专利名称：无抗多效价迟钝爱德华氏菌载体活疫苗、其制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及减毒突变株技术领域，特别涉及鱼用细菌性减毒活疫苗技术领域，具体是指一种迟钝爱德华氏菌疫苗株的重组无抗多效价疫苗载体、相关制剂及其应用。
背景技术：
现代的水产养殖业在各个国家都呈现出大规模、集约化的发展趋势，它在为人类提供食物的环节中扮演着非常重要的角色。随着全球的人口在增长，人类对食物的需要量在不断的加大，当然对鱼类的需求量也在加大。然而，随着渔业养殖的不断稳步发展，各种病害问题日益突出，对养殖产量及成长造成严重影响。在我国，近几年发展起来的海水网箱养殖和工厂化养殖鱼类的突发性、爆发性疾病频繁发生。目前，我国的海水养殖平均死亡损失率在30%以上，每年的经济损失多达160亿元，病害问题已成为制约海水养殖业健康发展的重要因素。疫苗具有针对性强、抗病周期长、可终身免疫、效果显著和防治主动的特点。以病原菌细胞灭活体为基础形式的灭活疫苗(Inactivated Vaccine)为水产养殖病害防治提供了有效手段，但灭活疫苗普遍具有给药不便(注射给药才具有较好的免疫保护力)的技术应用缺陷，减毒活疫苗因具有给药方便(可浸泡给药)、免疫效价高(可减少给药剂量)、成本低廉、可开发广谱疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保护性)的新技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫苗研究和开发的热点和前沿领域。多效价载体疫苗是以减毒活疫苗为疫苗载体，通过将多种不同病原菌的抗原插入到同一个表达的质粒载体上，避免了减毒活疫苗存在的潜在的毒力返还风险，在宿主体内激发免疫反应时免疫应答效果更好，被广泛用于疫苗开发。传统的载体疫苗都是通过质粒来表达异源抗原的，而通常质粒都是采用抗生素作为筛选标记的，这样对于疫苗存在两个主要的问题需要解决。当疫苗进入到宿主体内时，宿主体内是不存在抗生素的选择压力的，使用了高拷贝质粒的疫苗，因为没有选择压力的存在，会大量丢失质粒，使得异源抗原的表达量下降迅速，最终会导致疫苗效价降低。另外，疫苗构建过程中使用抗性选择基因使得后期疫苗的应用存在很大的潜在安全性问题。自然界中基因会发生漂移，抗性基因也不例外，因此目前人畜使用的疫苗对抗性基因的使用非常严格，虽然水产疫苗还没有相关的政策，但是水产养殖的鱼类做为人类的食物来源，安全性是值得重视的。如果一个菌株因为自然突变或者是人工的方式变成了营养缺陷型，因为其染色体上的某个基因缺失后产生对某一种营养物质的依赖，那么这个缺失突变株可以通过一个有功能的、存在于质粒上的基因进行回补，这种回补就可以通过在培养基中添加这类营养物质来进行筛选而不是抗生素，如果培养基中不含有这种营养物质那么只有带有回补质粒的菌株才可以生长。同样，这种质粒在宿主体内也可以稳定的存在，因为质粒上的筛选压力来自于疫苗株的生存，而不是需要额外的合成抗生素等物质。通过这种染色体-质粒回补的形式构建的系统就被称为平衡致死系统。 因为平衡致死系统可以替代抗性筛选标记而不需要再使用抗性筛选表达，将这种系统用于构建非抗性选择标记的疫苗，解决了抗性选择标记所带来的生物安全性问题。爱德华氏菌属是导致淡水、海水养殖鱼类细菌性疾病的一类常见的病原体，具体分为迟纯爱德华氏菌(Edwardsiella tarda),鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)和保科爱德华氏菌(Edwardsiella hoshinae)。由其引起的鱼类出血性败血症统称为爱德华氏菌病(Edwardsiellosis)。该病传播面积广，无明显季节性，感染率及死亡率高，危害的种类多，有鲤鱼，罗非鱼，鳗鲡，鲻鱼，鲑鱼，鳟鱼，鲆鲽等大多数具有较高经济价值的鱼种。此外，迟钝爱德华氏菌还感染贝类、爬行类、两栖类、鸟类、哺乳类。值得注意，迟钝爱德华氏菌还是一种重要的人畜共患病原菌，它是爱德华氏菌属中唯一感染人类的成员。目前，我国养殖鱼类爱德华氏菌病病害比较严重的病原体主要为迟钝爱德华氏菌，并有存在病原体向人体转移的巨大威胁。美国专利有利用利福平筛选得到野生毒株的自然减毒突变体作为减毒活疫苗的报道(Evans J J, Klesius, P H and Shoemaker C A2006Modified liveEdwardsiella tarda vaccine for aquatic animals;United States Patent7067122)。目前在我国尚无该病害的有效防治措施。
发明内容
