多重数字pcr技术在染色体非整倍体筛查中的应用
多重数字pcr技术在染色体非整倍体筛查中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医疗技术领域，具体地涉及利用早期、安全无创、准确、快速、适合 大规模检测和临床应用的多重数字PCR (Multiplex digital PCR，MDPCR)技术对正常妊娠 妇女进行无创产前筛查（Non-invasive prenatal screening，NIPS)包括唐氏综合征，爱德 华氏综合征，帕陶氏综合征和其他多倍染色体疾病筛查的方法。
【背景技术】
[0002] 中国是人口大国，巨大的人口压力会制约社会发展，所以做好优生优育既能提高 人口素质，也能制约人口发展，对未来整个民族的生存与发展有重要作用。预防性优生优育 主要研宄如何降低人群中不利表现型的基因频率，减少以至消除有严重遗传病和先天性遗 传病的个体出生，主要包括遗传咨询、产前筛查、宫内治疗等。
[0003] 据中国出生缺陷干预救助基金会的数据，中国每年新增出生缺陷约90-120万例， 约占每年出生人口总数的4-6%。现有8000多万残疾人中，约3000万人是出生缺陷所致。 出生缺陷目前已成为儿童致病、致残，甚至死亡的重要原因，其中染色体异常疾病为主要疾 病。孕前和孕早期保健以及产前筛查，是避免与降低新生儿缺陷和实行优生优育的最重要 关卡。以往，那些具有染色体异常疾病患病高风险的夫妇，对于孕育健康的后代，往往处于 无从选择的被动地位。直到1966年，研宄发现了孕妇高龄与唐氏综合症的相关性，此后，产 前筛查得到迅速发展。产前筛查是指在出生前对胚胎或胎儿的发育状态、是否患有疾病等 方面进行检测诊断。从而掌握时机，对可治疗疾病，选择及时进行宫内治疗；对于不可治疗 性疾病，如染色体异常疾病等，能够做到知情选择和预防。
[0004] 染色体异常疾病，是指染色体的数目异常和/或形态结构变化，可发生于每一条 染色体上，但多发于如21三体（唐氏综合征），18三体（爱德华氏综合征），13三体（帕陶 氏综合征）和性染色体异常等，在自发性流产、死胎、早夭中占50%以上，新生儿中发病率 约1%，是先天性心脏病、智能发育不全、性发育异常及男女不孕不育等的重要原因。随着染 色体分带技术，PCR技术，DNA检测技术等的快速发展，对染色体畸变与疾病关系的认识日 益加深，染色体异常疾病检测日趋增多。约15%的妊娠发生流产，而其中一半为染色体异 常所致，即约为5%-8%的胚胎有染色体异常。不过在出生前，90%以上已有自然流产或死 产。流产愈早，有染色体异常的频率愈高。染色体异常疾病，迄今尚无有效的治疗方法，只 能通过产前筛查/诊断等手段进行一定程度的预防。但目前传统的产前诊断多采用羊膜穿 刺等侵入性取样方法，胎儿宫内感染或流产等的风险增加。
[0005] 上述传统侵入性产前诊断的缺点，导致染色体异常疾病无创产前筛查/诊断方法 的出现。目前通用的方法包括以细胞为主体的和脱细胞方法，尤以后者居多。胎儿游离DNA 在妊娠母体血液中的存在，和新一代DNA检测技术的不断改进，使得无创产前筛查/诊断更 加容易开展。仅需采取孕妇静脉血，利用新一代DNA检测技术对母体外周血浆中的游离DNA 片段（包含胎儿游离DNA)进行检测分析从而检测胎儿是否患染色体异常疾病。但妊娠早 期，主要来自胎盘细胞的胎儿游离DNA只占母体血液DNA的10-20 %。而目前常用的新一代 DNA测序技术，检测耗时较长，需用复杂的仪器和生物信息学软件分析大量的DNA序列，1-2 周获检测结果，且耗费许多试剂和耗材，价格昂贵。数字PCR(digi tal PCR)是近年来快 速发展起来的一种新型定量分析技术，通过将单个样本分成超过数万，甚至数百万、数千万 份分布于不同的反应单元，每个单元包含无或一个或多个拷贝的DNA模板，分别对这些DNA 模板进行PCR扩增，然后对各个反应单元的荧光信号进行分析。dPCR可不需要对照标准样 品和曲线实现绝对定量分析。尤其需要指出的是，将多重PCR技术与dPCR技术有机结合 (MDPCR)，便可大幅提高dPCR多重性达20-50以上。
