专利名称：：诊断胎儿非整倍体的制作方法诊断胎儿非整倍体
背景技术：
：发明领域本发明涉及早期非侵入性诊断胎儿非整倍体的方法。特别是，本发明涉及通过鉴定母体生物液体如母体血清或羊水内的非整倍体蛋白表达模式特征来诊断胎儿非整倍体。相关技术的描述蛋白表达模式的大规模分析作为当前DNA克隆方法和基因表达图语(geneprofiling)方法的一种重要和必要的工具出if见(Pandey和Mann,7V"/we405:837-46(2000))。在根据同源性方法推导一些结构和可能的蛋白修饰中，DNA序列信息是有用的，但是，不会提供关于在翻译后修饰、蛋白水解或区室化(compartmentalization)中的蛋白功能调控的信息。传统的基于凝胶的方法，例如一维和二维的凝胶电泳用于小规模的蛋白检测(<1，000种蛋白)，但是这些方法需要大的样品量(LilleyKS,RazzaqA,DupreeP:Two-dimensionalgelelectrophoresis:recentadvancesinsamplepreparation,detectionandquantitation.CurrOpinChemBiol.6(l):46-50，2002)。用于克服这种缺陷的方法包括基质辅助或增大表面的激光吸附/电离(MALDI或SELDI)飞行时间(time-of-flight)质谱，该方法能够精确地生成显示样品中蛋白质量的图谱。这些图语或模式可用于鉴定和监控各种疾病。将肽作图与串联质谱分析结合，获得第二水平的鉴定，从肽片段上获得氨基酸序列信息。这可以例如通过将MALDI/SELDI或者ESI与四极(quadrupole)飞行时间MS(Qq-TOFMS)结合来实现。后一种方法还可以用于量化具体肽(ICAT技术)。靡儿#奎倍沐胎儿非整倍体是染色体数量异常，通常由于在卵子发生或精子发生过程中减数分裂不分离而引起的，而某些非整倍体，如8三体，更多地是由于合子后有丝分裂分离引起的(Nicolaidis&Petersen,HumanReproduction,13(2):313-319,(1998))。所述异常包括正常染色体数量减少以及增加，且可以包括常染色体以及性染色体。减少的非整倍体实例是Turner综合症，其特征是存在单个X性染色体。染色体数量增加的实例包括唐氏综合症(Down'ssyndrome)(染色体21的三体)，Patau综合症(染色体13的三体)，Edwards综合症(染色体18的三体)，和Kleinfelter综合症(性染色体的XXY三体)。通常，非整倍体会明显地导致身体损伤和神经损伤，从而使得大比率的患病个体不能长至成年。事实上，患有包括除13,18或21之外染色体的常染色体非整倍体的胎儿一般都会宫内死亡。但是，某些非整倍体，如Kleinfelter综合症，会呈现更不明确表型，而且患其它三体如XXY&XXX的那些经常会长成能生育的成年。唐氏综合症是人类中最常见的一种畸形模式，而且是一种最常见的在出生时出现的重症先天畸形，在660名活出生儿中的发病率是l(Jones,K.,Down，sSyndrome,inSmith'srecognizablepatternsofhumanmalformation,Jones,K.,Editor,1997，Philadelphia,PA，第8-13页)。在妊娠中期三个月存活的患唐氏综合症的所有胎儿中约有三分之一将不能最终生存下来；因此，在500个妊娠中，妊娠中期三个月内的唐氏综合症的真正患病率接近于l(Cuckle,H.,EpidemiologyofDownSyndrome,inScreeningforDownSyndromeintheFirstTrimester,J.Grudzinkas和R.Ward,Editors,1997，RCOGPress,London,UK,pp.3-13.)。大部分的患唐氏综合症婴儿患有严重的心脏的，胃肠的，或其它畸形，而导致巨大的发病率和死亡率。另外，在美国，大部分患者的IQ小于50,使得该综合症是导致智力缺陷的原因之一。在美国，每年约二百五十万的怀孕妇女进行唐氏综合症的血清筛查，不进行筛查的话，可能会导致这些孕妇中约有4,000名孕妇会生出患唐氏综合症的婴儿(Palomaki，G.E.,等Am.J.Obstet.Gynecol.176(5):1046-1051(1997))。唐氏综合症是活出生儿中最常见的非整倍体，大量个体会患有染色体13，18和性染色体的非整倍体。18三体，例如，在7000名出生儿中的发病率约为1，13三体在29,000名出生儿中的发病率约为l(Nicolaidis&Petersen,^丄人怀孕时，其它非整倍体的发病率也很高，但通常在怀孕的前15周内就引起在胎儿达到终期前的自然流产(Nicolaidies&Petersen,^J:)。例如，16三体是一种最常见的人类三体，所有已验证的怀孕者中有1.5%患病，而且该病是致死性染色体畸形(^001&(^8&Petersen,U:)。15和8的三体发病率更低(分别约占所有自然流产的1.4%和0.7%),但也是致死性畸开j(Nicoladies&Petersen,U:)。y^乂乙护整倍体的诊錄胎儿非整倍体的出生前确诊需要通过羊膜穿刺或绒毛膜绒毛取样(CVS)来进行侵入性检测，这种侵入性的操作与0.5%-1%的妊娠丟失危险相关(D，Alton,M.E.,SeminPerinatol18(3):140-62(1994))。通常，胎儿非整倍体筛查，如唐氏综合症，是在妊娠期间进行的，以便为患者提供其怀有患病胎儿风险的估定。由于该风险与这种侵入性检测方法相关，所以对于开发用于筛查非整倍体的非侵入性方法非常感兴趣。虽然已使用了各种方法来用于与特定的非整倍体相关联，对于唐氏综合症情况，最初的筛查是完全基于母体年龄，将35岁作为专门的截取点来限定进行侵入性胎儿检测具有很高风险性的女性群体。该方法获得的患唐氏综合症胎儿的检出率为20%-30%,侵入性胎儿^r测比率为5%-7%。这样，需要用约140次羊膜穿刺来检测唐氏综合症个例，而且每两名检测的患病月台儿中就有一名正常月台儿无法检出(Vintzielos和Egan,AmJ.ObstetGynecol172(3):837-44(1995))。由于这种限制性，因此引入妊娠中期三个月血清筛查技术来提高检测率，并减少侵入性检测比率。筛查唐氏综合症的现有医护标准需要对15-18周孕龄的所有患者进行三种标记血清检测，并且结合母体年龄(MA)，来进行风险计算。该检测分析曱胎蛋白(AFP)，人绒毛膜促性腺激素(phCG)，非偶联雌三醇(uE3)。如果获自这种"三重筛选"的风险高于预定的截值点，该患者就需要进行侵入性检测来进行胎儿染色体组型分析。最常用的风险截值点为1:380(35岁妇女的期限风险)，其获得的唐氏综合症检出率为65%-70%，有5。/。-7。/。的怀孕者进行侵入性胎儿一全测(Wald爭，JMedScreen4(4):181-246(1997))。可以估算，利用MA并结合这种妊娠中期三个月血清"三重筛选"会进行60次羊膜穿刺来检测唐氏综合症个例(Vintzielos和Egan,现在，用于唐氏综合症的现有医护标准血清"三重筛选"发展成"四重试验，，(quadtest),其中将血清标记抑制素-A加到其它三个分析物中。这种四重"^式马全是在4仑享文的WolfsonInstituteofPreventiveMedicine,在Nicholas9Wald教授指导下，从1996年8月开始在临床上使用的。已经对抑制素-A在每天实验中的性能进行了预测。作为筛选标记的抑制素-A的性能评估非常一致。在六份已发表的研究中，唐氏综合症妊娠期情况下的母体血清抑制素—A水平平均比在未患病的妊娠期中发现的水平高1.9倍(Wald等，1997,U:)。已经确定，抑制素-A与最有效的单个标记，phCG,—样也可以作为唐氏综合症妊娠期的单变量预测物(固定的5%阳性筛选率，与phCG的49%检出率相比，抑制素-A的检出率为44%)(Wald等，1997，jSJ:)。将抑制素-A添加到三重试验中，可能会将"三重筛选"唐氏综合症的检出率提高到77%-80%，侵入性检测率为50/。-7。/o(Wald等,1997Wald等，PrenatDiagn16(2):143-53(1996))。另外，可以用四重试验将唐氏综合症的4全出率保持在70%,而将侵入性检测率降低到5%，并明显降低进行的羊膜穿刺次数。在进一步降低羊膜穿刺频率的努力中，用妊娠中期三个月超声筛查法进行唐氏综合症筛查。对某些主要的胎儿结构性畸形进行鉴定可以明显地增加唐氏综合症和其它非整倍体的风险，并用此来指示侵入性胎儿检测。但是，该方法并不会改善唐氏综合症的群体筛查，因为常规人群中98%的胎儿并不会患有结构性畸形。已进行了进一步的工作来对非整倍体的超声检测标记的作用进行评价，这种标记本身不是结构性畸形，而且在缺少正常染色体组型的条件下，可能并不会给胎儿带来任何危险。这种在唐氏综合症筛查中使用的超声检测标记包括脉络丛嚢肿，肠道回声增强，短股骨，短肱骨，最小肾盂积水和增厚的颈褶。虽然有些研究者认为超声检测法鉴定的胎儿唐氏综合症高至73%,筛查阳性率为5%,但这些研究全部是从具有高风险非整倍体的群体获得(Benacerraf等，Radiology193(1):135-40(1994))。由于所讨论的疾病的流行性会明显降低，因此不可能对从高风险群体到常规或未经选择群体进行的这些试验进行正确地推断。所以，当用于筛选常规群体时，这种"遗传超声"的价值就受到很大的限制。另外，由于数据的细微区别，超声筛查法的进行要完全依赖于操作者的技能和经验，当超声检测筛查在三级医院以外进行时，就很可能不具备可复验性(Ewigman,B.G.,等，NEnglJMed329(12):821-7(1993))。虽然"遗传超声"很可能不会作为主要的筛查工具，但它在最初的阳性筛查试验后，在降低非整倍体风险方面具有重要作用(Vintzielos和Egan，X_A)。妊娠中期三个月筛查唐氏综合症的重要问题是，它是对15-18周孕期进行的，如果需要，在16-20周孕期，要随后进行诊断性羊膜穿刺。如果在达到24周的常用孕龄上限前需要终止妊娠，就会对患者和供给者造成很大的时间压力。另外，这种后期妊娠终止是与母体发病率增加相关联的(Lawson,H.W.，等，AmJ.ObstetGynecol171(5):1365-72(1994))。基于妊娠头三个月的非整倍体超声筛查程序的价值将包括如果确定了畸形的安全妊娠终止法，而且如果在妊娠早期检测出畸形，能提高患者隐私和机密性。来自伦敦胎儿医学基金会的研究者利用结合MA和妊娠头三个月胎儿超声评估，筛查出的唐氏综合症检出率为80%(Pandya,P.P.等，BrJObstetGy認col102(12):957-62(1995);Snijders，R丄，等,Lancet352(9125):343-6(1998))。这依赖于对胎儿颈部和表面皮肤背面之间的半透明空间的测定，已经报道了在患唐氏综合症和其它非整倍体的胎儿中该空间会加大。据报道，在10和14周妊娠间通过经腹或经阴道超声检查很容易测定这种颈项半透明带(nuchaltranslucency，NT)(Snijders,R丄，等，UltrasoundObstetG稀col7(3):216-26(1996))。大部分证实妊娠头三个月唐氏综合症筛查的数据是来自伦敦的胎儿医学基金会(Pandya等'1995,Snijders等,1996,^Li:)。但是，唐氏综合症的检出率在不同的医学中心是不一致的，而且对于数据，胎儿医学基金会网站之外的医学中心都不能将它们的结果复制。还有数据表明多种妊娠相关蛋白和激素的妊娠头三个月浓度在染色体正常和异常妊娠中是不一样的。与唐氏综合症和Edwards综合症相关的两种最具希望的妊娠头三个月血清标记应该是PAPP-A和游离(3hCG(Wapner,R.，等，NEnglJMed349(15):1405-1413(2003))。