多重数字pcr技术在染色体非整倍体筛查中的应用_3

单元 的荧光信号进行分析。dPCR可不需要对照标准样品和曲线实现绝对定量分析。
[0099] 多重PCR(multiplex PCR)是在同一 PCR反应体系里加上二对或更多对引物，同时 扩增出多个核酸片段的PCR反应。一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸 片段。而多重PCR(multiplex PCR)是在同一 PCR反应体系里加上二对或更多对引物，同时 扩增出多个核酸片段的PCR反应。
[0100] 本发明所用的多重数字PCR (multiplex digital PCR，MDPCR)是在同一数字PCR 反应体系里加上二对或更多对引物，同时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。尤其需要 指出的是，将多重PCR技术与dPCR技术有机结合而形成的多重数字PCR(MDPCR)，根据DNA 探针不同荧光度，DNA扩增不同循环数及多种标记荧光同时使用，便可大幅提高数字PCR多 重性达20-50以上，即同时在一个PCR反应单元内进行20-50个以上数字PCR反应。
[0101] 可用于本发明的多重数字PCR的特点有：⑴高效性。在同一 PCR反应管内同时 检出多种核酸片段，或对有多个型别的目的基因进行分型。（2)系统性。多重数字PCR很适 宜于成组核酸片段的检测。（3)经济简便性。多种核酸片段在同一反应管内同时检出，节省 时间、试剂耗材和经费，为临床提供更多更准确的检测信息。
[0102] 检测染色体非整倍体的方法
[0103] 本发明提供了一种用于体外非诊断性检测染色体非整倍体的或用于对染色体异 常疾病进行无创产前筛查的方法。
[0104] 本发明的方法包括步骤：
[0105] (a)提供含有胎儿游离DNA的妊娠对象外周血样本；
[0106] (b)从所述外周血样本分离去除细胞，并从去除细胞的所述样本中富集DNA，得到 DNA样本；
[0107] (c)将所述DNA样本分为对照组和实验组，其中，
[0108] 在实验组中，以所述DNA样本为模板，用扩增目标染色体基因的nl对第一引物对 进行多重数字PCR，并记录阳性点个数C1与引物对数量nl之比，记为al，其中al = Cl/nl， 且nl彡2,优选地，nl彡5 ;
[0109] 在对照组中，以所述DNA样本为模板，用扩增参照染色体基因的n2对第二引物对 进行多重数字PCR，并记录阳性点个数C2与引物对数量n2之比，记为a2,其中a2 = C2/n2， 且nl彡5,优选地，nl彡5 ;
[0110] (d)将所述al值与a2值进行比较，从而确定目标染色体的倍数。
[0111] 其中，优选地，步骤（b)中所述的细胞为血液样本中的完整或破碎的血细胞，主要 包括红细胞、白细胞、血小板等，此外还可以包括血浆蛋白等。去除方法可以通过本领域常 规技术进行。经去除细胞的DNA样本为富集的DNA样本。
[0112] 此外，更优选地，步骤（b)中的DNA样本是经过片段化处理后的样本。可用于片 段化处理的方法没有特别限制，为本领域技术人员熟知的方法，例如物理或生化处理，如 碎化、超声处理、酶切等等。经过片段化处理后的片段化的DNA样本，通常其大小不超过 3000bp〇
[0113] 本发明方法中，所述的目标染色体通常为现有发现的出现染色体数量变异并导致 染色体异常疾病的染色体，优选地包括21号染色体、13号染色体、18号染色体、性染色体。 而所述的参照染色体则为已知正常数目的染色体。例如，当目标染色体为21号染色体是， 可以采用其它任意一条染色体（如13号、18号）等为参照染色体。此外，可用于本发明的 参照染色体为一个或多个。
[0114] 在本发明方法中，根据多重PCR的原理并根据本发明方法设计的步骤，本领域技 术人员可以获得以下PCR产物和染色体倍数结果的对应内容：
[0115] 计算al/a2值记为R，
[0116] 当R等于或约等于0. 5(即接近于0. 5)时，则表明所述的样本中所述目标染色体 为单倍体；
[0117] 当R等于或约等于1(即接近于1)时，则表明所述的样本中所述目标染色体与参 照染色体的倍数相同；
[0118] 当R等于或约等于1. 5 (即接近于1. 5)时，则表明所述的样本中所述目标染色体 为3倍体；
[0119] 当R等于或约等于2 (即接近于2)时，则表明所述的样本中所述目标染色体为4 倍体。
[0120] 在另一优选例中，当R与1离散时，则表明所述的样本中含有多倍染色体。
[0121] 当进行产前筛查时，还可以进一步获得：
[0122] R等于或约等于1.025时，则表明所述的样本中只有5%胎儿游离DNA样本的目标 染色体为三倍体，而其余95 %妊娠母体DNA样本的目标染色体仍为二倍体。
[0123] 当R等于或约等于1.05时，则表明所述的样本中只有10%胎儿游离DNA样本的目 标染色体为三倍体，而其余90 %妊娠母体DNA样本的目标染色体仍为二倍体。