[0006] 因此本领域迫切需要开发一种早期、安全无创、准确、快速、适合大规模检测和临 床应用的新方法。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种对染色体疾病进行早期筛查的方法。
[0008] 本发明第一方面，提供了一种体外非诊断性的检测目标染色体非整倍体 (Aneuploidy)的方法，包括步骤：
[0009] (a)提供含有胎儿游离DNA的妊娠对象外周血样本；
[0010] (b)从所述外周血样本分离去除细胞，并从去除细胞的所述样本中富集DNA，得到 DNA样本；
[0011] (c)将所述DNA样本分为对照组和实验组，其中，
[0012] 在实验组中，以所述DNA样本为模板，用扩增目标染色体基因的nl对第一引物对 进行多重数字PCR，并记录阳性点个数C1与引物对数量nl之比，记为al，其中al = Cl/nl， 且nl彡2,优选地，nl彡5 ;
[0013] 在对照组中，以所述DNA样本为模板，用扩增参照染色体基因的n2对第二引物对 进行多重数字PCR，并记录阳性点个数C2与引物对数量n2之比，记为a2,其中a2 = C2/n2， 且nl彡5,优选地，nl彡5 ;
[0014] ⑷将所述al值与a2值进行比较，从而确定目标染色体的倍数。
[0015] 在另一优选例中，所述的参照染色体为二倍体。
[0016] 在另一优选例中，所述的胎儿和所述的妊娠对象包括小鼠、大鼠、或人，优选地，为 人。
[0017] 在另一优选例中，所述的第一引物对和/或第二引物对所扩增的PCR产物中，有至 少一个引物或探针经荧光标记。
[0018] 在另一优选例中，所述步骤（b)还包括步骤（bl):将所述的DNA样本进行片段化 处理，从而获得片段化的DNA样本。
[0019] 在另一优选例中，所述的片段化处理包括物理和生化处理，如碎化、超声处理和酶 切。
[0020] 在另一优选例中，所述的片段化的DNA样本大小彡3000bp。
[0021] 在另一优选例中，计算al/a2值记为R，
[0022] 当R等于或约等于0. 5(即接近于0. 5)时，则表明所述的样本中所述目标染色体 为单倍体；
[0023]当R等于或约等于1(即接近于1)时，则表明所述的样本中所述目标染色体与参 照染色体的倍数相同；
[0024] 当R等于或约等于1.025时，则表明所述的样本中只有5%胎儿游离DNA样本的目 标染色体为三倍体，而其余95 %妊娠母体DNA样本的目标染色体仍为二倍体；
[0025] 当R等于或约等于1.05时，则表明所述的样本中只有10%胎儿游离DNA样本的目 标染色体为三倍体，而其余90 %妊娠母体DNA样本的目标染色体仍为二倍体；
[0026] 当R等于或约等于1. 5 (即接近于1. 5)时，则表明所述的样本中所述目标染色体 为3倍体；
[0027] 当R等于或约等于2 (即接近于2)时，则表明所述的样本中所述目标染色体为4 倍体。
[0028] 在另一优选例中，当R与1离散时，则表明所述的样本中含有多倍染色体。
[0029]在另一优选例中，所述各对第一引物的扩增产物的长度为50-150bp，较佳地 60_120bp。
[0030] 在另一优选例中，所述的nl对第一引物中的每对引物是特异性扩增21号染色体 的引物。
[0031] 在另一优选例中，所述的目标染色体为可发生染色体数量变异疾病的染色体，优 选地包括21号染色体、13号染色体、18号染色体、性染色体。
[0032] 在另一优选例中，所述的参照染色体为正常染色体。
[0033] 在另一优选例中，所述的参照染色体包括21号染色体、13号染色体、18号染色体。