已报道，在唐氏综合症中，PAPP-A的妊娠头三个月血清水平明显降低，而且这种降低不受颈项半透明带(NT)厚度的约束(Brizot，M丄.,等.ObstetGynecol84(6):918-22(1994))。另外，已经看到在胎儿唐氏综合症中，总和游离(3-hCG的妊娠头三个月血清水平都较高，而且这种增加也不受NT厚度的约束(Brizot,M丄.，BrJObstetGynaecol102(2):127-32(1995))。当用在唐氏综合症篩查时，PAPP-A和游离phCG也是相互独立的(Wald和Hackshaw，PrenatDiagn17(9):921-9(1997))。在多中心前瞻性研究中，PAPP-A和游离phCG组合能获得的唐氏综合症检出率为60%,侵入性检测率为5%(Haddow,J.E.,等，NEngJMed338(14):955-61(1998))。数学模型揭示利用MA,NT厚度，血清游离(3hCG,和血清PAPP-A的组合型妊娠头三个月筛查程序将可以检出多于80%的患唐氏综合症的胎儿，侵入性检测率为5。/Q(Wald和Hackshaw,JLA)。最近，Nicolaides对这些试-睑和才莫型进4亍了综述(UltrasoundinObstreticsandGynecology21:313-21(2003》。虽然这些数据显示用于胎儿非整倍体如唐氏综合症的组合妊娠头三个月筛查程序或完整妊娠头三个月和妊娠中期三个月筛查程序会好于普通妊娠中期三个月筛查，但是该假设还未在临床实践上证实。为了明确唐氏综合症的妊娠头三个月筛查效力，并且对妊娠头三个月和妊娠中期三个月筛查的诊断结果进行比较，最近NIH资助了多中心进行妊娠头三个月和妊娠中期三个月风险评价(FASTER)试验。在该前瞻性研究中，在孕103/7-136/7周时患者要进行NT超声，并采集获得PAPP-A和游离(3hCG的母体血清，将结果对患者隐瞒到在孕15-186/7周时进行第二次风险筛查后，第二次风险筛查包括四重筛选(AFP,卩hCG，uE3，和抑制素-A)。超过38,000名患者进行了该研究，在这些患者中鉴定出了117例胎儿21三体，其中87名具有完整的妊娠头三个月和妊娠中期三个月数据。各个试验的诊断结果是通过筛查法来进行分析的，包括组合型妊娠头三个月筛查(NT/PAPP-A/游离phCG/MA);妊娠中期三个月血清筛查(母体AFP/游离phCG/uE3/抑制素-A/MA);或完整的妊娠头三个月和妊娠中期三个月筛查。虽然这些数据证明了妊娠头三个月，或组合的妊娠头三个月和妊娠中期三个月完整筛查的实用性，但还是有很大的局限性。首先，这些试验高度依赖于孕龄，而且当妊娠推进时就会变得差异性很小。第二，为了优化唐氏综合症检测，所有这些试验的筛查阳性率都很低(5%)，而且真布支阳性率额外地高(超过90%),导致患者焦虑并且进行不必要的用来遗传;险测的侵入性羊膜穿刺。因此，急需可供选择的对大范围孕龄的可靠和改善的检测，来減少々i阳性的比率。特别期望开发新的、有效和可靠的非侵入性方法，用于诊断唐氏综合症以及其它胎儿非整倍体。发明概述一方面，本发明涉及诊断胎儿非整倍体的方法，包括将母体生物液体中待测样品的蛋白质组图谱与相同类型生物液体中的正常或参比蛋白质组图谱进行比较，当所述待测样品的蛋白质组图谱显示至少一种独特表达特4正(expressionsignature)、所述表达特;f正4戈表至少一种选自表l-2和5-6所歹l)的生物标记、且该特征不出现在所述正常蛋白质组图谱中或者出现在所述参比蛋白质组图谱中，则确定存在胎儿非整倍体。在还有一个方面中，本发明涉及诊断胎儿非整倍体的方法，包括将母体生物液体中待测样品的蛋白质组图镨与相同类型生物液体中的正常或参比蛋白质組图谱进行比较，当所述待测样品的蛋白质组图谱显示至少一种独特表达特征、所述表达特征代表至少一种选自表3所列的生物标记、且该特征不出现在所述正常蛋白质组图谱中或者出现在所述参比蛋白质组图谱中，则确定存在胎儿非整倍体。在一个实施方案中，本发明涉及利用从妊娠的妇女获得的待测样品。在本发明的另一个实施方案中，蛋白质组图谱是质谱。在本发明的还有一个实施方案中，待测样品是母体血清。在另一个实施方案中，独特的表达特征是在一种或多种分子量范围16-20kDa,35-38kDa，38-42kDa，40-45kDa，50-55kDa,60-68kDa,和125-150kDa。在另一个实施方案中，待测样品是母体羊水。在另一个实施方案中，独特的表达特征是在一种或两种分子量范围6-7kDa和8-10kDa。在另一个实施方案中，该方法是在妊娠头三个月内进行的。在另一个实施方案中，该方法是在妊娠中期三个月内进行的。在还有一个实施方案中，该方法还包括确定所述待测样品中至少一种另外的胎儿非整倍体生物标记的转录mRNA水平或翻译出的蛋白的水平，当所述转录mRNA水平或翻译出的蛋白的水平相对于其在正常生物样品中的水平有不同，则确定存在胎儿非整倍体。在另一个实施方案中，诊断的胎儿非整倍体是唐氏综合症，13三体，18三体，X染色体三体，X染色体单体，Kleinfelter综合症(XXY基因型)，或XYY综合症(XYY基因型)。在另一个实施方案中，检测了其转录mRNA水平或翻译出的蛋白的水平的那些生物标记选自下组PAPP-A,曱胎蛋白(AFP)，人绒毛膜促性腺激素(bhCG),非偶联雌三醇(unconjugatedestriol,uE3),和抑制素A。在还有一个实施方案中，该方法进一步包括对妊娠妇女使用一种或多种其它的诊断技术。在另一个实施方案中，其它的诊断技术选自超声影像技术，检测染色体畸形的技术，和颈项半透明带(nuchaltranslucency,NT)测定。在还有一个实施方案中，本发明涉及比较多于一种生物标记的独特表达特征。另外，表达特征的数量可以是2，3,4,5,6,7,8,或更多的生物标记。在还有一个实施方案中，生物标记选自补体因子H(CFAH—HUMAN,SwissProt登录号P08603);妊娠区带蛋白(pregnancyzoneprotein,PZP—HUMAN;SwissProt登录号P20741);afamin(AFAMHUMAN;SwissProt登录号P43652);血管紧张肽原(ANGT—HUMAN;SwissProt登录号P01019);a-2-hs-糖蛋白(A2HS—HUMAN;SwissProt登录号P02765);簇蛋白(CLUS—HUMAN;SwissProt登录号P10909);载脂蛋白AI(APAl—HUMAN;SwissProt登录号P02647);载脂蛋白AIV(APA4—HUMAN;SwissProt登录号P06727);载脂蛋白E(APE—HUMAN;SwissProt登录号P02649);色素上皮衍生因子(PEDF—HUMAN;SwissProt登录号P36955);血清淀粉样蛋白A(SAA一HUMAN;SwissProt登录号P02735);AMBP蛋白(AMBP一HUMAN;SwissProt登录号P02760);血浆视黄醇结合蛋白(RETB_HUMAN;SwissProt登录号P02753);血清转铁蛋白前体(TRFE—HUMAN;SwissProt登录号P02787);a-l-抗胰蛋白酶前体(A1AT—HUMAN;SwissProt登录号P01009);a-2-巨球蛋白前体(A2MG—HUMAN;SwissProt登录号P01023);补体C3前体(C03—HUMAN;SwissProt登录号P01024);血管紧张肽原前体(ANGT—HUMAN;SwissProt登录号P01019);铜蓝蛋白前体(CERU—HUMAN;SwissProt登录号P00450);触珠蛋白前体(HPT—HUMAN;SwissProt登录号P00738);抗凝血酶-III前体(ANT3—HUMAN;SwissProt登录号P01008);血红素结合蛋白前体(HEMO—HUMAN;SwissProt登录号P02790);a-l-酸性糖蛋白1前体(AlAG—HUMAN;SwissProt登录号P02763);载脂蛋白A-I前体(APAl—HUMAN;SwissProt登录号P02647);alb-糖蛋白(SwissProt登录号14P04217);激肽原前体(KNG—HUMAN;SwissProt登录号PO1042-2);间-a-胰蛋白酶抑制因子重链H2前体(ITH2—HUMAN;SwissProt登录号P19823);a-2-hs-糖蛋白前体(A2HS—HUMAN;SwissProt登录号P02765);a-l-抗胰凝乳蛋白酶前体(AACT—HUMAN;SwissProt登录号P01011);间-a-胰蛋白酶抑制因子重链H4前体(ITH4—HUMAN;SwissProt登录号Q14624-2);补体因子H前体(CFAH—HUMAN;SwissProt登录号P08603-l);血浆蛋白酶C1抑制因子前体(IC1—HUMAN;SwissProt登录号P05155);肝素辅因子II前体(HEP2—HUMANSwissProt登录号P05546);补体因子B前体(CFAB—HUMAN;SwissProt登录号P00751-l);a-2-糖蛋白l，锌(ZA2G—HUMAN;SwissProt登录号P25311);玻连蛋白前体(VTNC—HUMANSwissProt登录号P04004);间-a-胰蛋白酶抑制因子重链H1前体(ITH1—HUMAN;SwissProt登录号P19827);补体成分C9前体(C09—HUMAN;SwissProt登录号P02748);血纤蛋白原a/a-E链前体(FIBA—HUMAN;SwissProt登录号P02671-l);血纤蛋白原卩纟连前体(FIBB_HUMAN;SwissProt登录号P02675);血纤蛋白原y链前体(FIBG—HUMAN;SwissProt登录号P02679-l);凝血酶原前体(THRBJiUMAN;SwissProt登录号P00734);蔟蛋白前体(CLUS—HUMAN;SwissProt登录号P10909);a-lB-糖蛋白前体(AlBG—HUMAN;SwissProt登录号P04217);a-l-酸性糖蛋白2前体(A1AH—HUMAN;SwissProt登录号P19652);载脂蛋白D前体(APODJiUMAN;SwissProt登录号P05090);妊娠区带蛋白前体(PZP—HUMAN;SwissProt登录号P20742);富组氨酸糖蛋白前体(HRG—HUMAN;SwissProt登录号P04196);性激素-结合型球蛋白前体(SHBG—HUMAN;SwissProt登录号P04278-l);纤溶酶原前体(PLMN—HUMAN;SwissProt登录号P00747);载脂蛋白C-III前体(APC3—HUMAN;SwissProt登录号P02656);富亮氨酸a-2-糖蛋白前体(A2GL—HUMAN;SwissProt登录号P02750);载脂蛋白E前体(APE—HUMAN;SwissProt登录号P02649);胎球蛋白-B前体(FETB—HUMAN;SwissProt登录号Q9UGM5);肌球蛋白-反应性免疫球蛋白轻链可变区(SwissProt登录号Q9UL83);补体C1S成分前体(CIS—HUMAN;SwissProt登录号P09871);ambp蛋白前体(AMBP—HUMAN;SwissProt登录号P02760);和补体C4前体(C04_HUMAN;SwissProt登录号P01028)。在具体实施方案中，用于本发明的生物标记是补体因子H(CFAH_HUMAN,SwissProt登录号P08603);和妊娠区带蛋白(PZP_HUMAN;SwissProt登录号P20741)。在具体实施方案中，用于本发明的生物标记是补体因子H(CFAH—HUMAN,SwissProt登录号P08603);和afamin(AFAM—HUMAN;SwissProt登录号P43652)。