实施例1:迟纯爱德华氏菌菌株的分离及其毒力特性分析
[0021 ] (1)患病牙解取自山东黄岛养鱼厂，病鱼平均体重为(200 ± 5) g，平均体长(20 ± 5) cm,主要症状为腹水、肛口红肿突出、肝脏和肾脏肿大。
[0022] (2)取腹水症状典型的溯死病鱼，无菌条件下从肝脏、肾脏、腹水等病灶处挑取部 分组织，划线于普通营养琼脂平板上，28 Γ培养2地，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培 养，直至获得纯培养菌。普通营养琼脂培养基配方为:酵母膏3g，蛋白腺lOg，氯化钢15g，蒸 馈水lL，pH 7.6-7.8，琼脂20邑。
[0023] (3)将分离获得各菌株纯培养物，在普通营养琼脂平板上进行扩大培养，28Γ培养 24h后，用0.9 %无菌生理盐水洗脱菌落，获得菌悬液，利用比浊法将各菌株的细菌浓度定为 1 X 106CFU/mL，用于注射感染。
[0024] (4)实验用健康牙解每20尾1组，大小规格与患病牙解相同，并设生理盐水对照组。 养殖水溫为20 + °C，全天充气，每天换水50%。暂养7d后，腹腔注射0.2mL不同菌株的菌悬 液，对照组注射同体积的0.9%无菌生理盐水。定时观察记录，取溯死鱼的病灶及内脏器官 进行细菌再分离，所分离优势菌株再次感染牙解，观察结果。
[0025] (5)感染实验结果显示，仅有菌株ET-1008显示出对健康牙解具有较高的毒力，可 引起90 %牙解死亡，且死亡牙解出现与患病牙解相同的症状。因此，证实菌株ET-1008为牙 解腹水症的病原。且在感染患病的牙解体内可再次分离到该菌株。
[0026] (6)对比实验表明，用目前市场上出售的迟纯爱德华氏菌疫苗对牙解幼苗进行免 疫后，再用本发明筛选的ET-1008株进行攻毒实验;结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫 效果远低于用本发明ET-1008株制成的灭活疫苗的效果。推测是由于ET-1008株的某个致病 基因发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。
[0027] (7)利用常规生理生化鉴定W及6SrRNA和HSP60基因序列分析显示，菌株ET-1008 为迟纯爱德华氏菌化dwardsiella tarda)，并将该菌株于2015年8月24日保藏在位于北京 市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号 为：CGMCC No.11270。
[002引实施例2:迟纯爱德华氏菌菌株ET-1008的GAPDH、外膜蛋白ompW及鞭毛蛋白f 1 iC的 原核重组表达
[0029] (1)目的表达蛋白的序列扩增:根据Genbank迟纯爱德华氏GAPDH、ompW及flic的基 因序列，分别设计其特异性引物(见表1)。利用细菌基因组抽提试剂盒，W抽提细菌基因组 DNA为模板，分别配合各基因的正反向引物进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件为:5化1 反应体系，包含37μ1 此0、5μ1 lOXTaq buffer、4yl dNTP(2.5mM)、正反引物各 1μ1、1μ1 Taq DM Polymerase及化 1 DNA模板；PCR反应程序为94°C变性 10min;94°C变性，lmin，50°C 退火lmin，72°C延伸Imin，进行30个循环，最后72°C延伸SmiruPCR产物经1%琼脂糖凝胶电 泳检测，凝胶成像系统拍照观察，结果显示GAP畑、ompW及flic基因扩增成功，且扩增产物大 小与目的基因一致(图1)。
[0030] 表1迟纯爱德华氏菌鞭毛蛋白flic、外膜蛋白ompW及GAPD哺勺引物