本发明构建了一种迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株，其特征在于，所述迟钝爱德华氏菌基因组缺失天冬氨酸半缩醛合成酶基因asdB，并含有回补质粒，所述回补质粒含有SD-asdB片段和异源免疫原编码序列，所述 SD-asdB片段由操作性相连的SD序列和迟钝爱德华氏菌天冬氨酸半缩醛合成酶编码序列构成，所述回补质粒不含抗生素标记，所述异源免疫原编码序列与调控序列操作性相连从而能够在迟钝爱德华氏菌中表达。本发明通过基因组缺失-质粒回补的平衡致死系统构建了安全、高效的多效价载体活疫苗。天冬氨酸半缩醛合成酶是迟钝爱德华氏菌生长所必需的，天冬氨酸半缩醛合成酶基因asdB缺失株无法正常生长。本发明采用asdB基因替代高拷贝质粒中的抗性基因作为筛选标记构建得到无抗回补质粒，以该回补质粒转化缺失株来回补基因组asdB缺失，转化得到的回补株能够正常生长。本发明的回补质粒是不含抗性标记的质粒表达系统。本发明对于用来构建回补质粒的出发质粒没有特别限制，只要能够在在迟钝爱德华氏菌内存活和/或复制。本领域技术人员可以根据转化的对象和转化目的，例如是为表达、扩增还是整合到基因组等，依照现有技术的教导做出合适的选择。例如，可以选用质粒载体，例如后文实施例所用的PUTt质粒。实施方式之一中，本发明用迟钝爱德华氏菌asdB基因的SD-asdB片段替代高拷贝质粒中的抗性基因作为筛选标记构建得到无抗回补质粒。本发明中，“SD-asdB片段”由操作性相连的SD序列和迟钝爱德华氏菌天冬氨酸半缩醛合成酶编码序列构成。本发明实施方式之一中，所述天冬氨酸半缩醛合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。实施方式之一中，所述SD-asdB片段来自迟钝爱德华氏菌EIB202 JBSEQ ID NO: 2所示，其中第1_4位的“AGGA”为SD序列，第11-1111位为天冬氨酸半缩醛合成酶编码序列，第11-13位的“ATG”为起始密码子，第1112-1114位的“TAG”为终止密码子。考虑到回补质粒中基因的过量表达可能对菌体的生长代谢产生负担，我们采用无启动子的asdB基因进行回补，并改动了 asdB基因的SD序列以及起始密码子来优化回补结果。实施方式之一中，我们将野生型的SD序列由AGGA改变为AAGA。实施方式之一中，我们将天冬氨酸半缩醛合成酶编码序列的起始密码子由ATG改变为GTG。实施方式之一中，回补质粒中的SD-asdB片段序列如SEQ ID N0:3所示。本发明的回补质粒还含有与调控序列操作性相连的异源免疫原编码序列。本发明中，“异源免疫原”指非迟钝爱德华氏菌来源的免疫原，其能够中鱼类中诱导免疫反应。本发明实施方式之一中，所述异源免疫原是甘油醛三磷酸脱氢酶(GATOH)。该酶在各类生物是高度保守的，其参与糖酵解途径，关于其免疫和免疫保护特性在很多研究中已经得到证明。本发明实施方式之一中，所述GAPDH是嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的GAPDH,其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。本发明实施方式之一中，所述GAPDH的编码序列如SEQ IDN0:5所示。本发明中，“操作性相连”的序列包括与感兴趣的基因毗连或相距一定距离的表达控制序列，该操作性连接方式使得所述调控序列能够控制感兴趣基因的表达，使其在宿主细胞内得以转录和表达。选择合适的调控序列属于本领域技术人员的常规技能。本发明实施方式之一中，所述异源免疫原的编码序列与迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子Pdps(在此简称Pdps)操作性相连，Pdps由此控制启动异源免疫原基因的表达。本发明实施方式之一中，所述迟钝爱德华氏菌Pdps来自迟钝爱德华氏菌EIB202，其序列如SEQ IDNO:6所示。用于构建本发明无抗多效价载体活疫苗株的出发菌株优选减毒疫苗株。实施方式之一中，采用的起始疫苗株是保藏号为CCTCC N0:M2010278的迟钝爱德华氏菌WED。迟钝爱德华氏菌WED是高效减毒疫苗株，其基因组缺失了分支酸合成酶基因aroC，三型分泌系统效应元件基因eseB, escA, eseC和eseD,并且缺失了内源性质粒pEIBl。本发明进一步敲除了迟钝爱德华氏菌WED的基因组天冬氨酸半缩醛脱氢酶基因asdB。