在具体实施方案中，用于本发明的生物标记是妊娠区带蛋白(PZP一HUMAN;SwissProt登录号P20741);和a-2-hs-糖蛋白(A2HS_HUMAN;SwissProt登录号P02765)。在具体实施方案中，用于本发明的生物标记是补体因子H(CFAH—HUMAN,SwissProt登录号P08603);血管紧张肽原(ANGT—HUMAN;SwissProt登录号P01019);和簇蛋白(CLUS—HUMAN;SwissProt登录号P10909)。在具体实施方案中，用于本发明的生物标记是载脂蛋白E(APE_HUMAN;SwissProt登录号P02649);AMBP蛋白(AMBP—HUMAN;SwissProt登录号P02760);和血浆视黄醇结合蛋白(RETB—HUMAN;SwissProt登录号P02753)。在具体实施方案中，用于本发明的生物标记是补体因子H(CFAH—HUMAN,SwissProt登录号P08603);afamin(AFAM—HUMAN;SwissProt登录号P43652);血管紧张肽原(ANGTJiUMAN;SwissProt登录号P01019);和蔟蛋白(CLUS—HUMAN;SwissProt登录号P10909)。在具体实施方案中，用于本发明的生物标记是补体因子H(CFAH—HUMAN,SwissProt登录号P08603);afamin(AFAM—HUMAN;SwissProt登录号P43652);色素上皮衍生因子(PEDF—HUMAN;SwissProt登录号P36955);血清淀粉样蛋白A(SAA—HUMAN;SwissProt登录号P02735);血管紧张肽原(ANGT_HUMAN;SwissProt登录号P01019);和簇蛋白(CLUS—HUMAN;SwissProt登录号P10909)。在具体实施方案中，用于本发明的生物标记是载脂蛋白E(APE—HUMAN;SwissProt登录号P02649);AMBP蛋白(AMBPHUMAN;SwissProt登录号P02760);血浆视黄醇结合蛋白(RETB—HUMAN;SwissProt登录号P02753);血清转铁蛋白前体(TRFE—HUMAN;SwissProt登录号P02787);a-2-巨球蛋白前体(A2MG—HUMAN;SwissProt登录号P01023);和富组氨酸糖蛋白前体(HRG—HUMAN;SwissProt登录号P04196)。在具体实施方案中，用于本发明的生物标记是间-a-胰蛋白酶抑制因子重链H1前体(ITH1—HUMAN;SwissProt登录号P19827);补体成分C9前体(C09—HUMAN;SwissProt登录号P02748);血纤蛋白原a/a-E链前体(FIBA—HUMAN;SwissProt登录号P02671-l);载脂蛋白C-III前体(APC3—HUMAN;SwissProt登录号P02656);亮氨酸-富集a-2-糖蛋白前体(A2GL一HUMAN;SwissProt登录号P02750);载脂蛋白E前体(APE—HUMAN;SwissProt登录号P02649);胎球蛋白-B前体(FETB—HUMAN;SwissProt登录号Q9UGM5);和补体C4前体(C04—HUMAN;SwissProt登录号P01028)。在具体实施方案中，本发明涉及蛋白质组图语的用途，所述蛋白质组图语包括至少一种糖蛋白。在具体实施方案中，本发明涉及的在蛋白质组图镨中使用的糖蛋白选自下组唾液酸糖蛋白，甘露糖结合型糖蛋白，和O-联糖蛋白。在具体实施方案中，本发明涉及检测胎儿非整倍体，所述胎儿非整倍体是常染色体非整倍体。在还有一个实施方案中，本发明涉及检测染色体13，18或21的三体。在具体实施方案中，本发明涉及检测胎儿非整倍体，所述胎儿非整倍体是性染色体非整倍体。在还有一个实施方案中，本发明涉及检测选自下组的非整倍体X染色体三体，X染色体单体，Kleinfelter综合症(XXY基因型)，和XYY综合症(XYY基因型)。表l、唐氏综合症中的候选母体血清生物标记，从最初感兴趣的7个区域鉴定而来(图2)。对2D斑点的凝胶内消化物进行串联MS/MS分析，随后利用OpenSea进行从头测序和数据库检索，结果显示，每种蛋白在这些区域内含量相对较多。表2、在鉴定的唐氏综合症中的候选母体血清生物标记。对2D斑点的凝胶内消化物进行串联MS/MS分析，随后利用OpenSea进行从头测序和数据库检索，结果显示，每种蛋白在这些区域内含量相对较多。表3、在鉴定的唐氏综合症中的候选羊水生物标记。对2D斑点的凝胶内消化物进行串联MS/MS分析，随后利用OpenSea进行从头测序和凄丈据库检索，结果显示，每种蛋白在这些区域内含量相对较多。表4、母体中优选用于诊断胎儿唐氏综合症的血清生物标记和羊水生物标记。表5、唐氏综合症中的候选母体血清生物标记，从最初的目标区域鉴定而来(图7)。用串联MS/MS鉴定出特异性的候选生物标记。表6、唐氏综合症中的候选母体血清生物标记，从最初的目标区域鉴定而来(图8-11)。用串联MS/MS鉴定出特异性的候选生物标记。图1、来自妊娠中期三个月对照和唐氏综合症样品的母体血清的SELDI-TOF-MS分析。顶图表示来自所有4个配对病例的对照汇集物。将感兴趣的区域加框，示出潜在的峰，两组之间此峰有差异表达。图2、母体血清样品(20昭蛋白)的2-D凝胶，所述样品使用用100pmCus5(唐氏综合症)或Cy3(对照)标记的Agilent免疫亲和柱进行了纯化。在Typhoon94100扫描仪(AmershamBiosciences)中，600PMT电压下扫描凝胶。利用Phoretic2DEvolution(nonlinearDynamics)进4亍图4象;fl盖。图3、免疫-MALDI-TOF-MS分析。来自母体对照(蓝色痕迹)和唐氏综合症(红色痕迹)血清的经免疫沉淀的载脂蛋白的光语A)载脂蛋白Al、B)载脂蛋白A2、C)载脂蛋白E。图D是获自图2的2DDIGE凝胶的插图，在该凝胶中通过串连质"i普鉴定出多种载脂蛋白。图4、检测母体血清内的蛋白差异表达。2-Dwestern免疫印迹用人补体因子H抗体探测。A)对照血清妊娠中期三个月；B)唐氏综合症母体血清妊娠中期三个月。图5、唐氏综合症中候选生物标记的蛋白序列从头鉴定的示意图。光谱代表属于补体因子H的肽序列。图6、唐氏综合症中候选生物标记的蛋白序列从头鉴定的示意图。对肽序列进行序列覆盖作图，鉴定出属于补体因子H的序列。浅阴影肽是鉴定出的肽，深阴影代表这些氨基酸的潜在蛋白修饰。图7、收集的差异性2-D液相层析组分的MS分析。A)利用ProteoVue软件生成的2D-LC图，x轴显示来自CF的洗脱蛋白的pi,y轴显示来自RP-HPLC的洗脱蛋白的保留时间，或疏水性。B)对照样品的2D图，以红18色在左侧示出，DS样品的2D图以绿色在右侧示出。该图的中心显示这两种样品的差异图(在B中独立显示)，其中看到的绿色条带是在DS样品中上调的蛋白，看到的红色条带是在对照样品中上调的蛋白。图8、荧光双向凝胶图像，说明在妊娠中期三个月对照(红)和DS(绿)母体血清中总糖蛋白的差异表达。图9、荧光双向凝胶图像，说明在妊娠中期三个月对照(红)和DS(绿)母体血清中唾液酸(Sialic)-糖蛋白的差异表达。图10、荧光双向凝胶图像，说明在妊娠中期三个月对照(红)和DS(绿)母体血清中甘露糖结合型糖蛋白的差异表达。图11、荧光双向凝胶图像，说明在妊娠中期三个月对照(红)和DS(绿)母体血清中O-联糖蛋白的差异表达。图12、总糖蛋白胰蛋白酶消化产物的MALDI-TOF。对照(顶部)和唐氏综合症(底部)的母体血清。唐氏综合症中表达的肽的显著差异性被框出。图13、唾液酸糖蛋白胰蛋白酶消化产物的MALDI-TOF。对照(顶部)和唐氏综合症(底部)的母体血清。唐氏综合症中表达的肽的显著差异性被框出。图14、甘露糖结合型糖蛋白胰蛋白酶消化产物的MALDI-TOF。对照(顶部)和唐氏综合症(底部)的母体血清。唐氏综合症中表达的肽的显著差异性被框出。图15、O-联糖蛋白胰蛋白酶消化产物的MALDI-TOF。对照(顶部)和唐氏综合症(底部)的母体血清。唐氏综合症中表达的肽的显著差异性被框出。图16、母体血清样品(20jig蛋白)的2-D凝胶，所述样品使用用100pmCus5(18三体)或Cy3(对照)标记的Agilent免疫亲和柱进行了纯化。在Typhoon94100扫描仪(AmershamBiosciences)中，600PMT电压下扫描凝胶。利用Phoretic2DEvolution(nonlinearDynamics)进4亍图i"象《隻盖。图17、母体血清样品(20昭蛋白)的2-D凝胶，所述样品使用用100pmCus5(13三体)或Cy3(对照)标记的Agilent免疫亲和柱进行了纯化。在Typhoon94100扫描仪(AmershamBiosciences)中，600PMT电压下扫描凝胶。利用Phoretic2DEvolution(nonlinearDynamics)进4亍图《象覆盖。图18、母体血清样品(20昭蛋白)的2-D凝胶，所述样品使用用100pmCusS(神经管缺陷)或Cy^对照)标记的Agilent免疫亲和柱进行了纯化。在Typhoon94100扫描仪(AmershamBiosciences)中，600PMT电压下扫描凝胶。利用Phoretic2DEvolution(nonlinearDynamics)进4亍图i象覆盖。优选实施方案的详细描述A,M除非另外定义，在此所用的科技和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。对于在本申请中所使用的许多术语，Singleton等,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology第2版,J.Wiley&Sons(纽约，NY1994)给本领域技术人员提供全面的教导。术语"蛋白组(proteome)"用于此是描述在指定时间内，生物样品中的蛋白的重要部分。蛋白组的概念从根本上区别于基因组。基因组实质上是静止的，而蛋白组对内部和外部事件相应时，持续地发生改变。术语"蛋白质组图谱(proteomicprofile)"用于此是指在指定时间内，生物样品如生物液体中的大量蛋白的表达图语的表示。蛋白质组图语可以如被表示为质语，但也包括基于蛋白或其片段的任何物理化学或生物化学特征的其他表示方法。因此，蛋白质组图谱可以例如基于蛋白的电泳特征的差别，这可通过双向(two-dimensional)凝胶电泳例如2-DPAGE确定，而且可以被表示为例如双向凝胶电泳中的大量斑点。另外，蛋白质组图谱可以基于蛋白等电点和疏水性的差别，这可通过双向液相层析确定，而且可以被表示为例如计算机生成的虚拟二维图像。还可以将基于凝集素的亲和纯化与本文所述技术相结合来获得蛋白质组图谱，这样的图谱能突出显示生物样品中发现的各种蛋白的特异性糖基化特性。差别表达图谱具有重要的诊断价值，即使缺乏特别鉴定的蛋白时也是如此。之后，单个蛋白斑点或层析洗脱液可以通过例如免疫印迹来4企测，多个斑点、洗脱液或蛋白可以用蛋白微阵列来鉴定。蛋白质组图谱通常表示或含有信息，所述信息可以是从少数峰到表示50个或更多峰的复杂图谱。因此，例如，蛋白质组图谱可含有或表示至少2种，或至少3种，或至少4种，或至少5种，或至少6种，或至少7种，或至少8种，或至少9种，或至少10种，或至少15种，或至少20种，或至少25种，或至少30种，或至少35种，或至少40种，或至少45种，或至少50种蛋白等等。术语"独特表达特征(uniqueexpressionsignature)"用于描述生物样品(例如参比样品或待测样品)的蛋白质组图谱中的独特特征或基序，它们在统计学上显著区别于相应正常生物样品(从相同类型来源例如生物液体获得)的蛋白质组图谱。