[0031]
[0032] 对扩增产物回收后进行测序，结果表明，获得的甘油醒-3-憐酸脱氨酶(GAPDH)的 氨基酸序列为SEQ ID N0:1、外膜蛋白（ompW)的氨基酸序列为SEQ ID N0:2;NCBI比对结果 表明上述两种蛋白与NCBI中已公开的序列一直，没有发生变化。但flic基因的序列与NCBI 中已公开的序列存在明显的差异;本发明获得的氨基酸序列为SEQ ID N0:4的flic蛋白相 比于NCBI中的氨基酸序列为SEQ ID N0:3的flic基因存在10个W上氨基的区别（图4)。
[0033] 而免疫效果表明，用氨基酸序列为SEQ ID N0:4的flic蛋白制成的疫苗对ET-1008 株的免疫效果明显好于氨基酸序列为SEQ ID N0:3的flic蛋白制成的疫苗。
[0034] (2)GAPDH、ompW及flic基因表达载体的构建：将扩增的迟纯爱德华氏菌GAPDH、 ompW和fl iC基因产物切胶回收进行纯化，纯化产物经BamH巧日化011双酶切后，连接至原核 表达载体祀T32a，分别构建其表达载体祀T32a-GAPDH、祀T32a-〇mpW及祀T32a-f 1 iC，并将表 达载体转化至大肠杆菌化2UDE3)，于含氨节青霉素的LB平板上培养，待长出菌落后，利用 PCR方法筛选阳性克隆表达菌，将PCR检测为阳性克隆的菌株进一步利用测序进行确认。
[0035] (3)重组蛋白的表达与纯化:经测序确认载体中插入序列正确后，将筛选到的迟纯 爱德华氏菌GAPDH、ompW和fli啡日性克隆表达菌分别接种于含氨节青霉素的LB培养基内，在 摇床上培养至指数生长期时，加入终浓度为ImM的IPTG诱导表达化，离屯、收集菌体，经超声 破碎后，WNi离子馨合的亲和层析柱化isTrap HP lml，GE)对重组蛋白进行纯化，洗脱产物 经尿素浓度梯度透析后，最后WPBS进行透析，透析完成后对样品进行冷冻干燥W浓缩样 品，SDS-PAGE检测纯化的重组蛋白。迟纯爱德华氏菌fliC重组蛋白分子量为63kDa，该目的 基因编码416个氨基酸，表达的蛋白片段理论分子量为43kDa，质粒pET32a的标签蛋白大小 则约为20kDa左右，结果与理论大小相符;GAPDH重组蛋白分子量为55kDa，该目的基因编码 331个氨基酸，表达的蛋白片段理论分子量为35kDa，质粒pET32a的标签蛋白大小则约为 20W)a左右，结果与理论大小相符;ompW重组蛋白分子量为43kDa，该目的基因编码214个氨 基酸，表达的蛋白片段理论分子量为23kDa，质粒祀T32a的标签蛋白大小则约为20kDa左右， 结果与理论大小相符。
[0036] 实施例3:迟纯爱德华氏菌脂多糖(LPS)的抽提
[0037] (1)菌体培养:用无菌接种环挑取少量保存的ET-1008菌落划线于普通营养琼脂平 板，用液体培养基洗下生长良好的菌苔，转接入装有40ml培养基的lOOmlS角烧瓶中，28Γ 振荡培养过夜（160;rpm)。在10ml离屯、管内加入7ml菌液，4°C条件下SOOOr/min离屯、lOmin收 集细菌，用生理盐水洗涂3次，用7ml 50mmol/L憐酸缓冲液(pH 7.0,内含5mmol/L EDTA， 20mmol/L MgCl2)使细菌悬浮，浓度为lX108CFU/ml。
[0038] (2)热酪水法制备LPS:在冰浴条件下进行超声波破碎，设定时间为5min，其中4s 开，4s关;将菌液转移到250ml烧杯中，加入溶菌酶至终浓度为200μg/ml，37 °C揽拌溫育比，4 °C揽拌过夜；加入蛋白酶K至终浓度为10化g/ml，65°C揽拌解育化，再加入RNase和EWase至 终浓度为40μg/ml，37°C溫育比，置于65-70°C的水浴中。平衡后，加入相同体积的预热至65- 70°C的90 %苯酪，边加边剧烈揽拌30min，用冰水浴快速冷却15min，转移至1.5ml离屯、管中， 4"€10,00〇1'/1]1；[]1离屯、151]1；[]1。弃去酪相，取上层水相至透析膜中，用蒸馈水静置透析3(1，每天 换水3次。在水相中加入乙酸钢至终浓度为0.5M和10倍体积的95 %乙醇，-20°C过夜沉淀 LPS，2000g 4°C离屯、10min，lml蒸馈水重悬，冷冻干燥获得高纯度脂多糖干粉用于与蛋白的 偶联。