实施方式之一中，本发明由WED菌株构建得到含有回补质粒的无抗多效价活疫苗株迟钝爱德华氏菌EIB AVMl，其保藏号为 CCTCC N0:M2012341o本发明还提供了制造迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株方法，包括:敲除迟钝爱德华氏菌出发菌株的基因组天冬氨酸半缩醛合成酶基因asdB，制得asdB缺失菌株；获取回补质粒，所述回补质粒含有SD-asdB片段和异源免疫原编码序列，所述SD-asdB片段由操作性相连的SD序列和迟钝爱德华氏菌天冬氨酸半缩醛合成酶编码序列构成，所述回补质粒不含抗生素标记，所述异源免疫原编码序列与调控序列操作性相连从而能够在迟钝爱德华氏菌中表达；用所述回补质粒转化所述asdB缺失菌株，得到所述迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株。实施方式之一中，所述迟钝爱德华氏菌出发菌株是保藏号为CCTCC N0:M2010278的迟钝爱德华氏菌WED。实施方式之一中，所述回补质粒以pUTt质粒为出发质粒构建而成。实施方式之一中，所述回补质粒中天冬氨酸半缩醛合成酶编码序列编码SEQ IDNO:1所示氨基酸序列。实施方式之一中，所述回补质粒中天冬氨酸半缩醛合成酶编码序列的起始密码子是GTG。实施方式之一中，所述SD-asdB片段中的SD序列是AAGA。实施方式之一中，所述SD-asdB片段的序列是SEQ ID NO: 2，另一实施方式中为SEQ ID NO: 3所示。实施方式之一中，所述异源免疫原是嗜水气单胞菌的甘油醛三磷酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。实施方式之一中，所述甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPDH)的编码序列如SEQ ID NO:5中所示。
实施方式之一中，所述回补质粒含有与所述异源免疫原操作性相连的迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子Pdps,例如迟钝爱德华氏菌EIB202基因组扩增获得铁诱导性启动子Pdps，其序列如SEQ ID N0:6所示。本发明还提供了所述迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株防治迟钝爱德华氏菌和/或嗜水气单胞菌感染的医药用途，例如用于制造鱼用药物。本发明的无抗多效价载体活疫苗具有高效的针对迟钝爱德华氏菌以及嗜水气单胞菌的双重免疫保护力，消除了传统减毒载体活疫苗中所包含的抗生素标记，大大降低了普遍存在的潜在环境和产品安全风险，是针对养殖鱼类疾病的一种安全、有效、经济的疫苗。实施方式之一中，本发明提供了一种迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株的制齐U，其中包含本发明迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株和在药理上可接受的载体。实施方式之一，所述载体活疫苗株的菌体细胞浓度为IO2 109CFU/ml数量级，或者IO4 106CFU/ml数量级，例如107CFU/ml。实施方式之一中，所述载体是无菌生理盐水，例如NaC19g/L，pH为7.2的生理盐水。本发明还提供采用本发明迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株或本发明多效价载体活疫苗株制剂防治养殖鱼类的迟钝爱德华氏菌病和嗜水气单胞菌病中的方法。实施方式之一中，所述迟钝爱德华氏菌载体活疫苗株或所述制剂通过注射方式给药，其中菌体细胞浓度为IO2 109CFU/ml数量级，或者IO4 106CFU/ml数量级，例如107CFU/ml。本发明的有益效果包括:1.本发明的迟钝爱德华氏菌无抗表达体系，替换了一般质粒载体上的抗性筛选标记，避免了抗性基因可能产生漂移所带来的生物安全性问题，具有实际的商业开发价值。2.本发明的迟钝爱德华氏菌无抗表达体系，使疫苗株依赖于质粒存活，使质粒可以更稳定的存在于疫苗株体内而不发生质粒的丢失，从而促进质粒上的抗原基因持续、稳定的表达，与传统的多效价疫苗相比，能够激发更高效的鱼体免疫反应，产生更好的免疫保护效果。3.本发明的无抗质粒表达体系为构建多效价载体疫苗的商业化进程提供了现实的开发和应用前景。