术语"正常蛋白质组图谱"是指从与待测样品类型相同的母体生物液体获得的生物样品的蛋白质组图谱，所述母体生物液体从妊娠妇女荻得，该妇女所怀胎儿不具有非整倍体或其它染色体畸形。术语"参比蛋白质组图谱"是指从与待测样品类型相同的母体生物液体获得的生物样品的蛋白质组图镨，所述母体生物液体从怀有非整倍体胎儿的妊娠妇女获得。"患者反应"可以用代表了对患者的益处的任何终点来评价，包括但不限于，(l)抑制(至少在一定程度抑制)病理性症状的进展，(2)预防病理性症状，(3)减轻(至少在一定程度减轻)一种或多种与病理性症状相关的症状；(4)延长治疗后的存活时间；和/或(5)降低治疗后指定时间点的死亡率。术语"治疗"是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其目的在于阻止或减緩(减轻)所靶向的病理性症状或异常。需要治疗的那些症状包括已经出现异常的那些以及倾向于发生异常的那些或需要防止异常的那些。"先天性畸形(congentialmalformation)"是指一种异常，它并非遗传、但出生时就有。诊断分析的"灵敏度"或"诊断灵敏度"定义为，所述测试从已患有疾病的患者中发现该疾病的可能性，或者测试结果阳性的患病者的比例。在统计学术语中灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)。术语"一或多"用于本文的蛋白质组图谱、蛋白标记和独特表达特征时，是指任意排列的一种、两种、三种、四种、等等组内所列成员。因此，术语"一或多"包括任意两种，任意三种，任意四种等的组内所列具体成员。当整个说明书和权利要求列出了具体的亚组时，没有任何限制。应强调的是，术语"一或多"是以最宽泛的理解使用的，并用于指明任何在具有多个成员的组内的亚组。同样，术语"至少2个"，"至少3个"，"至少4个"等覆盖了具体组内的任意成员组合，条件是该组合内的成员总量是至少3个，至少3个，至少4个等。B.详细描述本发明涉及用于根据母体生物液体的蛋白质组图谱，早期、可靠和非侵入性地检测胎儿唐氏综合症和其它染色体非整倍体的方法和装置(means)。本发明利用本领域熟知的蛋白组技术，可参见例如下列教科书，其内容在此引入作参考ProteomeResearch:NewFrontiersinFunctionalGenomics(PrinciplesandPractice),M.R.Wilkins等，编辑，SpringerVerlag，1007;2-DProteomeAnalysisProtocols,AndrewLLink,编辑，HumanaPress,1999;ProteomeResearch:Two-DimensionalGelElectrophoresisandIdentificationMethods(PrinciplesandPractice),T.Rabilloud编辑，SpringerVerlag,2000;ProteomeResearch:MassSpectrometry(PrinciplesandPractice),P.James编辑,SpringerVerlag,2001;IntroductiontoProteomics,D.C.Liebler编辑，HumanaPress,2002;ProteomicsinPractice:ALaboratoryManualofProteomeAnalysis,R.Westermeier等,编辑，JohnWiley&Sons，2002。本领域技术人员将会认识到，许多与在此描述的那些类似或相当的方法和材料可用于实施本发明。实际上，本发明无论如何不限制于所描述的方法和材料。1.,定^務濕体^^^W蛋冷和/炎按照本发明，可以用各种本领域已知的方法来进行生物液体的蛋白组分析。通常，比较不同来源的样品(例如正常生物液体(正常样品)和待测生物液体(待测样品))的蛋白模式(蛋白质组图谱)，以检测疾病中上调或下调的蛋白。然后，切取这些蛋白，采用例如肽质量指紋识别和/或质语分析和测序方法进行鉴定和完全表征，或者直接用正常的和/或疾病特异性的蛋白质组图谦^^断目标疾病，或者证实这种疾病的存在与否。在比较分析中，重要的是用完全相同的方式处理正常样品和待测样品，以恰当表示相对丰富的蛋白，获得精确的结果。所需的总蛋白量取决于所用的分析技术，本领域技术人员可以很容易地确定。生物样品中的蛋白通常根据其pl和分子量通过双向凝胶电泳(2-DE)分离。蛋白首先根据其电荷用等电聚焦(一向凝胶电泳)分离。该步骤可以用例如可商购的固相pH-梯度(IPG)条带(strip)来进行。第二向是常规SDS-PAGE分析，其用聚焦的IPG条带作样品。2-DE分离后，蛋白可用传统染料例如考马斯蓝或者银染色来观察，并用已知技术和设备如Bio-RadGS800密度计和PDQUEST软件(它们都可商购)成像。然后，从凝胶上切取单个的斑点，脱色，用胰蛋白酶消化。通过质i普(MS)分析所述肽混合物。比较分析的替代方法以及这多种方法的组合也可以在本发明的范围内使用。例如，生物样品中的蛋白可根据以下实施例II所述的其等电点和疏水性通过双向液相层析分离。当然，层析分离可以不需要根据疏水性，因为本领域已知有广泛多种分离材料，包括但不限于，能基于分子量、pH或特异性结合亲和力如抗体-抗原相互作用进行分离的材料。另外，一旦完成了最初的分离步骤，可将存在于单独斑点或洗脱样品内的肽通过毛细管高压液相层析(HPLC)来分离，并单独或者汇集在一起进行MS分析。如实施例III所详述，糖基化是真核细胞中重要的翻译后蛋白修饰，因此分离和鉴定生物样品糖基化状态的系统可以作为发掘蛋白生物标记的宝贵工具。基于凝集素的亲和纯化是用于分离不同种类糖基化蛋白的可选方法，因为其能特异地且可逆地与糖蛋白中的聚糖部分相结合。可从待测样品中单独分离出主要种类和类型的糖蛋白，且一旦分离，就可以用质谱法生成差异性的糖基化图语，以便对对照和疾病进行比较。如下文所述，本领域已知广泛多种凝集素及其特性。这些凝集素中的一种或多种，以及这些和其它凝集素的任何可能的排列组合，都可在本发明实践中使用。已知甘露糖结合型凝集素包括但不限于来自伴刀豆(Ca朋va/7ae"w/om^)的伴刀豆球蛋白A,其结合支链a-甘露糖结构，高甘露糖型，以及杂合型和双天线复合体型N-聚糖；来自兵豆(丄eracM"wan;y)的兵豆凝集素，其结合双天线-和三-天线复合体型N-聚糖的岩藻糖核心区；和来自雪花莲fU"/朋A^w'v"/^的雪花莲凝集素，其结合a1-3和a1-6联高甘露糖结构。半乳糖/N-乙酰半乳糖胺结合型凝集素包括但不限于来自蓖麻的蓖麻凝集素(RCA，)，其结合Gal(31-4GlcNAc(31-R;来自花生(^rac/^/7，ogae")的花生凝集素，其结合Gal(31-3GalNAccd-Ser/Thr(T-抗原)；来自术菠萝(Jrtocarpw/"tegn/o/Za)的菠萝蜜凝集素，其结合(Sia)Gal卩l-3GalNAcal-Ser/Thr(T-抗原)；和来自毛苕子(Wc/av/〃asa)的毛苕子凝集素，其结合GalNAca-Ser/Thr(Tn-抗原)。唾液酸/N-乙酰葡糖胺结合型凝集素包括但不限于来自麦胚(7VWcMmvw/gan》的麦胚凝集素，其结合GlcNAcp1-4GlcNAc(31-4GlcNAc，和Neu5Ac(唾液酸)；来自4妻骨木花(&w^MCM刚'gra)的接骨木凝集素，其结合Neu5Aca2-6Gal(NAc)-R;来自山斗鬼(i^""ch'""wweraz;f)的山槐凝集素，其结合Neu5Ac/Gca2-3Gal卩l-4GlcNAc卩l-R。岩藻糖结合型凝集素包括但不限于来自荆豆(Wexewro;aeM力的荆豆凝集素，其结合Fucal々Gal-R;来自橙黄网孢盘菌(」/wn'"，raw"a)的橙黄网孢盘菌凝集素，其结合Fucal-2Gal(31陽4(F職l-3/4)Gal卩l-4GlcNAc,和R2画GlcNAc(31隱4(F職l-6)GlcNAc-Rl。质谱分析仪由离子源、质量分析器、离子检测器，和数据获取单元组成。首先，在离子源中使肽离子化。然后，在质量分析器中按照其质量与电荷的比例，分离所述离子化的肽，检测分离的离子。质语分析被广泛地应用于蛋白分析，特别是从发明了基质辅助的激光吸附电离/飞行时间(MALDI-TOF)和电子喷射电离(ESI)方法以来。有多种版本的质量分析器，包括，例如MALDI-TOF和三极或四极-TOF，或偶联到ESI上的离子捕获质量分析器。因此，例如Q-Tof-2质谱仪采用一种正交的飞行时间分析器，该分析器使得可以在整个质语范围内同时检测离子。进一步的详细描述，参见例如Chemusevich等，/Ma^36:849-865(2001)。如果需要，肽片段和甚至该片段所来源的蛋白的氨基酸序列可以通过本领域已知的技术例如质谱法的某种改变形式或Edman降解来确定。从质谱^:据确定分子序列的方法公开在2004年2月27日申请、待审的No.10/789,424中，其全部公开在此引入作为参考。该方法包括从头(tfe"ow)测序和数据库检索，还可用于鉴定序列变化和未知蛋白，其不是完整序列但与序列数据库中序列有高度序列同源性。2.染逸##整倍#染色体畸形是围产期发病率和死亡率的频繁诱因。在200名活出生儿中，染色体畸形的发生率为l。这种畸形的重要原因是染色体非整倍体，从双亲遗传得到异常数量的染色体。最常见的染色体非整倍体之一是21三体(唐氏综合症)，在800名活出生儿中有1名患有该病(HookEB,HamertonJL:Thefrequencyofchromosomeabnormalitiesdetectedinconsecutivenewbornstudies:Differencesbetweenstudies:Resultsbysexandbyseverityofphenotypicinvolvement.InHookEB，PorterIH(编辑)PopulationCytogenetics,第63-79页.纽约，AcademicPress,1978)。21三体的最主要危险因素是母体年龄超过35岁，但是80%患21三体的儿童是由年龄小于35岁的妇女生育的。其他常见的非整倍体症状包括13三体和18、Turner综合症和Klinefelter综合症。3.^/^:參濕体的蛋冷,jg^潘成'^參濕沐##定的兰參标记,錄應乂乙本发明提供用于通过蛋白组分析生物液体，诊断胎儿染色体非整倍体的早期、可靠和非侵入性的方法，生物液体例如妊娠女性的羊水、血清、血浆、尿液、脑脊髓、乳汁、粘液或唾液。如前面指出，在本发明的内容中，所用的术语"蛋白质组图语"是指在指定时间，生物样品如生物液体中的大量蛋白的表达图谱的表达特征。蛋白质组图谱可以例如被表示为质谱，但是还包括基于蛋白的任何物理化学或生物化学特征的其他表示方法。虽然，有可能鉴定和测序在生物液体的蛋白组中存在的蛋白的全部或一些，但对于按照本发明产生的蛋白质组图镨的诊断用途来说是不必要的。当存在将要被诊断的染色体非整倍体诸如胎儿唐氏综合症时，诊断可以基于正常的蛋白质组图i普和从相同条件下获得的同样的生物液体的蛋白质组图谱之间的特征性差异(独特的表达特征)。独特的表达特征可以是在待测生物样品或参比生物样品的蛋白质组图i普中的任何独特的特征或基序，其在统计学上显著区别于从相同类型来源获得的相应正常生物样品的蛋白质组图谱。例如，如果蛋白质组图谱以质谱的方式表示，独特的表达特征通常是峰或者多个峰的组合，在数量和质量上区别于相应的正常样品的质谱。因此，质语中出现新峰或者新峰的组合，或者质谱中所存在的峰或者所存在的峰的组合的振幅或形状的统计学上的显著改变，被认为是独特的表达特征。当将从妊娠雌性受试者获得的待测样品的蛋白质组图谱与包含染色体非整倍体的独特表达特征的参比样品的蛋白质组图语相比时，如果待测样品与参比样品共有独特的表达特征，则诊断该胎儿患有这种染色体非整倍体。