[0039] 实施例4:迟纯爱德华氏菌重组表达蛋白与LI^的偶联
[0040] (1)重组蛋白与LPS的偶联:将llOmg脂多糖干粉溶解于10ml蒸馈水中，往该LPS水 溶液中加入400mg固体化1〇4,混合解育2min，然后加入22化1乙醇胺终止氧化反应，将反应 产物加入孔径为3K大小的透析袋中，置于O.Olmol/L的PBS中，在4°C条件下透析过夜，期间 换两次透析液。同时，称取390mg碳化二亚胺巧DC)，溶解于5ml蒸馈水中，然后加入90mg纯化 后的GAPDH重组蛋白，利用1M肥1将反应体系抑调整至5.4,室溫震荡解育化。将上述完成氧 化反应后的WS与含抓C的重组GAPDH蛋白溶解混合，在22°C条件下解育化，最后将反应液置 于PBS缓冲液中透析过夜，期间更换透析液，最后将透析后的溶液在8000g下离屯、30min，所 得上清即为GAPDH与LI^的偶联粗制物。Flic和ompW与LI^的偶联同样参照W上方法进行。
[0041] (2)重组蛋白-LPS偶联物的纯化：各重组蛋白的偶联粗制物，利用Sephac巧1 s- 300凝胶柱层析分离纯化各重组蛋白-LPS偶联物。具体为：首先将粗制偶联产物W孔径为 0.22WI1的滤膜过滤，然后往柱体积为120mL的S邱hacryl S-300层析柱内上样10ml偶联粗制 物，WPBS缓冲液作为平衡与洗脱缓冲液，均匀将流速控制为2ml/min，根据紫外吸收波收集 样品，根据分子筛原理，分子量较大的偶联产物将会首先分离获得。将收集到的偶联产物W 超纯水透析，然后进行冷冻干燥，-20°C保存备用。
[0042] 实施例5:迟纯爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗的制备
[0043] (1)海藻酸巧一壳聚糖微胶囊的制备：将上述制备的GAPDH、ompW及flic巧巾重组 蛋白-LPS偶联产物按3: 3:1 (W/W)混合后，然后W总量为3:1 (W/W)的比例与黄巧多糖混合， 将抗原混合物与海藻酸钢W1:4(W/W)比例混合，用蒸馈水配制成海藻酸钢-抗原乳浊液，其 中海藻酸钢终浓度为2%，在混匀器的揽拌作用下包埋30min。将该乳浊液利用喷雾式锐孔 凝固浴法，直接喷入经混匀器揽动的3%化C12溶液中，形成海藻酸巧微胶囊，乳浊液与化C12 溶液的体积比为1:1，喷雾完毕后继续揽拌20min。离屯、收集海藻酸巧微胶囊，然后将微胶囊 分散到0.2 %的壳聚糖溶液中，充分揽拌30min，离屯、收集海藻酸巧-壳聚糖微胶囊，蒸馈水 洗涂3次并离屯、后，再将收集的微胶囊分散在8%的甘露醇溶液中，混匀后冷冻，经冷冻干燥 后，封盖包装，即为本发明所述的迟纯爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗。利用显微镜对制 备的微胶囊进行表观特性观察，结果如图2所示，可见微胶囊颗粒大小均匀，平均直径为150 ±10μπι〇
[0044] (2) 口服微胶囊包封率和蛋白载量的测定：W化ad-ford法测定海藻酸巧微胶囊固 化后，化C12溶液中的蛋白浓度，然后根据化C12溶液的体积计算溶液中逸散的重组蛋白-LPS 偶联产物中的蛋白含量。根据公式:包封率％ =偶联蛋白的总量-CaCb溶液中逸散的偶联 蛋白的含量/偶联蛋白的总量X 100%，计算微胶囊的包封率;根据公式:蛋白载量=偶联蛋 白的总量X包封率/微胶囊干重，计算微胶囊的蛋白载量。最终结果显示，所制备的口服微 胶囊包封率为78%，蛋白载量为102mg/g。