图1是本发明实施方式之一，基因敲除法构建asdB缺失菌株流程图。图2是Overlap PCR方法扩增构建无抗回补质粒pUTta4流程图，其中，图A为本发明中构建无抗回补质粒PUTta的结构图谱，图B为本发明中优化pUTta无抗质粒获得最终的pUTta4的构建策略图。图3是pUTta4DGap的结构图。图4是以大菱鲆为试验动物的浸泡给药免疫E.tarda EIB202和LSA34的免疫保护力试验结果柱状图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本申请的保护范围。实施例材料与方法:pDMK质粒和pUTt质粒由华东理工大学生物工程学院上海阿华生物工程研究所构建，并已经公开于 “Edwardsiella tarda T6SS component evpP is regulated by esrBand iron, and plays essential roles in the invasion of fish，，，Wang, X 等，FishShellfish Immumol,27(3):469-477，2009 和“Iron-regulated lysis ofrecombinantEscherichia coli in host releases protective antigen and confers biologicalcontainment”，Guan, L.等，Infect Immun, 79 (7):p.2608-18, 2011。SMlO 菌株由中国疾病控制中心流行病研究所惠赠，E.coli A asd和WED/pUTDGap为本实验室所有。申请人华东理工大学在此声明保证从本申请申请日起二十年内向公众按需提高PDMK质粒、pUTt质粒、SMlO 菌株、E.coli A asd 菌株和 WED/pUTDGap。大肠杆菌E.coli ToplO:购自英骏生物技术(Invitrogen)公司。迟钝爱德华氏菌毒株EIB202:已于2008年5月I日提交武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC N0:M208068。该菌株的相关记载另可见于 “Isolation and identification of fish pathogen Edwardsiella tarda frommariculture in China，，，Xiao, J 等，Aquacult Res, Vol.40, 2009。嗜水气单胞菌LSA34:已于2009年6月10日提交武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC N0:M209124。该菌株的相关记载另可见于中国专利公开 CN101659958(申请号:CN200910054113.9)。迟钝爱德华氏菌减毒株WED:已于2010年10月24日提交武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC N0:M2010278o该菌株的相关记载另可见于中国专利申请公开CN101974472A。迟钝爱德华氏菌减毒株EIB AVMl:已于2012年9月12日提交武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC N0:M2012341LB 液体培养基:胰蛋白胨(Difco) 10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaC15g/L，pH7.5 ；LB斜面培养基:胰蛋白胨(Difco) 10g/L，酵母浸出物(Merck) 5g/L，NaC15g/L，琼脂 18g/L，pH7.5 ；种子培养基:胰蛋白胨(Difco) 10g/L,酵母浸出物(Merck)5g/L, NaC15g/L,苯丙氨酸20mg/L,酪氨酸20mg/L,色氨酸20mg/L,对轻基苯甲酸20mg/L,对氨基苯甲酸20mg/L,pH7.5 ；发酵培养基:胰蛋白胨(Difco) 10g/L,酵母浸出物(Merck)5g/L, NaC15g/L,苯丙氨酸20mg/L,酪氨酸20mg/L,色氨酸20mg/L,对轻基苯甲酸20mg/L,对氨基苯甲酸20mg/L,pH6.8 ；生理盐水:NaC19g/L，pH7.2，121°C灭菌 20 分钟。以下例实施例中，除非特别说明，所涉方法、操作或步骤皆按照本领域常识、常规中常用条件下进行， 例如《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring HarborLaboratore Press, 1989)中所述或厂商推荐的条件和流程。