特定的染色体非整倍体，如胎儿唐氏综合症，可以通过将从将被检测的母体受试者获得的生物液体的蛋白质组图谱与相同种类的并用相同方式获得和处理的正常生物液体的蛋白质组图谱比较来诊断。如果待测样品的蛋白质组图谱与正常样品的蛋白质组图谱基本上相同，该胎儿被认为未患有所检测的染色体非整倍体。如果待测样品的蛋白质组图语相对于正常样品的蛋白质组图谱具有独特的表达特征，该胎儿被诊断为患有染色体非整倍体。可替代地或另外地，可将待测样品的蛋白质组图谱与参比样品的蛋白质组图谱比较，该参比样品从被独立地诊断为患有所谈论的症状的妊娠雌性的生物液体中获得。在这种情况下，如果待测样品与参比样品的蛋白质组图语共有至少一种特征或者表示独特表达特征的组合，则该胎儿被诊断为患有病理性的症状。在本发明的方法中，正常生物样品的蛋白质组图谱具有重要的诊断作用。如上所讨论，如果待测样品的蛋白质组图语与正常生物样品的蛋白质组图谱实质上相同，则该胎儿被诊断为未患有指定的染色体非整倍体。对数据进行分析，从而确定差别是否具有统计学显著性。在分析前，用常规的蛋白分离方法，去除以实质上相同表达水平存在于正常的和患病蛋白组中的蛋白(共同蛋白，例如清蛋白和免疫球蛋白)，可以提高本发明的诊断方法的灵敏度。去除这类并非独特表达特征部分的共同蛋白，可导致灵敏度和诊断精确度提高。可替代地或另外地，在计算分析结果的过程中，可以消除共同蛋白的表达特征(或者去除信号)，通常采用光谱选择算法，其按照相应原理获得诊断结果。在下面实施例中详述的结果显示出非整倍体特征性的蛋白质组图谫，其在统计学上显著地区别于正常母体血清或羊水的蛋白质组图语。此外，实施例和附图鉴定出了多个生物标记，生物标记组，和非整倍体的独特表达特征。比较蛋白质组图谱的统计学方法在本领域是公知的。例如，在质谱的情形下，蛋白质组图谱被定义为光谱水平轴上的关键质量/电荷(M/Z)位置上的峰振幅值。因此，特征性蛋白质组图谱可以用由给定M/Z值上的光谱振幅的组合形成的模式来表征。通过用合适的算法，比较待测样品的蛋白质组图谱(模式)与参比或正常样品的蛋白质组图谱(模式)，来确定特征性表达特征存在与否，或者两种图谱是否基本上相同。公开了用于分析蛋白质组图谱的统计学方法，例如在PetricoinIII,等，77ze丄朋ce。59:572-77(2002).;Issaq等，5/oc/zezw5/op/z;^sCo附ww"292:587-92(2002);Ball等，5z.o/"ybrma"cs18:395-404(2002);和Li等，C"m'ca/C7zem^^yJowtw/,48:1296-1304(2002)中。26在具体实施方案中，将从母亲获得的样品应用于蛋白芯片，通过质谱分析生成蛋白组模式。如上所述，用合适的生物信息软件分析光谱中的峰的模式。下面实施例中所呈现的数据提供了胎儿非整倍体的多种独特的表达特征。例如，如图所示，正常母体血清和当胎儿患有非整倍体时的母体血清，它们的质谱在约125-150kD(区域1),约60-68kDa(区域2)，约50-55kDa(区域3),约40-45kDa(区域4),约38-42kDa(区域5),约16-20kDa(区域6),和约35-35kDa(区域7)的分子量范围内具有特征性差异。在羊水中，特征性表达特征在约6-7kDa和/或8-10kDa的分子量范围内。因此，可以用整个质谱，或一或多个各自表示独特表达特征的所列区域，以及母体血清，来诊断胎儿非整倍体。另外，含有任意组合的所述表达特征或区域1-7中的一或多个区域的质谱，可以作为胎儿非整倍体诊断方法中的阳性对照。另外，或可替代地，诊断非整倍体的方法可以包括检测在怀有患非整倍体病的胎儿的雌性的生物液体(简称"非整倍体生物液体")内差异表达的一种或多种蛋白，或所述差异表达蛋白的片段。差异表达包括过表达和表达不足，条件是在非整倍体的生物液体内的蛋白表达水平相比相同类型的正常的生物液体的表达水平存在特征性差异。适于用母体血清检测胎儿非整倍体的生物标记列于表1,2,和5-6中。适于用母体羊水检测胎儿非整倍体的生物标记列于表3中。分别在母体血清和羊水中存在的优选生物标记列于表4中。诊断试验可以基于，或者利用列于表1-6中的一种或多种多肽作为试验的一部分。在具体实施方案中，列于表1-6中的1-20，或1-15,或1-20，或1-15或1-10,或1-9,或1-8，或1-7,或1-6，或1-5,或1-4,或1-3,或1或2种生物标记被单独使用或与其它非整倍体生物标记组合使用，或者与一种或多种非整倍体的独特表达特征一起使用。生物标记的潜在组合实例包括下述补体因子H和妊娠区带蛋白；补体因子H和afamin;妊娠区带蛋白和a-2-hs-糖蛋白；补体因子H,血管紧张肽原，和簇蛋白；载脂蛋白，AMBP蛋白，和血浆视黄醇结合蛋白；补体因子H,afamin，血管紧张肽原，和簇蛋白；补体因子H,afamin，色素上皮衍生因子，血清淀粉样蛋白A,血管紧张肽原，和簇蛋白；载脂蛋白E,AMBP蛋白，血浆视黄醇结合蛋白，血清转铁蛋白前体，ot-2-巨球蛋白前体，和富组氨酸糖蛋白前体；间-a-胰蛋白酶抑制因子重链HI前体，补体成分C9前体，血纤蛋白原a/a-E链前体，载脂蛋白C-III前体，富亮氨酸a-2-糖蛋白前体，载脂蛋白E前体，胎球蛋白-B前体，和补体C4前体。但应指出，本发明并不限于这些实例，而且所有可能的组合的排列都能用于本发明。如上所述，不同生物标记和/或特征性表达特征的组合可能会显著地改善诊断精确度。例如，通常单独的生物标记可以一企测发生的约30%-80%的胎儿非整倍体，如唐氏综合症。利用组合或生物标记和/或特征性表达特征，诊断的精确性可以达到至少约80%，更优选至少约85%,甚至更优选至少约90%，甚至更优选至少约95%,最优选至少约98%。通过独特的生物路径来独立起作用的生物标记组合是特别有优势的，因为预计这种组合能显著地增加诊断灵敏度。以基本相同的检测速度将本发明的诊断方法同样地应用于妊娠头三个月和妊娠中期三个月。虽然在单独使用时本发明的筛选方法具有惊人的检测速度和精确度，但它们还可以与现有的筛选技术组合来检测胎儿非整倍体。因此，本文的诊断方法可以与一种或多种已知的生物标记组合，比如在唐氏综合症或18三体情形下，与血清生物标记PAPP-A,曱胎蛋白(AFP),人绒毛膜促性腺激素(PhCG)，非偶联雌三醇(uE3),和抑制素A中的一种或多种的组合。具体地说，本筛选技术可以与利用PAPP-A和phCG作为独立生物标记的检测进行组合，或者与基于AFP、phCG和uE3的三标记血清检测进行组合，尤其当在妊娠中期三个月进行筛选时更是如此。所述检测可以另外地或者可替代地包括抑制素-A。可与本文所述的诊断方法联合来鉴定其它非整倍体的标记为本领i或所熟知。本文的筛选分析可以进一步组合或补充临床或实验室检测胎儿非整倍体的其它技术，包括经腹超声和经半透明带超声等超声影像技术；各种用于检测染色体畸形的技术；和颈项半透明带(NT)测定。4.蛋^和祐#^/{/上面讨论的诊断分析可以采用蛋白阵列来进行。近年来，蛋白阵列被公认是检测蛋白、监控蛋白表达水平，和研究蛋白相互作用和功能的有力手段。采用自动化手段，可以同时进行大量检测，进行高通量的蛋白分析。在最早开发用于DNA阵列的微阵列或芯片形式中，可以用最少材料进行这种检测，而获得大量数据。虽然，如上所述通过2D凝胶电泳，2D液相层析，和质谱进行蛋白组分析是非常有效的，但是并不总是产生所需的高灵敏度，并且会丢失许多以低丰度表达的蛋白。蛋白微阵列除了其高效率外，还提供了改进的灵敏度。蛋白阵列是用各种本领域熟知的共价和非共价的连接化学方法，通过将蛋白固定在固体表面上形成的，所述固体表面例如玻璃、硅片、微孔板，硝酸纤维素，PVDF膜，和微珠。固体支持物在进行偶联操作前后应当是化学稳定的，允许获得良好的斑点形态，显示最少的非特异结合，不在检测系统中产生背景，并且与不同检测系统相容。总之，蛋白微阵列采用与通常用于读取DNA阵列相同的检测方法。类似地，将与用于读取DNA阵列相同的仪器应用于蛋白阵列。因此，捕获阵列(例如抗体阵列)可用荧光标记的来自两种不同来源(例如来自正常的或患病的生物液体)的蛋白来探查。在这种情形下，读数是基于荧光信号的改变，反应目标蛋白的表达水平的改变。可替代的读数包括，但不限于荧光共振能量转移、表面等离子体共振、滚环(rollingcircle)DNA扩增、质语分析、共振光散射，和原子场显微镜检(atomicforcemicroscopy)。进一步详细描述参见，例如ZhouH，等，7>eA历o,ec/wo/.19:S34-9(2001);Zhu等，Cwre"/(9;9/w.C7zem.所o/.5:40-45-(2001);Wilson和Nock,血，C/z，/"/W42:494-500(2003);以及Schweitzer和Kingsmore,Cm〃Qp/"5/Wec/wo/13:14-9(2002)。生物分子阵列还被公开在美国专利6,406,921，2002年6月18日出版，其全部内容引入作为参考。根据如下非限制性实施例，本发明的其他详细内容将是显而易见的。实施例I鉴定母体血清和羊水样品中的蛋白和多肽才才#+禾口方法评价的母体血清和羊水样品(与孕龄匹配)。_对照_唐氏综合症妊娠头三个月2525妊娠中期三个月2525入清中吝羊if冷的i^清,利用Agilent多元亲和体系，清除了人血清中的6种主要蛋白(清蛋白，IgG，IgA,抗胰蛋白酶，运铁蛋白，和触珠蛋白)。该多元亲和柱是基于抗体-抗原相互作用，并对用于样品上样、洗涤，洗脱和再生的援沖液进^f亍了优化。该柱从人血清中除去了6种高丰度蛋白(总蛋白重量的80-90%)，如清蛋白，IgG,IgA,抗胰蛋白酶，运铁蛋白，和触珠蛋白，从而可以将低丰度蛋白富集起来用于蛋白组分析。人血清(40pl)用Agilent緩沖液A稀释5倍(35ji1血清用180^1緩冲液A稀释)。用0.22pm自旋过滤器以16，000xg,1分钟将颗粒过滤掉。将160^1稀释血清注入连接着WatersHPLC体系的Agilent免疫亲和层析柱(4.6x100mm),所述WatersHPLC体系装备有自动进样器，UV探测器，和组分收集器。流速设置为前IO分钟时按照0.5ml/分钟使用0%B，10-17分钟时按照lml/分钟使用100%B，17-28分钟时按照lml/分钟使用0%B。收集4氐丰度流通组分2-5，用5000MWCO过滤器浓缩，并将緩沖液换成10mMTris，pH8.4。蛋白浓度利用Bio-RadDC蛋白分析试剂盒测定。處^如上所述，用Agilent免疫亲和柱去除来自血清的高丰度蛋白(l-3mg)。然后，将血清蛋白(20-50吗)以100-400pm染料/20-50吗蛋白的浓度用CyDyeDIGEFluorminimaldye(AmershamBiosciences)标记。用不同染料(Cy5，Cy3，和Cy2)标记对照或一企测或参照血清样品。将标记的蛋白用丙酮沉淀纯化，溶于IEF緩冲液，经室温12小时而再水合到24或13-cmIPG条带(pH4-7)上。之后，将IPG条带在65-70kVhrs进行l-向电泳。然后在15分钟内将IPG条带先后用DTT平衡緩冲液I和IAA平衡緩沖液II平衡，再进行第二向SDS-PAGE分析。然后将IPG条带加载到8-16%SDS-PAGE凝胶上，在80-90V电泳18小时，从而在第二向(dimension)中分辩出蛋白。在第二向后，凝胶用合适激光器和过滤器，以550-600伏PMT,在Typhoon9400扫描仪(Amersham)中扫描。利用选定的颜色来覆盖不同通道(对照和检观'J)中的图像，利用ImageQaunt软件(AmershamBiosciences)对差异进行监测。利用Evolution软件(NonlinearDynamics)对凝月交图像进4亍定量。进行蛋白鉴定时，血清蛋白(500g-1500吗)不经标记就实施2-DGE。将凝胶用考马斯蓝R-250染色，并成像。从凝胶上切取单个的斑点，脱色，在凝胶内用胰蛋白酶37。