多重数字pcr技术在染色体非整倍体筛查中的应用_2

，较 佳地，为 100-120bp。
[0047] 在另一优选例中，所述的目标染色体基因选自包括21号染色体的 Usp25 (NCBI#NM_001283041)、C21orf37 (NCBI#LN608865)、C21orf58 (NCBI#NM_058180)、 Setd4(NCBI#NM_017438)、C21orf62(NCBI#AF231922)基因及其他基因位点和非基因位点； 13 号染色体的 Sacs (NCBI#NM_014363)、Cenp j (NCBI#NM_018451)、Foxol (NCBI#NM_002015)、 Smad9(NCBI_\L〇01127217)、Fgf 14 (NCBI_M_004115)基因及其他基因位点和非基 因位点；或 18 号染色体的 Setbpl(NCBI#NM_015559)、Potec(NCBI#NM_001137671)、 Maltl(NCBI#AB026118)、Dsc3(NCBI#NM_001941)、Cdhl9(NCBI#NM_021153)基因及其他基因 位点和非基因位点。
[0048] 本发明第一方面所述的引物集合中的引物上还含有引物荧光标记。
[0049] 在另一优选例中，所述的引物荧光标记为荧光标记探针。
[0050] 本发明第一方面所述用于扩增目标染色体基因的引物对序列如SEQ ID N0. : 1-2 所示；和/或所述用于扩增参照染色体基因的引物对序列如SEQ ID NO. :4-5所示；其中所 述目标染色体为21号染色体的Usp25基因；所述参照染色体为18号染色体的Setbpl基 因。
[0051] 在另一优选例中，含有荧光标记探针的引物中，探针序列如SEQ ID N0. :3、或6所 不〇
[0052] 本发明第三方面，提供了本发明第二方面所述引物集合的用途，用于制备检测染 色体非整倍体和/或筛查染色体数量异常疾病的试剂或试剂盒。
[0053] 在另一优选例中，所述的染色体数量异常疾病包括单倍体疾病或多倍体疾病。
[0054] 在另一优选例中，所述的单倍体疾病包括5q_综合征。
[0055] 在另一优选例中，所述的多倍体疾病包括21三体综合征、13三体综合征、18三体 综合征。
[0056] 在另一优选例中，所述的试剂盒包括本发明第二方面所述的引物集合，和说明书。
[0057] 在另一优选例中，所述的说明书上记载着如下使用方法，包括步骤：
[0058] (a)提供含有胎儿游离DNA的妊娠对象外周血样本；
[0059] (b)从所述外周血样本分离去除细胞，并从去除细胞的所述样本中富集DNA，得到 DNA样本；
[0060] (c)将所述DNA样本分为对照组和实验组，其中，
[0061] 在实验组中，以所述DNA样本为模板，用扩增目标染色体基因的nl对第一引物进 行多重数字PCR，并记录阳性点个数C1与引物对数量nl之比，记为al，其中al = Cl/nl， 且nl多5 ;
[0062] 在对照组中，以所述DNA样本为模板，用扩增参照染色体基因的n2对第二引物进 行多重数字PCR，并记录阳性点个数C2与引物对数量n2之比，记为a2,其中a2 = C2/n2， 且n2彡5 ;
[0063] (d)将所述al值与a2值进行比较，从而确定目标染色体的倍数。
[0064] 在另一优选例中，所述的参照染色体为二倍体。
[0065] 在另一优选例中，计算al/a2值记为R，
[0066] 当R等于或约等于0. 5(即接近于0. 5)时，则表明所述的样本中所述目标染色体 为单倍体；
[0067]当R等于或约等于1(即接近于1)时，则表明所述的样本中所述目标染色体与参 照染色体的倍数相同；
[0068] 当R等于或约等于1.025时，则表明所述的样本中只有5%胎儿游离DNA样本的目 标染色体为三倍体，而其余95 %妊娠母体DNA样本的目标染色体仍为二倍体；
[0069] 当R等于或约等于1.05时，则表明所述的样本中只有10%胎儿游离DNA样本的目 标染色体为三倍体，而其余90 %妊娠母体DNA样本的目标染色体仍为二倍体；
[0070] 当R等于或约等于1. 5 (即接近于1. 5)时，则表明所述的样本中所述目标染色体 为3倍体；
[0071] 当R等于或约等于2 (即接近于2)时，则表明所述的样本中所述目标染色体为4 倍体。
[0072] 在另一优选例中，所述含有胎儿游离DNA的外周血样本经胎儿游离DNA富集获得。
[0073] 本发明第四方面，提供了一种检测目标染色体的试剂盒，所述的试剂盒中含有本 发明第二方面所述的引物集合，和说明书。
[0074] 本发明第五方面，提供了一种检测目标染色体的非整倍体和/或对染色体异常疾 病进行无创产前筛查的方法，包括步骤：