[0034] 在另一优选例中，所述目标染色体基因包括21号染色体的 Usp25 (NCBI#NM_001283041)、C21orf37 (NCBI#LN608865)、C21orf58 (NCBI#NM_058180)、 Setd4(NCBI_M_017438)、或 C21orf62(NCBI#AF231922)基因；和 / 或
[0035] 13 号染色体的 Sacs(NCBI#NM_014363)、Cenpj (NCBI#NM_018451)、 卩〇叉〇1(从^1抑概_002015)、511^(19(从^1_1_001127217)、或卩 §打4(从^1_1_004115);和/或
[0036] 18 号染色体的 Setbpl(NCBI_M_015559)、Potec(NCBI_M_001137671)、 Maltl (NCBI#AB026118)、Dsc3(NCBI#NM_001941)、Cdhl9(NCBI#NM_021153)。
[0037] 在另一优选例中，所述的目标染色体基因还包括非编码基因。
[0038] 在另一优选例中，所述的参照染色体为一个或多个。
[0039] 本发明第二方面，提供了了一种引物集合，所述的引物集合包括以下引物对：
[0040] ⑴本发明第一方面中用于扩增目标染色体基因的所述nl对引物对；和
[0041] (ii)本发明第一方面中用于扩增参照染色体基因的所述n2对引物对；
[0042] 其中，nl、n2分别彡2。
[0043]在另一优选例中，所述n 1、n2分别至少为3、4、5、6、7、8、9、10对，优选至少5对。
[0044] 在另一优选例中，所述的目标染色体为可发生染色体数量变异疾病的染色体，优 选地包括21号染色体、13号染色体、18号染色体、性染色体。
[0045] 在另一优选例中，所述的参照染色体为正常染色体。
[0046] 在另一优选例中，所述的引物集合中每对引物所扩增的模板长度为50_150bp
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医疗技术领域，具体地涉及利用早期、安全无创、准确、快速、适合 大规模检测和临床应用的多重数字PCR (Multiplex digital PCR，MDPCR)技术对正常妊娠 妇女进行无创产前筛查（Non-invasive prenatal screening，NIPS)包括唐氏综合征，爱德 华氏综合征，帕陶氏综合征和其他多倍染色体疾病筛查的方法。
【背景技术】
[0002] 中国是人口大国，巨大的人口压力会制约社会发展，所以做好优生优育既能提高 人口素质，也能制约人口发展，对未来整个民族的生存与发展有重要作用。预防性优生优育 主要研宄如何降低人群中不利表现型的基因频率，减少以至消除有严重遗传病和先天性遗 传病的个体出生，主要包括遗传咨询、产前筛查、宫内治疗等。
[0003] 据中国出生缺陷干预救助基金会的数据，中国每年新增出生缺陷约90-120万例， 约占每年出生人口总数的4-6%。现有8000多万残疾人中，约3000万人是出生缺陷所致。 出生缺陷目前已成为儿童致病、致残，甚至死亡的重要原因，其中染色体异常疾病为主要疾 病。孕前和孕早期保健以及产前筛查，是避免与降低新生儿缺陷和实行优生优育的最重要 关卡。以往，那些具有染色体异常疾病患病高风险的夫妇，对于孕育健康的后代，往往处于 无从选择的被动地位。直到1966年，研宄发现了孕妇高龄与唐氏综合症的相关性，此后，产 前筛查得到迅速发展。产前筛查是指在出生前对胚胎或胎儿的发育状态、是否患有疾病等 方面进行检测诊断。从而掌握时机，对可治疗疾病，选择及时进行宫内治疗；对于不可治疗 性疾病，如染色体异常疾病等，能够做到知情选择和预防。