C消化24小时。肽用0.1。/oTFA提取，并用Millipore的ZipTipcl8移液管尖头进行纯化。50-100|ig血清蛋白在4-20%SDS-PAGE上200V电泳60分钟，经90mA75分钟转移到PVDF膜上。该膜用5%乳-PBST室温封闭45分钟，用1pg/ml第一抗体(SantaCruzandDako)4。C孵育过夜。用TBST洗涤3次后，该膜用IgG-HRP第二抗体(Sigma)室温孵育卯分钟，用ECL(Pierce)观察。免疫沉淀中，将20吗第一抗体与600(ig血清蛋白混合，4。C孵育过夜。然后加入15(^1蛋白G-Sepharose珠，室温摇床孵育60分钟。将所述珠用IP緩冲液洗涤6次，之后进^于洗ft和PAGE。母沐A清的孤D/-r(9F为Vi将来自羊水和血清样品的总共0.5-3.0吗蛋白点样到常相NP20(SiO2表面)、反相H4(疏水表面C-16(长链脂肪族)，或固定相镍(IMAC)SELDIProteinChip⑧芯片(CiphergenBiosystems，Inc.,Fremont,CA)上。室温孵育1小时后，用5^1水洗NP1和H4芯片，去除未被结合的蛋白和干扰物质(即緩冲液、盐、表面活性剂)。在空气中干燥2-3分钟后，加入两份0.5pl的溶于50。/。乙腈(v/v)、0.5%三氟乙酸(v/v)的饱和芥子酸溶液，在CiphergenProteinBiologySystemII(PBSII)中，用飞行时间质谱仪(time-of-flightmassspectrometry)进行质量分析。ICAT是最近发展起来的一种补充技术，它通过为对照和患病样品中差异表达的蛋白提供蛋白鉴定和量化数据来克服2DGE的一些局限性。ICAT肽标记技术利用具有不同同位素组成的反应探针来区分两群蛋白。使用可从AppliedBiosystems商购的可切除的ICAT试剂，该试剂由蛋白-反应基团(碘乙酰胺)，"C或13C同位素标记的连接区，和亲和(生物素)标签组成，所述蛋白-反应基团可将蛋白上的游离半胱氨酸烷基化，从而选择性地分离含半胱氨酸的肽。对照样品和患病样品分别用轻fC)或重("C)同位素ICAT试剂处理。然后将标记的蛋白混合物混和，用蛋白酶水解。接着，利用固相单体抗生物素蛋白对生物素化肽进行亲和捕捉，以此分离出标记的肽。然后，将标记肽上的生物素标记切除，利用纳级液相层析结合电喷射离子化串联质谱(LC-ESIMS/MS)对该肽进行分析。获得的MS和MS/MS谱用MCAT软件(Waters)分析，确定对照样品和患病样品中成对标记肽的相对丰度，在蛋白序列大数据库中检索以鉴定出该蛋白。所述对照作内参，使用于比较分析的蛋白丰度水平标准化。丰度比率的增加或降低可提供有关上调或下调的信息。蛋白鉴定炎拔来桌和为Vvf用胰蛋白酶在凝胶内消化后，在连接到WatersCapLC上的Waters杂交四极飞行时间质谱仪(Q-Tof-2)中分析样品。Q-Tof-2装备了常规的Z-喷雾或纳米喷雾源，并且连4妻到Integrafrit或NanoeaseC1875{imIDx15cmx3.5(im融合硅毛细管柱上。该仪器由安装了WindowsNT和MassLynx4.0软件的Compaq工作站控制，并在该工作站获取数据。Q-Tof-2用从相连的CapLC中直接灌入或注入的Glul血纤维蛋白肽(Fibrinopeptide)B校准。用MS/MSMS测量方法(surveymethod)来获取MS/MSMS语。MS测量中扫描400-1500Da,MS/MS中扫描50-1900Da。在安装了Windows2000和ProteinLynxGlobalServerv2.1(PLGS)以及PEAKS从头测序算法和我们独有的OpenSea软件vl.l(Searle等，AnalyticalChemistry76:2220-2230(2004))的PC上进行原始数据分析。利用PLGSv2.1软件(Waters)对串联质谱(MS/MS)进行自动分析。处理参数在不扣除任何背景的情况下中速或慢速脱去同位素。处理后，利用具有数据检索和自动改造(automod)的工作流程(workflow)，在无冗余的国际蛋白索引(IPI)人类数据库(20)中检索无同位素的MS/MS谱。在该工作流程中，固定修饰是脲基曱基(carbamidomethyl)C,可变修饰是氧化M和磷酸化STY。在检索数据库后，利用非特异性初级消化剂进行自动改造查询，以便检索到所有可能的修饰和取代。32OpenSeamass-basedalignmentalgorithmvl.l通过将用PEAKS乂人戶斤述凄t据衍生的序列与数据库中的蛋白序列从头比对，从多个肽的MS/MS数据中鉴定蛋白。OpenSea将所有的氨基酸字符转换成一组质量，这些质量利用动态编程法进行比较。矛J用PeaksBatchVersion2.2(Ma等，AneffectivealgorithmforthepeptidedenovosequencingfromMS/MSspectrum,in14thSymposiumofCombinatorialPatternMatching,2003;Nelson等，AnalyticalChemistry67:1153-8(1995))(BioinformaticsSolutionsInc.,Waterloo,ON,Canada),以0.1AMU的质量精度，对所有Q-TOFMS/MS谱进行从头测序。Peaks报告了完整氨基酸序列，其中不含未知质量区域，但给该序列中每个氨基酸分配一个置信值。将氨基酸置信值低于50%的序列区域，用这些氨基酸的组合质量来取代。如果整个序列的平均置信度低于50%，仅将置信度低于平均置信度的氨基酸组合。所有序列利用单同位素质量用OpenSea进行分析，以便算出假想的父本和片段质量，并且与0.25AMU的质量精度相匹配。所有样品都在无冗余的国际蛋白索引(IPI)人类数据库中进行检索。用于鉴定蛋白的参数如下l)将蛋白描述中包括一串"角蛋白"的任何数据库匹配排除；2)每种蛋白用PLGSv2.1和OpenSeavl.l算得的出现可能性都应该大于95%;和3)每种蛋白应该具有两种或多种肽。用于检测生物标记的基于质谌的免疫亲和分析利用2-DGEDIGE实验鉴定的，在母体对照和唐氏综合症血清中差异表达的蛋白生物标记适合开发基于蛋白图语的高通量筛选体系，以便用于检测胎儿唐氏综合症。单个蛋白生物标记是通过免疫亲和纯化而从母体血清中获得的，并通过基质辅助的激光吸附/电离飞行时间质谞(MALDI-TOFMS)进行分析。岸品參^^记^^沉/定为V^f以700xg离心血清样品15分钟，沉淀血细胞。将上清液储存在-80。C。每份血清样品(对于每种生物标记耙而言最多取50iiL)都用结合緩沖液稀释，并与经50吗偶联抗体衍生的免疫亲和珠(Pierce;Rockford,IL)孵育。利用低pH的离液緩冲液将唐氏综合症靶蛋白从免疫亲和珠中洗脱出来。利用ZipTipC4移液管尖头(Millipore;Billerica，MA)将洗脱液脱盐和浓缩，直接点至(与芥子酸基质一起)疏水/亲水对比MALDI-TOFMS革巴标(AnchorChipMTPtargetplate,BrukerDaltonics;Billerica,MA)上。AnchorChip靶标促进样品平均分布和晶体化，获得更高灵壽丈度的MALDI-MS语，更少地依赖于手动的"最佳点"检索，从而使得分析更趋近于高通量自动模式。MILD/-7UFMS为Vf洗脱的完整蛋白生物标记的MALDI-TOFMS分析是在AutoflexMALDI陽TOF-MS质谱仪(BrukerDaltonics;Billerica,MA)上进行的。AutoflexMALDI-TOF-MS的分辨率规格(细胞色素c的分辨率=1000,12361Da,Rs=m/Am(FWHM))可以对蛋白同工型和修饰进行检测。例如，Nelson和同事能够分辨出质量仅差53Da的同工型载脂蛋白E(ApoE2和ApoE3同工型分别为34,236.6和34,183.6Da)(228A.T.B.n,Afa&r"a/screem>g./"爿COG1996WashingtonD.C.:AmericanCollegeofObstreticiansandGynecologists)。该MALDI-MS以线性延时提取模式进行操作，具有阳性极性(positivepolarity),以便检测大的多肽和蛋白(>m/z5000)。利用减弱的可调50-Hz氮激光(337nm)、按100-200次照射Ai普，来获得质谱。考虑到适当的信噪比，根据目标生物标记靶标特异性的强度水平将多个质镨组合。所用BrukerMALDI-TOF质谱仪在线性检测模式下的质量准确度(用于检测较高质量肽/蛋白>m/z5000)为<100ppm,其利用了内部校准(细胞色素c,m/z12,361)。外部校准利用BrukerMTPAnchorChipTM靶标平板上的每组4个样品孔间的校准锚(anchor)来进行的。来自对照和唐氏综合症样品的所得MALDI-MS生物标记离子信号的处理后分析是利用ClinProTools软件(BrukerDaltonics;Billerica,MA)进行的。结果A)1^/^)/-7^尸者渗分浙蛋^逸#，乂乂而^^测唐^祭合症。为了分别鉴定代表对照和唐氏综合症的蛋白图谱，首先如方法中所述，利用Agilent免疫亲和柱去除主要的丰度蛋白，以便将低分子量蛋白富集在血清内。利用四种不同的表面化学强化捕获方案(CiphergenProteinChipArrays),在SELDI-TOF上分析1-2吗富集蛋白样品的分布。利用BiomarkerWizard(Ciphergen，Inc.)进行数据分析，揭示出在对照和唐氏综合症血清中有区别的峰(图1)。在MALDI-TOF(AutoflexTOF-TOF,BrukerDaltonics)上对样品子集进行进一步的评价(Kersey等，Proteomics4:1985-1988(2004))，并用Clinprot软件(BrukerDaltonics)对该数据进行分析。该方法也揭示出，在唐氏综合症样品中有少量的不同峰。这些结果说明，唐氏综合症母体血清中，在低分子量范围内的潜在差异可以通过SELDI/MALDI图谱来测定。利用唐氏综合症特有的这些图谱进行的灵敏而特异的试验可以开发成专有的(proprietary)高通量筛选试验。B)炎龙2-DG￡。将按方法章节所述制备的成对(对照和唐氏综合症)母体血清样品用荧光染料(Cy5,Cy3和Cy2)标记，在2-D凝胶中分辩。ProteoGenix利用2-D凝胶和半定量方法(2-D图语)开发了专有的高通量试验用于筛选大量样品，其利用了固定内参(母体血清汇集物)，该内参与对照和唐氏综合症样品一起在所有凝胶中进行分辩。如图1所示，妊娠中期三个月母体血清样品显示，在对照和唐氏综合症病例之间有明显差异，而妊娠头三个月和妊娠中期三个月图谱有显著相似性。对强度比进行定量(Phoretics软件，ImageQuant软件，SAS分析)，结果表明，主要目标区域l-7(图2,高至低分子量)显示约40-80%的灵敏度。在这种成对模式中，两个或多个区域的组合能够将所有唐氏综合症病例与对照区别开。为鉴定这些目标区域中的潜在蛋白，使用了来自妊娠头三个月和妊娠中期三个月的三对血清样品的制备型2-D凝胶(l-2mg纯化蛋白)。将来自目标区域的斑点(图2,圓圏区域)穿孔，并用胰蛋白酶消化，用LC/MS/MS(Q-TOF2)分析。利用专有的蛋白组软件(OpenSea)进行蛋白鉴定和数据分析。每个目标区域都代表2-3种蛋白(表1)。显示在目标区域内的蛋白对于妊娠头三个月和妊娠中期三个月血清样品都是一样的。未显示在区域l-7内、但在母体血清中差异表达的蛋白列在表2中。成对(对照和唐氏综合症)羊水样品如上所述用荧光染料(Cy5,Cy3和Cy2)分析，并在2-D凝胶中进行分辩。差异表达的蛋白用从头测序方法鉴定，列于表3中。