实施例1迟钝爱德华氏菌无抗重组疫苗株的构建( 一 ) asdB基因缺失菌株的构建I) PCR扩增获得所需基因片段如图1所示，以迟钝爱德华氏菌EIB202(保藏编号:CCTCC_M208068)的基因组为模版，利用下列扩增引物:Pl:GAAGATCTTCGCTACGCCGTCAACGCCGCAGAA, SEQ ID NO:7P2:TTCGGATAGATACTGCTGCCTTGGATGGTGACGAGTTGC, SEQ ID NO:8P3:CAGTATCTATCCGCCTTTACCGTGGGC, SEQ ID NO:9P4:CATGCATGCGTGAACGCCTACCTGGAGATCGAGAA, SEQ ID NO: 10首先分别用Pl和P2、P3和P4扩增获得Overlap PCR所需的上下片段F1，F2。回收各片段后，利用Overlap PCR技术采用Pl和P4获得asdB基因缺失片段F1F2。采用TIANGEN公司的胶回收试剂盒回收目标基因片段。琼脂糖凝胶电泳结束后，EB染色，在长波紫外灯上迅速切下目的条带，装入Eppendorf管并称取重量，加入3倍体积的溶胶液PN，50°C水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；将得到的溶液加入吸附柱中离心(12，OOOrpm离心30sec)，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入700 ii I漂洗液PW，12，OOOrpm离心30sec，倒掉废液，再用500 ill漂洗液PW 12，OOOrpm离心30sec，倒掉废液。将离心吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm离心2min，尽量出去漂洗液，再将吸附柱置于室温或50°C温箱数分钟，彻底地晾干后，将其放到一个干净地离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加不少于30 Ul的洗脱缓冲液EB buffer,室温放置2min，12，OOOrpm离心Imin收集含目的片段的DNA溶液，电泳检测回收DNA浓度。2)构建自杀工具质粒如图1所示，将pDMK载体多克隆位点的BglII位点和SphI位点切开后，将片段F1F2与切割后的质粒用T4DNA连接酶16°C连接过夜。CaCl2转化法转化SMlO，得到质粒载体 pDMKasdB。3)接合如图1所示，将携带有pDMKasdB质粒的SMlO按体积比2比I的比率与迟钝爱德华氏菌疫苗株WED (保藏号:CCTCC N0:M2010278)混合离心，去除上清液，用10微升新鲜LB培养基重悬沉淀。将0.22微米灭菌后的水性滤膜平整铺放在新鲜半固体LB培养基上，取出全部菌悬液点置于水性膜中央。37°C培养24小时后，用0.2M的MgCl2将水性膜上的菌落洗脱下，涂布于卡那霉素/多粘菌素双重抗性平板。4)正向筛选asdB基因插入失活克隆如图1所不，自杀质粒pDMKasdB插入到基因组上asdB基因中。利用卡那霉素/多粘菌素双重抗性平板筛选，挑取阳性克隆，以P1/P4为引物的PCR扩增验证插入。5)筛选asdB基因缺失菌株如图1所示，在10%蔗糖LB半固体培养基平板上，利用pDMK上sacB基因可反向筛选获得发生第二次同源重组的菌株。以引物Pl和P4通过PCR验证获得了 asdB缺失突变菌株,命名为WED A asdB。
(二)无抗回补质粒的构建利用引物asdB-F (CCGCTCGAGCTCGAGAGGAGTGCATATGAAAA, SEQ ID NO: 11),asdB-R(CCCAAGCTTCTAGAGCAGCAGCCTCAGCATACGG, SEQ ID NO: 12)从迟钝爱德华氏菌 EIB202 基因组上扩增得到SD-asdB片段(SEQ ID NO: 2),做TA克隆，从E.coli ToplO中抽提T载体测序并酶切，如前所述回收 SD-asdB 片段。使用 pUT-For (CCGCTCGAGACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGA, SEQ ID NO: 13)、pUT-Res (GAAGATCTTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCAT, SEQ ID NO: 14)引物以质粒pUTt为模板扩增得到该质粒的无Amp质粒片段。将SD-asdB片段与pUTt的无Amp质粒片段进行连接，然后转化到E.coliAasd中进行阳性克隆筛选，获得重组质粒pUTta。考虑到过高的回补基因表达会对细 菌的生长代谢产生负担，我们对该无抗表达系统进行了优化，将野生型的SD序列由AGGA改变为AAGA，并将asdB基因的起始密码子由ATG改为 GTG。