[0075] (a)提供含有胎儿游离DNA的妊娠对象外周血样本；
[0076] (b)从所述外周血样本分离去除细胞，并从去除细胞的所述样本中富集DNA，得到 DNA样本；
[0077] (c)将所述DNA样本分为对照组和实验组，其中，
[0078] 在实验组中，以所述DNA样本为模板，用扩增目标染色体基因的nl对第一引物进 行多重数字PCR，并记录阳性点个数C1与引物对数量nl之比，记为al，其中al = Cl/nl， 且nl多5 ;
[0079] 在对照组中，以所述DNA样本为模板，用扩增参照染色体基因的n2对第二引物进 行多重数字PCR，并记录阳性点个数C2与引物对数量n2之比，记为a2,其中a2 = C2/n2， 且n2彡5 ;
[0080] (d)将所述al值与a2值进行比较，从而确定目标染色体的倍数。
[0081] 在另一优选例中，计算al/a2值记为R，
[0082] 当R等于或约等于0. 5(即接近于0. 5)时，则表明所述的样本中所述目标染色体 为单倍体；
[0083] 当R等于或约等于1(即接近于1)时，则表明所述的样本中所述目标染色体与参 照染色体的倍数相同；
[0084] 当R等于或约等于1.025时，则表明所述的样本中只有5%胎儿游离DNA样本的目 标染色体为三倍体，而其余95 %妊娠母体DNA样本的目标染色体仍为二倍体；
[0085] 当R等于或约等于1.05时，则表明所述的样本中只有10%胎儿游离DNA样本的目 标染色体为三倍体，而其余90 %妊娠母体DNA样本的目标染色体仍为二倍体；
[0086] 当R等于或约等于1. 5 (即接近于1. 5)时，则表明所述的样本中所述目标染色体 为3倍体；
[0087] 当R等于或约等于2 (即接近于2)时，则表明所述的样本中所述目标染色体为4 倍体。
[0088] 在另一优选例中，当R与1离散时，则表明所述的样本中含有多倍染色体。
[0089] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0090] 图1.多重数字PCR基本流程。其流程包括样品DNA分离和稀释一dPCR样品混合 -dPCR样品上样一dPCR扩增一dPCR结果分析。
[0091] 图2.多重数字PCR扩增芯片分析结果截图。
[0092] 图3.高分辨率染色体拷贝数分析示意图。多重数字PCR扩增芯片染色体绝对定 量软件分析结果转移至Excel，经计算显示正常母体DNA与不同比例21-三体DNA混合染色 体拷贝数实际测量值与其理论值相似。
【具体实施方式】
[0093] 本发明人经过广泛而深入的研宄，首次提出应用MDPCR技术在孕妇外周血液中进 行染色体异常疾病无创产前筛查，从而开发出一种早期、安全无创、准确、快速、适合大规模 检测和临床应用的新方法。该方法利用多重技术富集胎儿游离DNA，同时利用不同浓度荧光 标记探针组合，荧光信号会集聚于不同区域，及不同的PCR循环数量，从而增加MDPCR多重 性达20-50次以上。在此基础上完成了本发明。
[0094] 定义
[0095] "无创产前筛查"是指仅需采取妊娠对象外周血液，利用新一代DNA检测技术对母 体外周血浆中的胎儿游离DNA片段进行检测分析，从而检测胎儿是否患染色体异常疾病一 唐氏综合症（21三体）、爱德华氏综合症（18三体）、帕陶氏综合症（13三体）和其他染色 体非整倍体异常疾病。
[0096] "染色体异常疾病"或"染色体非整倍体异常疾病"是指染色体的数目异常和/或 形态结构变化，可发生于每一条染色体上。通常，所述的染色体数量异常疾病包括单倍体疾 病或多倍体疾病。例如，所述的单倍体疾病包括5q_综合征。所述的多倍体疾病包括21三 体（唐氏综合症），18三体（爱德华氏综合症），13三体（帕陶氏综合症）和性染色体异常 等。
[0097] 多重数字PCR
[0098] 数字PCR (digital PCR)是近年来快速发展起来的一种新型定量分析技术，通过 将单个样本分成超过数万，甚至数百万、数千万份分布于不同的反应单元，每个单元包含 无或一个或多个拷贝的DNA模板，分别对这些DNA模板进行PCR扩增，然后对各个反应 单元的荧光信号进行分析。dPCR可不需要对照标准样品和曲线实现绝对定量分析。数 字PCR (digital PCR)技术概念虽然在九十年代就提出（Sykes PJ et al. Biotechniques 1992, 13:444-449)，但只是近年来随着技术发展而快速兴起的一种新型定量分析技术，通 过将单个样本稀释、分成超过数万，甚至数百万、数千万份分布于不同的反应单元，每个单 元包含无或一个拷贝的DNA模板，分别对这些DNA模板进行PCR扩增，然后对各个反应