示于2D荧光凝胶中的相对定量差异可以用Western印迹测量。例如，抗区域1中主要表达的蛋白(补体因子H)的抗体被用于探测与该2D荧光凝胶具有相似分辨结果的母体血清2Dwestern印迹。如图4所示，相比对照母体血清，在唐氏综合症中补体因子H的表达水平更高。这说明鉴定的蛋白生物标记可以用在标准量化免疫分析中，以检测母体血清内的胎儿唐氏综合症。图5是唐氏综合症中候选生物标记的蛋白序列从头鉴定的示意图。具体地说，该图显示了代表属于补体因子H的肽序列的语。图6是唐氏综合症中候选生物标记的蛋白序列从头鉴定的另一示意图。该图显示了被鉴定属于补体因子H的肽序列的序列覆盖图。较浅阴影指示了在多肽序列内鉴定的肽，用较深阴影标记的氨基酸残基是在指示位置的潜在蛋白修饰。矛发^ig-M4ZX)/f溯0t^:參标记前文所述焚光2-D凝胶分析和蛋白鉴定揭示，在妊娠头三个月和妊娠中期三个月母体血清样品中均存在大量的潜在生物标记。免疫-MALDI分析平台提供了一种用于多分析物分析的空前机会。这种分析平台的另一主要优势在于，能捕捉疾病特异性同工型。开发精确的ELISA来测定这些蛋白水解片段或蛋白修饰是很困难的。本实施例显示了利用免疫-MALDI技术开发高通量分析用于检测唐氏综合症的可行性。已经开发免疫-MALDI分析来鉴定在区域6和7内差异表达的蛋白。该区域的2-D凝胶斑点的蛋白鉴定显示，存在载脂蛋白AI,AII，和E。用来自对照和唐氏综合症的成对样品的600(ig母体血清样品进行载脂蛋白的免疫沉淀。如方法中所述，洗脱物利用AutoflexTOF-TOF(BmkerDaltonics)获得图谱。如图3所述，检测到了载脂蛋白的全部三种形式，而且载脂蛋白AII的量在两种样品中有明显差异。而载脂蛋白AII复合物在唐氏综合症母体血清中有独特的同工型。上述成对样品的MALDI分析说明，APOA1在唐氏综合症血清中比在对照血清中下调。用载脂蛋白A2(APOA2)抗体对同一组对照和唐氏综合症血清进行IP(免疫沉淀)分析，所得MALDI图谱示于图3中，其显示，APOA2在对照血清中的相对强度也比在唐氏综合症血清中高(APOA2MW=8707.9Da)。另外，在对照相对于唐氏综合症的IP中还有多种不同。因此，我们的数据说明，MALDI-TOFMS既可以评价相对强度的改变，也可以评价生物标记纟莫式的改变。该实验说明，对在2-DGE分析中鉴定的其它生物标记进行优化，利用计算工具(ClinProt软件)进行相对量化，和优化统计算法用于开发诊断性图谱将可以获得强大的高通量分析系统。该系统通过添加其它的潜在靶标，可以以相同的设置扩展到区别其它非整倍体。本发明在前文说明书中通过参考具体实施方案而进行了讨论，但它并不限于这些实施方案。实际上，除本文所示和所述以外，对本发明的各种修改是本领域技术人员根据前文的描述而显而易见的，并且落在所附权利要求的范围内。《滋辦//^7双^濕*^浙#离和#定^^沃祭合症哞^异表这的蛋^作为对来自母体对照和唐氏综合症血清的蛋白进行2D-DIGE分析的补充策略，可使用双向液相层析(2D-LC)法来分离完整蛋白。2D-LC法提供可视的2D图，从而可以对对照和唐氏综合症血清样品间的差异性蛋白表达进行比较。脊品對务和ZD-丄C法为了对母体对照和唐氏综合症血清中的蛋白表达进行对比分析，从妊娠头三个月和妊娠中期三个月患者制备多组母体血清汇集物。将全部血清免疫纯化(Agilent),更换緩冲液以符合CF相容性要求。从每份样品汇集到5-7mg总血清蛋白。来自对照/唐氏综合症的每对样品用等量总蛋白进行2D-LC分析；来自妊娠头三个月和妊娠中期三个月的成对样品单独进行分析。在ProteomeLabPF2D系统(Beckman-Coulter;Fullerton，CA)上进行2D-LC分析。简单地说，将血清蛋白加样至第一方向CF阴离子交换柱上，利用线性递减pH梯度，根据蛋白等电点(pI/pH)进行洗脱，得到0.3pH单位的组分。然后，利用蛋白疏水性，使用无孔C18RP-HPLC柱将各个pH组分在第二向中分开(每种pH组分48个组分)。从RP-HPLC向(dimension)收集总共800个组分(来自每个样品)，用胰蛋白酶消化，以便用质谱鉴定蛋白。炎桌的^WMS》浙对妊娠中期三个月母体对照和唐氏综合症母体血清成对样品进行2D-LC分析，所得蛋白表达图见图7。图7A描述了利用ProteoVue软件制成的2D-LC图，x轴显示来自CF的洗脱蛋白pl，y轴显示来自RP-HPLC的洗脱蛋白的保留时间，或疏水性。图7B示出对照样品的2D图在左侧以37红色显示，唐氏综合症样品的2D图在右侧以绿色显示。该图的中心显示了两种样品的差异图(在图7B中单独显示)，其中看到的绿色条带是在唐氏综合症样品中上调的蛋白，看到的红色条带是在对照样品中上调的蛋白。将差异图中观察到的在唐氏综合症或对照血清中上调的条带用胰蛋白酶消化，并准备用ESI-QTOF-MS/MS(QTOF2，Waters;Milford,MA)鉴定蛋白。用对照或唐氏综合症样品的较高强度峰的至少10-20%作为差异性强度截取值，这对应妊娠头三个月样品组中的约95个条带和妊娠中期三个月样品组中的80个条带。对照和唐氏综合症组分之间的差异表达强度范围在0.004AU-0.638AU(组分消化物MS分析的检测界限最好是0.05AU;第二向分离的AU值最大达到1.3AU)。母沐yf沃祭合症i清哞差#袭这蛋冷的ZP-丄C#定表5列出了所鉴定的蛋白，它们在唐氏综合症母体血清的LC/MS/MS(Q-TOF2，Waters,Inc)分析中显示出不同的肽计数(缩写Tl，妊娠头三个月；T2,妊娠中期三个月母体血清)。实磁辦///##_^*的潜蛋冷^潘^7^g^祭合症糖基化是真核细胞中复杂的翻译后修饰中的一种。对糖基化过程的系统评价是发掘蛋白生物标记的宝贵工具，因为微小改变诸如单个糖基化事件可以改变具有重要生理意义、与生物的具体疾病或状态有关的蛋白的命运和功能。对细胞信号或发育阶段发生反应而引起的糖基化模式改变或聚糖结构改变，可用于鉴定癌症等疾病。基于凝集素的亲和纯化是用于分离不同种类糖基化蛋白的可选方法。凝集素是植物蛋白，其可以特异地且可逆地与糖蛋白中的聚糖部分结合。主要种类和类型的糖蛋白可从待测样品中单个地分离出，并可用于生成差异性的糖基化图语，以便对对照和疾病进行比较。才法来自孕龄匹配的对照和DS母体成对血清的总糖蛋白、唾液酸、甘露糖和O-糖基化蛋白用合适的凝集素亲和柱(QProteome,Quiagen)纯化。总糖蛋白通过联合使用凝集素，甘露糖结合型凝集素(ConA,LCH，GNA)+唾液酸/N-乙酰-葡糖胺结合型凝集素(WGA,SNA)进行提取。M-联糖蛋白利用甘露糖-结合型凝集素(ConA,LCH,GNA)提取。S-联糖蛋白利用唾液酸/N-乙酰-葡糖胺结合型凝集素(WGA,SNA，MAL)提取。O-联糖蛋白利用半乳糖/N-乙酰-葡糖胺结合型凝集素(AIL,PNA)提取。从对照和唐氏综合症母体血清中提取的糖蛋白用2-向荧光凝胶电泳和LC/MS/MS法对进行分析，以便鉴定出潜在的唐氏综合症标记。从对照和唐氏综合症分离的糖蛋白各取50ug,分别用400pmCy3和Cy5荧光染料标记。等点聚焦在EttanDalt2IPGphor系统(GE-Amresham)上的pH4-7IPG条带中进行，采用适合每一IPG条带各自长度的电压设置。用10-20。/。Tris-甘氨酸凝月交在第二个方向进行PAGE。利用TyphoonVariablemodemodeimager(GE-Amersham)以及Cy3和Cy5的激发波长，获得每个凝胶的差异荧光图像。差异表达的蛋白斑点用(GE-Amersham)软件观察，从凝胶中切出，用胰蛋白酶消化，以便在质谱仪(Q-ToF2，WatersInc)上进行蛋白鉴定。图8-11示出唐氏综合症母体血清内的糖蛋白独特的差异表达图语。将红色或绿色的显示差异性的区域从凝胶上穿孔切出，用胰蛋白酶消化，利用LC/MS/MS对蛋白鉴定进行确定。将从妊娠头三个月和妊娠中期三个月的对照和唐氏综合症母体血清样品提取的总糖蛋白混和物用胰蛋白酶消化，并用LC/MS/MS分析。将体现差异性的糖蛋白(来自每种蛋白的大量的总肽)汇总，与2-向凝胶上差异表达斑点中鉴定出的糖蛋白相比较，表6列出了从唐氏综合症母体血清中鉴定出的糖蛋白。在整个说明书中引用的所有参考文献，以及其中引用的参考文献，在此全文清楚地引入作为参考。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表6(续)<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>凝血酶原前体P00734|[622AA;70037MW]簇蛋白前体P10909H476AA;55192MW]]a-113-糖蛋白前体P04217江495AA;54209MW]a-l-拉性糖蛋白2前休P19652辽201AA;23603MW]]载脂蛋白D前体P05090[189M:21276MW]]扛娘区带蛋白前体P20742[[1482AA:163836MWJ]富含组1、酸的糖蛋白前体P0419525AA;59578MW]假定蛋白[[493AA;53376MW]]P()4278性激素结合球蛋白前体的剪接同工型1P04278-1[[402AA:43779隨J]汁溶.V)原前体(EC3.4.21.7)[含血管生成抑制因子.P00747[[810AA:S05S[),我脂蛋白C-III前体P0265[99AA:10852MW]〗W含';ViVA的a-2掘蛋白前体P02750[[347AA;38178MW]I汰脂蛋白K前体P02649[317AA;36154MW]]白—P)翁体Q9UGM5[[3B2AA:42094MW]肌JHA—反A、性免疚i;蛋白轻链巧变区[〖103AA:11834MW1J补体(lS纽分体P09871[[688AA;76684MW]jAMB1"JK"|含:u小微沐蛋。(蛋白HC)W〖y'性的复合成形^蛋白)(a-l微循蛋白)))']〗'九蛋白L^抑制囚子轻链(n'n,c)(BlKUiNIN)(HI-30).P02760[[352M:38999MW补体(>)'〗5—体[合C4A过敏秦素1P010281[1744AA:192771,]权利要求1、一种诊断胎儿非整倍体的方法，包括将母体生物液体中待测样品的蛋白质组图谱与相同类型生物液体中的正常或参比蛋白质组图谱进行比较，当所述待测样品的蛋白质组图谱显示至少一种独特表达特征、所述表达特征代表至少一种选自表1-2和5-6所列的生物标记、且该特征不出现在所述正常蛋白质组图谱中或者出现在所述参比蛋白质组图谱中，则确定存在胎儿非整倍体。2、一种诊断胎儿非整倍体的方法，包括将母体生物液体中待测样品的蛋白质组图谱与相同类型生物液体中的正常或参比蛋白质组图谱进行比较，当所述待测样品的蛋白质组图语显示至少一种独特表达特征、所述表达特征代表至少一种选自表3所列的生物标记、且该特征不出现在所述正常蛋白质组图语中或者出现在所述参比蛋白质组图语中，则确定存在胎儿非整倍体。3、权利要求1或2的方法，其中所述待测样品获自妊娠妇女。4、权利要求1或2所述方法，其中所述蛋白质组图谱是质谱。5、权利要求l所述方法，其中待测样品是母体血清。6、权利要求5的方法，其中独特的表达特征是在分子量范围16-20kDa，35-38kDa,38-42kDa,40陽45kDa，50-55kDa，60陽68kDa，和125-150kDa中的一或多个范围内。7、权利要求2的方法，其中待测样品是母体羊水。8、权利要求7的方法，其中独特的表达特征是在分子量范围6-7kDa和8-10kDa中的一个范围或全部两个范围内。9、权利要求3的方法，其中该方法是在妊娠头三个月内进行的。10、权利要求3的方法，其中该方法是在妊娠中期三个月内进行的。