用 asdB-F’ (5’ -CCGCTCGAGCTCGAGAAGAGTGCATGTGAAAAAC-3’ , SEQ ID NO: 19)和 asdB-R(CCCAAGCTTCTAGAGCAGCAGCCTCAGCATACGG, SEQ ID NO: 12)从迟钝爱德华氏菌 EIB202基因组上扩增得到优化的SD-asdB片段(SEQ ID NO: 3)。然后如前所述，将该优化SD-asdB片段与pUTt的无Amp质粒片段进行连接,获得无抗回补质粒pUTta4。(三)无抗的多效价减毒活疫苗WEDA asdB/pUTta4DGap的构建首先构建嗜水气单胞菌LSA34的甘油醛三磷酸脱氢酶(简称gapA34)的表达质粒。使用下列引物:dps-F(CGGAATTCACGCCGCATCAGCGCTGAAAA), SEQ ID NO: 15dps-R(ATACCTACTTTGATAGTCATTCTGCATGCTCTCCTTGGATG)，SEQ ID NO: 16gapA34-F(ATGACTATCAAAGTAGGTAT)，SEQ ID NO:17gapA34-R(AACTGCAGTTACTTAGAGATGTGAGCGATCAGG), SEQ ID NO: 18以dps-F/dps-R从迟钝爱德华氏菌EIB202基因组扩增获得铁诱导性启动子dps片段(SEQ ID N0:6)，以gapA34-F / gapA34_R从嗜水气单胞菌LSA34基因组扩增获得gapA34片段(SEQ ID NO:5),回收目标片段后采用Over-1ap的方式获得片段dps-gapA34连接片段。将获得的dps-gapA34片段与无抗回补质粒pUTta4用EcoRI和PstI酶切后，用T4DNA连接酶16°C连接过夜。然后用重组无抗回补质粒pUTta4转化大肠杆菌E.coli A asd验证阳性的样品，测序验证，得到的gapA34表达质粒命名为pUTta4DGap,见图3。2)将获得的gapA34表达质粒pUTta4DGap电转到前文构建的缺失株WED A asdB中，使用PCR、酶切的方法进行验证，获得阳性克隆，即WED AasdB/pUTta4DGap，命名为迟钝爱德华氏菌EIB AVMl，于2012年09月12日于武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC N0:M2012341o(四)无抗多效价减毒活疫苗(WEDA asdB/pUTta4DGap)制剂的配制取一接种环保存于LB斜面培养基上的减毒疫苗株种子WED A asdB/pUTta4DGap,接种于装有IOOml液体LB种子培养基的500ml摇瓶，在30°C下振荡培养(转速200转/分钟)。12小时后，取5ml生长旺盛的菌液(0.D=4.0左右)接种于IOOml新鲜发酵培养基，30°C培养12小时。用无菌生理盐水洗涤3次，离心收获菌体(2000g，15min, 15°C )，无菌生理盐水稀释成一定浓度悬液(IO2 - 109CFU/ml)，保藏于15°C备用。实施例2:以斑马鱼为试验动物的半致死量LD50测定:试验用鱼先置于SPF(Specific Pathogen Free)实验室适应养殖I周，以剔出不正常个体。在感染试验前，再将SPF试验用鱼放养于感染实验室(Challenge Lab)中IOL感染试验水槽,继续喂养I周,每槽放养10条(平均体长11 - 12cm,体重30g)。试验水槽每天使用无菌陈海水替换2/3体积养殖水，水温16°C，上下波动2°C。将试验用鱼随机分组，每组2个水槽平行试验。在感染试验中，每组试验鱼用一定梯度剂量(IO2 - 109CFU/ml)的迟钝爱德华氏菌野生毒株、减毒疫苗株和回补株通过尾部肌肉注射进行人工感染。记录10天内，每组每个感染剂量下每天的死亡尾数，并计算累计死亡率，，用Reed-Muench法计算各菌株的半致死剂量(LD5tl)，根据实验动物体重换算成CFU/g体重(见表I)。其计算公式如下:LD50=10[&-1(Sp-oS]其中:Xm:最大剂量的对数值1:相邻两组剂量对数值之差P:各组动物死亡率,用小数表示(如:死亡率为80%则写成0.8)E P:各组动物死亡率之总和表I迟钝爱德华氏菌疫苗株和回补株对斑马鱼的LD5tl
权利要求
1.一种迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株，其特征在于，所述迟钝爱德华氏菌基因组缺失天冬氨酸半缩醒合成酶基因asdB,并含有回补质粒,所述回补质粒含有SD-asdB片段和异源免疫原编码序列，所述SD-asdB片段由操作性相连的SD序列和迟钝爱德华氏菌天冬氨酸半缩醛合成酶编码序列构成，所述回补质粒不含抗生素标记，所述异源免疫原编码序列与调控序列操作性相连从而能够在迟钝爱德华氏菌中表达。