[0004] 染色体异常疾病，是指染色体的数目异常和/或形态结构变化，可发生于每一条 染色体上，但多发于如21三体（唐氏综合征），18三体（爱德华氏综合征），13三体（帕陶 氏综合征）和性染色体异常等，在自发性流产、死胎、早夭中占50%以上，新生儿中发病率 约1%，是先天性心脏病、智能发育不全、性发育异常及男女不孕不育等的重要原因。随着染 色体分带技术，PCR技术，DNA检测技术等的快速发展，对染色体畸变与疾病关系的认识日 益加深，染色体异常疾病检测日趋增多。约15%的妊娠发生流产，而其中一半为染色体异 常所致，即约为5%-8%的胚胎有染色体异常。不过在出生前，90%以上已有自然流产或死 产。流产愈早，有染色体异常的频率愈高。染色体异常疾病，迄今尚无有效的治疗方法，只 能通过产前筛查/诊断等手段进行一定程度的预防。但目前传统的产前诊断多采用羊膜穿 刺等侵入性取样方法，胎儿宫内感染或流产等的风险增加。
[0005] 上述传统侵入性产前诊断的缺点，导致染色体异常疾病无创产前筛查/诊断方法 的出现。目前通用的方法包括以细胞为主体的和脱细胞方法，尤以后者居多。胎儿游离DNA 在妊娠母体血液中的存在，和新一代DNA检测技术的不断改进，使得无创产前筛查/诊断更 加容易开展。仅需采取孕妇静脉血，利用新一代DNA检测技术对母体外周血浆中的游离DNA 片段（包含胎儿游离DNA)进行检测分析从而检测胎儿是否患染色体异常疾病。但妊娠早 期，主要来自胎盘细胞的胎儿游离DNA只占母体血液DNA的10-20 %。而目前常用的新一代 DNA测序技术，检测耗时较长，需用复杂的仪器和生物信息学软件分析大量的DNA序列，1-2 周获检测结果，且耗费许多试剂和耗材，价格昂贵。数字PCR(digi tal PCR)是近年来快 速发展起来的一种新型定量分析技术，通过将单个样本分成超过数万，甚至数百万、数千万 份分布于不同的反应单元，每个单元包含无或一个或多个拷贝的DNA模板，分别对这些DNA 模板进行PCR扩增，然后对各个反应单元的荧光信号进行分析。dPCR可不需要对照标准样 品和曲线实现绝对定量分析。尤其需要指出的是，将多重PCR技术与dPCR技术有机结合 (MDPCR)，便可大幅提高dPCR多重性达20-50以上。
[0006] 因此本领域迫切需要开发一种早期、安全无创、准确、快速、适合大规模检测和临 床应用的新方法。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种对染色体疾病进行早期筛查的方法。
[0008] 本发明第一方面，提供了一种体外非诊断性的检测目标染色体非整倍体 (Aneuploidy)的方法，包括步骤：
[0009] (a)提供含有胎儿游离DNA的妊娠对象外周血样本；
[0010] (b)从所述外周血样本分离去除细胞，并从去除细胞的所述样本中富集DNA，得到 DNA样本；
[0011] (c)将所述DNA样本分为对照组和实验组，其中，
[0012] 在实验组中，以所述DNA样本为模板，用扩增目标染色体基因的nl对第一引物对 进行多重数字PCR，并记录阳性点个数C1与引物对数量nl之比，记为al，其中al = Cl/nl， 且nl彡2,优选地，nl彡5 ;
[0013] 在对照组中，以所述DNA样本为模板，用扩增参照染色体基因的n2对第二引物对 进行多重数字PCR，并记录阳性点个数C2与引物对数量n2之比，记为a2,其中a2 = C2/n2， 且nl彡5,优选地，nl彡5 ;
[0014] ⑷将所述al值与a2值进行比较，从而确定目标染色体的倍数。
[0015] 在另一优选例中，所述的参照染色体为二倍体。
[0016] 在另一优选例中，所述的胎儿和所述的妊娠对象包括小鼠、大鼠、或人，优选地，为 人。
[0017] 在另一优选例中，所述的第一引物对和/或第二引物对所扩增的PCR产物中，有至 少一个引物或探针经荧光标记。
[0018] 在另一优选例中，所述步骤（b)还包括步骤（bl):将所述的DNA样本进行片段化 处理，从而获得片段化的DNA样本。
[0019] 在另一优选例中，所述的片段化处理包括物理和生化处理，如碎化、超声处理和酶 切。
[0020] 在另一优选例中，所述的片段化的DNA样本大小彡3000bp。
[0021] 在另一优选例中，计算al/a2值记为R，
[0022] 当R等于或约等于0. 5(即接近于0. 5)时，则表明所述的样本中所述目标染色体 为单倍体；