[0124] 引物集合
[0125] 本发明还提供了一种引物集合，采用本发明引物集合可以用于完成本发明体外非 诊断性检测染色体非整倍体的或用于对染色体异常疾病进行无创产前筛查的方法。
[0126] 本发明的引物集合中，包含了扩增目标染色体的引物对，以及扩增参照染色体的 引物对，二者引物对的数量分别为nl对和n2对。其中，nl和n2分别为多2的正整数。优 选地，可用于本发明引物集合的引物对的对数nl和n2分别为3、4、5、6、7、8、9、10对，优选 至少5对。
[0127] 可用于扩增本发明目标染色体和参照染色体基因的引物通常没有特别限制。为任 何现有技术中可以根据目标染色体基因和参照染色体基因为模板而设计的引物对。可用于 本发明的目标染色体和参照染色体没有特别限制，具体可如上文所定义。可用于本发明的 目标染色体基因没有特别限制，可以为目标染色体上任意的基因。本领域技术人员可以根 据本发明提供的方法来判断确定目标染色体和参照染色体。当确定了目标和/或参照染色 体后，可以选取所述染色体上相应的基因作为模板，然后通过常规方法设计用于扩增所述 模板的相应引物。
[0128]通常，当目标染色体为21号染色体时，可选用的基因包括 Usp25 (NCBI#NM_001283041)、C21orf37 (NCBI#LN608865)、C21orf58 (NCBI#NM_058180)、 Setd4(NCBI_M_017438)、C21orf62(NCBI#AF231922)等及其他基因位点和非基因位 点；当目标染色体为18号染色体时，可选用的基因包括Setbpl (NCBI#NM_015559)、 Potec(NCBI#NM_001137671)、Malt 1(NCBI#AB026118)、Dsc3(NCBI#NM_001941)、 Cdhl9 (NCBI#NM_021153)等及其他基因位点和非基因位点；当目标染色体为13号 染色体时，可选用的基因包括 Sacs(NCBI#NM_014363)、Cenpj(NCBI#NM_018451)、 Foxol(NCBI#NM_002015)、Smad9(NCBI#NM_001127217)、Fgfl4(NCBI#NM_004115)等及其他 基因位点和非基因位点。而参照染色体则只需选择与目标染色体不同的染色体，并进一步 选择参照染色体上相应的基因及其他基因位点和非基因位点。
[0129] 优选地，引物集合中每对引物所扩增的基因模板长度为50_150bp，较佳地，为 100-120bp。优选地，当目标染色体为21号染色体时，用于扩增目标染色体基因的引物对 序列如SEQ ID N0. : 1-2所示，所针对的基因为Usp25 ;和/或当参照染色体为18号染色体 时，所述用于扩增参照染色体基因的引物对序列如SEQ ID N0. :4-5所示，所针对的基因为 Setbpl〇
[0130] 此外，用于多重数字PCR检测的引物对中，通常会采用标记物的形式来测定所扩 增产物的绝对值并用于和对照进行比对。可用的标记物没有特别限制，可用是优选地，用 于参照染色体和目标染色体的各引物对中至少一条连接有荧光标记，例如采用荧光标记 探针进行引物扩增结果的显示，优选地，含有荧光标记探针的引物中，探针序列如SEQ ID NO. :3(目标染色体）或6(参照染色体）所示。
[0131] 采用本发明提出的精确定量的多重数字PCR方法，能同时检测同一条染色体上 至少5-10个不同的基因位点，或短串联重复序列包括至少4-6个STR基座，并将胎儿和 母体的DNA分子在超过数万，甚至数百万、数千万个不同的PCR单元进行单独分析，无交 叉干扰，从而在低浓度胎儿游离DNA中检测出染色体拷贝数变化，基因点突变及单核苷 酸多态性（SNP)。例如，正常整倍体妊娠母体血浆样品每100微升含10个基因组当量 (genome-equivalents，GE)(其中1个当量来自于胎儿游离DNA)，即每100微升含21染色 体拷贝数为20 (18母体拷贝数+2胎儿拷贝数），而21三体妊娠每毫升含21染色体拷贝数 为21 (18母体拷贝数+3胎儿拷贝数），常规定量PCR尚不能这样精细分析20拷贝与21拷 贝之间的细微区别。但采用MDPCR方法，能精确分析20拷贝与21拷贝之间的细微区别。
[0132] 试剂盒
[0133] 本发明还提供了检测染色体非整倍体和/或筛查染色体数量异常疾病的试剂盒。 其中，所述的试剂盒中含有本发明的引物集合以及说明书。
[0134] 本发明试剂盒中含有的说明书记录了本发明检测目标染色体非整倍体的方法和/ 或对染色体异常疾病进行无创产前筛查的方法。
[0135] 本发明具有以下主要优点：
[0136] (1)早期检测。正常妊娠情况下，胎儿细胞经过胎盘渗透至母体血液，细胞被母体 免疫系统破坏，胎儿DNA游离于母血中。据报道，胎儿游离DNA最早在母血中能测到的时间 为妊