11、权利要求1或2的方法，还包括确定所述待测样品中至少一种另外的胎儿非整倍体生物标记的转录mRNA水平或翻译出的蛋白的水平，当所述转录mRNA水平或翻译出的蛋白的水平相对于其在正常生物样品中的水平有不同，则确定存在胎儿非整倍体。12、权利要求l、2和11任一项的方法，其中所述胎儿非整倍体是唐氏综合症，13三体，18三体，X染色体三体，X染色体单体，Kleinfelter综合症(XXY基因型)，或XYY综合症(XYY基因型)。13、权利要求ll的方法，其中所述另外的生物标记选自PAPP-A，甲胎蛋白(AFP)，人绒毛膜促性腺激素(bhCG),非偶联雌三醇(uE3),和抑制素A。14、权利要求13的方法，其中测定的是PAPP-A和bhCG的转录mRNA水平或翻译出的蛋白水平。15、权利要求14的方法，其中还测定AFP、bhCG、和uE3的转录mRNA水平或翻译出的蛋白水平。16、权利要求15的方法，其中还测定抑制素-A的转录mRNA水平或翻译出的蛋白水平。17、权利要求3的方法，包括对妊娠妇女实施一或多种其它诊断技术。18、权利要求18的方法，其中所述其它诊断技术选自超声影像技术，检测染色体畸形的技术，和颈项半透明带(NT)测定。19、权利要求1或2的方法，包括对一种以上所述生物标记的独特表达特征进行比较。20、权利要求1或2的方法，其中所述生物标记选自下组补体因子H(CFAH—HUMAN，SwissProt登录号P08603);妊娠区带蛋白(PZP—HUMAN;SwissProt登录号P20741);afamin(AFAM—HUMAN;SwissProt登录号P43652);血管紧张肽原(ANGTJHUMAN;SwissProt登录号P01019);a-2-hs-糖蛋白(A2HS_HUMAN;SwissProt登录号P02765);簇蛋白(CLUS_HUMAN;SwissProt登录号PI0909);载脂蛋白AI(APAl—HUMAN;SwissProt登录号P02647);载脂蛋白AIV(APA4一HUMAN;SwissProt登录号P06727);载脂蛋白E(APE—HUMAN;SwissProt登录号P02649);色素上皮衍生因子(PEDF—HUMAN;SwissProt登录号P36955);血清淀粉样蛋白A(SAA—HUMAN;SwissProt登录号P02735);AMBP蛋白(AMBP_HUMAN;SwissProt登录号P02760);血浆视黄醇结合蛋白(RETB—HUMAN;SwissProt登录号P02753);血清转铁蛋白前体(TRFE一HUMAN;SwissProt登录号P02787);a-l-抗胰蛋白酶前体(A1AT—HUMAN;SwissProt登录号P01009);a-2-巨球蛋白前体(A2MG一HUMAN;SwissProt登录号P01023);补体C3前体(C03—HUMAN;SwissProt登录号P01024);血管紧张肽原前体(ANGT一HUMAN;SwissProt登录号P01019);铜蓝蛋白前体(CERUJIUMAN;SwissProt登录号P00450);触珠蛋白前体(HPT—HUMAN;SwissProt登录号P00738);抗凝血酶-III前体(ANT3—HUMAN;SwissProt登录号P01008);血红素结合蛋白前体(HEMO—HUMAN;SwissProt登录号P02790);a-l-酸性糖蛋白1前体(AlAG—HUMAN;SwissProt登录号P02763);载脂蛋白A-I前体(APA1—HUMAN;SwissProt登录号P02647);alb-糖蛋白(SwissProt登录号P04217);激肽原前体(KNG一HUMAN;SwissProt登录号P01042-2);间-a-胰蛋白酶抑制因子重链H2前体(ITH2—HUMAN;SwissProt登录号P19823);a-2-hs-糖蛋白前体(A2HS—HUMAN;SwissProt登录号P02765);a-l-抗胰凝乳蛋白酶前体(AACT—HUMAN;SwissProt登录号P01011);间-a-胰蛋白酶抑制因子重链H4前体(ITH4—HUMAN;SwissProt登录号Q14624-2);补体因子H前体(CFAH—HUMAN;SwissProt登录号P08603-l);血浆蛋白酶C1抑制因子前体(ICl一HUMAN;SwissProt登录号P05155);肝素辅因子II前体(HEP2—HUMANSwissProt登录号P05546);补体因子B前体(CFAB—HUMAN;SwissProt登录号P00751-1);a-2-糖蛋白1，锌(ZA2G—HUMAN;SwissProt登录号P25311);玻连蛋白前体(VTNC—HUMANSwissProt登录号P04004);间-a-胰蛋白酶抑制因子重链HI前体(ITH1—HUMAN;SwissProt登录号P19827);补体成分C9前体(C09—HUMAN;SwissProt登录号P02748);血纤蛋白原a/a-E链前体(FIBA—HUMAN;SwissProt登录号P02671-l);血纤蛋白原卩链前体(FIBB—HUMAN;SwissProt登录号P02675);血纤蛋白原y链前体(FIBG—HUMAN;SwissProt登录号P02679-l);凝血酶原前体(THRB—HUMAN;SwissProt登录号P00734);簇蛋白前体(CLUS—HUMAN;SwissProt登录号P10909);a-lB-糖蛋白前体(A1BG—HUMAN;SwissProt登录号P04217);a-l-酸性糖蛋白2前体(A1AH—HUMAN;SwissProt登录号P19652);载脂蛋白D前体(APOD—HUMAN;SwissProt登录号P05090);妊娠区带蛋白前体(PZP—HUMAN;SwissProt登录号P20742);富组氨酸糖蛋白前体(HRG一HUMAN;SwissProt登录号P04196);性激素-结合型球蛋白前体(SHBG—HUMAN;SwissProt登录号P04278-l);纤溶酶原前体(PLMN—HUMAN;SwissProt登录号P00747);载月旨蛋白C-III前体(APC3—HUMAN;SwissProt登录号P02656);富亮氨酸a-2-糖蛋白前体(A2GL—HUMAN;SwissProt登录号P02750);载脂蛋白E前体(APE—HUMAN;SwissProt登录号P02649);胎球蛋白-B前体(FETB—HUMAN;SwissProt登录号Q9UGM5);肌球蛋白.-反应性免疫球蛋白轻链可变区(SwissProt登录号Q9UL83);补体CIS成分前体(CIS—HUMAN;SwissProt登录号P09871);ambp蛋白前体(AMBP—HUMAN;SwissProt登录号P02760);和补体C4前体(C04—HUMAN;SwissProt登录号P01028)。21、权利要求20的方法，包括对一种以上所述生物标记的独特表达特征进4于比较。22、权利要求1或2的方法，其中所述生物标记是补体因子H(CFAH—HUMAN,SwissProt登录号P08603);和妊娠区带蛋白(PZP—HUMAN;SwissProt登录号P20741)。23、权利要求1或2的方法，其中所述生物标记是补体因子H(CFAH—HUMAN,SwissProt登录号P08603);和afamin(AFAM—HUMAN;SwissProt登录号P43652)。24、权利要求1或2的方法，其中所述生物标记是妊娠区带蛋白(PZP_HUMAN;SwissProt登录号P20741);和a-2-hs-糖蛋白(A2HS—HUMAN;SwissProt登录号P02765)。25、权利要求1或2的方法，其中所述生物标记是补体因子H(CFAH—HUMAN,SwissProt登录号P08603);血管紧张肽原(ANGTJHUMAN;SwissProt登录号P01019);和簇蛋白(CLUS—HUMAN;SwissProt登录号P10909)。26、权利要求1或2的方法，其中所述生物标记是载脂蛋白E(APE—HUMAN;SwissProt登录号P02649);AMBP蛋白(AMBP—HUMAN;SwissProt登录号P02760);和血浆视黄醇结合蛋白(RETB_HUMAN;SwissProt登录号P02753)。27、权利要求1或2的方法，其中所述生物标记是补体因子H(CFAH—HUMAN,SwissProt登录号P08603);afamin(AFAM_HUMAN;SwissProt登录号P43652);血管紧张肽原(ANGT_HUMAN;SwissProt登录号P01019);和簇蛋白(CLUS—HUMAN;SwissProt登录号P10909)。28、权利要求1或2的方法，其中所述生物标记是补体因子H(CFAH—HUMAN,SwissProt登录号P08603);afamin(AFAM—HUMAN;SwissProt登录号P43652);色素上皮衍生因子(PEDF—HUMAN;SwissProt登录号P36955);血清淀粉样蛋白A(SAA—HUMAN;SwissProt登录号P02735);血管紧张肽原(ANGT—HUMAN;SwissProt登录号P01019);和簇蛋白(CLUS—HUMAN;SwissProt登录号P10909)。29、权利要求1或2的方法，其中所述生物标记是载脂蛋白E(APE—HUMAN;SwissProt登录号P02649);AMBP蛋白(AMBP_HUMAN;SwissProt登录号P02760);血浆视黄醇结合蛋白(RETB—HUMAN;SwissProt登录号P02753);血清转铁蛋白前体(TRFEJIUMAN;SwissProt登录号P02787);a-2-巨球蛋白前体(A2MG—HUMAN;SwissProt登录号P01023);和富组氨酸糖蛋白前体(HRG一HUMAN;SwissProt登录号P04196)。30、权利要求1或2的方法，其中所述生物标记是间-a-胰蛋白酶抑制因子重链HI前体(ITH1—HUMAN;SwissProt登录号P19827);补体成分C9前体(C09—HUMAN;SwissProt登录号P02748);血纤蛋白原a/a-E链前体(FIBA—HUMAN;SwissProt登录号P02671-l);载脂蛋白C-III前体(APC3—HUMAN;SwissProt登录号P02656);富亮氨酸a-2-糖蛋白前体(A2GL_HUMAN;SwissProt登录号P02750);载脂蛋白E前体(APE—HUMAN;SwissProt登录号P02649);胎球蛋白-B前体(FETB—HUMAN;SwissProt登录号Q9UGM5);和补体C4前体(C04—HUMAN;SwissProt登录号P01028)。31、权利要求1或2的方法，其中所述蛋白质组图谱包括至少一种糖蛋白。32、权利要求31的方法，其中所述至少一种糖蛋白是选自下组唾液酸糖蛋白，甘露糖结合型糖蛋白，和O-联糖蛋白。33、权利要求1或2的方法，其中所述胎儿非整倍体是常染色体非整倍体。34、权利要求33的方法，其中所述常染色体非整倍体是染色体13,18或21的三体。35、权利要求1或2的方法，其中所述胎儿非整倍体是性染色体非整倍体。36、权利要求35的方法，其中所述性染色体非整倍体选自下组X染色体三体，X染色体单体，Kleinfelter综合症(XXY基因型)，和XYY综合症(XYY基因型)。全文摘要本发明涉及一种早期非侵入性诊断胎儿非整倍体的方法。具体地说，本发明涉及通过鉴定胎儿非整倍体在母体生物液体内的蛋白表达模式来诊断胎儿非整倍体，所述母体生物液体如母体血清或羊水。文档编号G01N33/00GK101437959SQ200580039765公开日2009年5月20日申请日期2005年9月20日优先权日2004年9月20日发明者斯里尼瓦萨·R·纳盖拉,罗恩·罗森菲尔德申请人:普罗特奥格尼克斯公司