2.如权利要求1所述的活疫苗株，所述回补质粒中天冬氨酸半缩醛合成酶编码序列编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，较好的是，所述编码序列的起始密码子为GTG。
3.如权利要求1所述的活疫苗株，所述SD-asdB片段中的SD序列是AAGA。
4.如权利要求1所述的活疫苗株，所述SD-asdB片段的序列选自SEQID NO:2所示和SEQ ID NO:3 所示。
5.如权利要求1所述的活疫苗株，所述异源免疫原是嗜水气单胞菌的甘油醛三磷酸脱氢酶即GAPDH，例如氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示的GAPDH，较好的是，所述GAPDH的编码序列如SEQ ID NO:5中所示。
6.如权利要求1所述的活疫苗株，所述回补质粒含有与所述异源免疫原操作性相连的迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子Pdps。
7.如权利要求6所述的活疫苗株,所述铁诱导性启动子Pdps序列如SEQID NO: 6所示。
8.如权利要求1所述的活疫苗株，其中，以保藏号为CCTCCN0:M2010278的迟钝爱德华氏菌WED为出发菌株构建而得。
9.如权利要求1所述的活疫苗株，所述回补质粒以PUTt质粒为出发质粒构建而成。
10.如权利要求1所述 的活疫苗株，是保藏号为CCTCCN0:M2012341的迟钝爱德华氏菌EIB AVMl0
11.制造权利要求1所述迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株方法，包括: 敲除迟钝爱德华氏菌出发菌株的基因组天冬氨酸半缩醛合成酶基因asdB，制得asdB缺失菌株， 获取回补质粒，所述回补质粒含有SD-asdB片段和异源免疫原编码序列，所述SD-asdB片段由操作性相连的SD序列和迟钝爱德华氏菌天冬氨酸半缩醛合成酶编码序列构成，所述回补质粒不含抗生素标记，所述异源免疫原编码序列与调控序列操作性相连从而能够在迟钝爱德华氏菌中表达， 用所述回补质粒转化所述asdB缺失菌株，得到所述迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株。
12.如权利要求11所述的方法，所述迟钝爱德华氏菌出发菌株是保藏号为CCTCCNO:M2010278的迟钝爱德华氏菌WED。
13.如权利要求11所述的方法，所述回补质粒以pUTt质粒为出发质粒构建而成。
14.如权利要求11所述的方法，所述回补质粒中天冬氨酸半缩醛合成酶编码序列编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，较好的是，所述编码序列的起始密码子是GTG。
15.如权利要求11所述的方法,所述SD-asdB片段中的SD序列是AAGA。
16.如权利要求11所述的方法，所述SD-asdB片段的序列选自SEQID N0:2所示和SEQID NO:3 所示。
17.如权利要求11所述的方法，所述异源免疫原是嗜水气单胞菌的GAPDH，例如氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的GAPDH，较好的是，所述GAPDH的编码序列如SEQ ID NO: 5中所示。
18.如权利要求11所述的方法，所述回补质粒含有与所述异源免疫原操作性相连的迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子Pdps。
19.如权利要求18所述的方法，所述铁诱导性启动子Pdps序列如SEQID NO:6所示。
20.权利要求1所述迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株用于制造鱼用药物的用途，所述药物用于防治迟钝爱德华氏菌和/或嗜水气单胞菌感染。
全文摘要
本发明涉及一种无抗多效价迟钝爱德华氏菌载体活疫苗、其制备及其应用。所述迟钝爱德华氏菌基因组缺失天冬氨酸半缩醛合成酶基因asdB，并含有回补质粒，所述回补质粒含有SD-asdB片段和异源免疫原编码序列，所述回补质粒不含抗生素标记。
文档编号A61P31/04GK103146627SQ20131006423
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者刘琴, 张元兴, 王启要, 吴海珍, 肖婧凡, 闫一剑 申请人:华东理工大学