[0023]当R等于或约等于1(即接近于1)时，则表明所述的样本中所述目标染色体与参 照染色体的倍数相同；
[0024] 当R等于或约等于1.025时，则表明所述的样本中只有5%胎儿游离DNA样本的目 标染色体为三倍体，而其余95 %妊娠母体DNA样本的目标染色体仍为二倍体；
[0025] 当R等于或约等于1.05时，则表明所述的样本中只有10%胎儿游离DNA样本的目 标染色体为三倍体，而其余90 %妊娠母体DNA样本的目标染色体仍为二倍体；
[0026] 当R等于或约等于1. 5 (即接近于1. 5)时，则表明所述的样本中所述目标染色体 为3倍体；
[0027] 当R等于或约等于2 (即接近于2)时，则表明所述的样本中所述目标染色体为4 倍体。
[0028] 在另一优选例中，当R与1离散时，则表明所述的样本中含有多倍染色体。
[0029]在另一优选例中，所述各对第一引物的扩增产物的长度为50-150bp，较佳地 60_120bp。
[0030] 在另一优选例中，所述的nl对第一引物中的每对引物是特异性扩增21号染色体 的引物。
[0031] 在另一优选例中，所述的目标染色体为可发生染色体数量变异疾病的染色体，优 选地包括21号染色体、13号染色体、18号染色体、性染色体。
[0032] 在另一优选例中，所述的参照染色体为正常染色体。
[0033] 在另一优选例中，所述的参照染色体包括21号染色体、13号染色体、18号染色体。
[0034] 在另一优选例中，所述目标染色体基因包括21号染色体的 Usp25 (NCBI#NM_001283041)、C21orf37 (NCBI#LN608865)、C21orf58 (NCBI#NM_058180)、 Setd4(NCBI_M_017438)、或 C21orf62(NCBI#AF231922)基因；和 / 或
[0035] 13 号染色体的 Sacs(NCBI#NM_014363)、Cenpj (NCBI#NM_018451)、 卩〇叉〇1(从^1抑概_002015)、511^(19(从^1_1_001127217)、或卩 §打4(从^1_1_004115);和/或
[0036] 18 号染色体的 Setbpl(NCBI_M_015559)、Potec(NCBI_M_001137671)、 Maltl (NCBI#AB026118)、Dsc3(NCBI#NM_001941)、Cdhl9(NCBI#NM_021153)。
[0037] 在另一优选例中，所述的目标染色体基因还包括非编码基因。
[0038] 在另一优选例中，所述的参照染色体为一个或多个。
[0039] 本发明第二方面，提供了了一种引物集合，所述的引物集合包括以下引物对：
[0040] ⑴本发明第一方面中用于扩增目标染色体基因的所述nl对引物对；和
[0041] (ii)本发明第一方面中用于扩增参照染色体基因的所述n2对引物对；
[0042] 其中，nl、n2分别彡2。
[0043]在另一优选例中，所述n 1、n2分别至少为3、4、5、6、7、8、9、10对，优选至少5对。
[0044] 在另一优选例中，所述的目标染色体为可发生染色体数量变异疾病的染色体，优 选地包括21号染色体、13号染色体、18号染色体、性染色体。
[0045] 在另一优选例中，所述的参照染色体为正常染色体。
[0046] 在另一优选例中，所述的引物集合中每对引物所扩增的模板长度为50_150bp
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0访客 来自[江苏省常州市电信] 2019年02月13日 08:44BIOGHSC Super MultiProbe One Step Kit探针灵敏度高，可靠性大，可用于多重或数字PCR。
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