[0045] 实施例6:迟纯爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗对牙解的免疫保护效果
[0046] 准备健康牙解共80尾，平均体重为50g±5g，利用可控溫循环养殖系统对牙解暂养 7天，水溫控制为2rC，期间正常投喂商品化颗粒饲料。实验前，将鱼平均分为2组，每组40 尾，在对供试鱼体禁食24h后，对免疫组鱼体投喂本发明研制的口服微胶囊疫苗，投喂方法： 将口服微胶囊疫苗与鱼饲料混合投入水体，供鱼体自由采食，使用剂量为:每kg体重鱼体投 放微胶囊疫苗〇.5g，连续投喂5天。首次投喂后15天，再次进行二次免疫，用法及用量与首次 相同。对照组鱼体投喂W不含免疫原与黄巧多糖的海藻酸钢溶液制备的微胶囊颗粒，投喂 方法与投喂量与免疫组相同，在首次投喂后35天，利用生理盐水配制迟纯爱德华氏菌活菌 悬液，浓度为lXl〇7CFU/ml，采用肌肉注射方式对实验鱼体进行攻毒，每尾注射10化1。攻毒 后连续观察并记录鱼体发病与死亡状况，计算迟纯爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗对牙 解的相对免疫保护率。结果如图3所示，对照组鱼体累计死亡率为95%，免疫组鱼体在攻毒 后20天的累计死亡率为17.5%，通过计算得知，本发明研制的迟纯爱德华氏菌亚单位口服 微胶囊疫苗对牙解的相对免疫保护率为81.6%。
[0047] 综上所述，本发明研制的迟纯爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗，使用方便，粒径 合适，具有良好的缓释性和抗原保护性，且能有效刺激鱼体肠道免疫系统产生免疫应答，使 鱼体获得对迟纯爱德华氏菌的特异性免疫保护力，具有良好的开发应用前景。
【主权项】
1. 一种迟钝爱德华氏菌亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原蛋白包含有氨基 酸序列为SEQ ID NO: 1的甘油醛-3-磷酸脱氢酶、氨基酸序列为SEQ ID NO: 2的外膜蛋白和 氨基酸序列为SEQ ID NO:3鞭毛蛋白。2. 如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的鞭毛蛋白全部或部分用氨基酸 序列为SEQ ID NO:4的鞭毛蛋白来取代。3. 如权利要求1或2所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的蛋白用脂多糖进行偶联。4. 如权利要求3所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的脂多糖是从保藏编号为CGMCC No. 11270的迟钝爱德华氏菌ET-1008菌株中分离的。5. -种微胶囊疫苗，其特征在于，所述的微胶囊疫苗是将权利要求1或2所述的亚单位 疫苗中的疫苗蛋白与黄芪多糖混合，然后将混合物与海藻酸钠混合配制成乳浊液，再加入 CaCl2溶液形成海藻酸钙微胶囊，然后将微胶囊分散到壳聚糖溶液中，充分搅拌后离心收集 海藻酸钙-壳聚糖微胶囊，洗涤后分散在甘露醇溶液中，混匀后冷冻干燥制成微胶囊疫苗。6. 权利要求5所述的微胶囊疫苗作为饲料添加剂的应用。
【文档编号】C07K14/195GK105920593SQ201610406736
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】刁菁, 叶海斌, 王晓璐, 于晓清, 李乐
【申请人】山东省海洋生物研究院