专利名称：一种用于水稻光敏雄性核不育基因lncR分型的引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业生物工程技术领域，尤其涉及一种用于水稻光敏雄性核不育基因IncR分型的引物及其应用。
背景技术：
植物雄性不育特性可由细胞质基因引起，称细胞质雄性不育(CMS)，也可因核基因突变引起，又名核基因雄性不育(GMS)。水稻是自花授粉作物，其杂种优势利用必须依赖于雄性不育性。在杂交水稻研究和应用之初，使用的雄性不育系都是CMS类型。1973年石明松在湖北晚粳稻品种农垦58群体中发现了自发突变的光周期敏感雄性不育(photoperiod-sensitive genic male sterile, PGMS)株,后来定名为农星 58S (石明松，中国农业科学，1985，2:44-48)，开启了利用光温敏雄性不育特性培育两系法杂交水稻的序眷。经过几十年的研究，两系不育系根据其对光照长度和温度的敏感性可分为光敏不育(PGMS)、温敏不育(temperature-sensitive genic male sterility, TGMS)和光温敏核不育(P/TGMS)三类(程式华，中国农业科学，1996，29 (4): 11-16)。PGMS水稻具有长日照条件下抽穗雄性不育，短日照条件下抽穗雄性可育的基本特征，如农垦58S及其衍生的部分不育系。TGMS水稻在高温条件下抽穗雄性不育，低温条件下抽穗雄性部分可育，如安农S-1(邓华凤等，杂交水稻，1999，14(3): 1-3)，株IS (杨远柱等，杂交水稻，2000，15 (2): 6_9)等。PGMS和TGMS共同构成了目前生产上大面积应用的两系法杂交稻不育系基因的主要来源。有的水稻则对光照和温度都有一定的敏感性，在长日照、高温下抽穗表现不育，短日照、低温下表现部分可育，如培矮64S (罗孝和等，杂交水稻，1992，(1):27-29)。系谱分析表明大多早期商业化应`用的P/TGMS系主要有3个起源:农垦58S，安农S-1和株IS (斯华敏等，作物学报，2012，38 (3): 394-407)。在农垦58S衍生的后代中有些保持了光敏特性如玉兔S (赵海军等，中国水稻科学，2004，18(6):515-521)，而有些则表现为温敏特性如广占63S (杨振玉等，杂交水稻，2002，17(4):4_6)。大量遗传分析表明，PGMS 和 TGMS 都受单隐性基因控制，如安农 S-1 (Yang et al.Planta, 2007，225:321-330)，株IS (杨远柱等，中国稻米，2007，(6): 17-22)。为精细定位并最终克隆PGMS，Ding 等(PNAS, 2012，109:2654-2659)和 Zhou 等(Cell Research, 2012，22:649-660)分别以农垦58S和培矮64S为PGMS基因供体，通过和可育材料杂交建立分离群体，在精细定位确定控制农垦58S (pms3)和培矮64S (p/tgmsl2-l)雄性不育候选基因的基础上，采用遗传互补试验确定了一个位于第12号染色体上编码长链非编码RNA基因(IncR)为该不育系的PGMS基因，其在第789位碱基由C — G的转换是造成PGMS的原因。虽然在先前的研究中开发了与光敏不育基因相连锁的分子标记(Luet al.MolGen Genomics, 2005，273:507-511),但在 Ding 等(Ding et al, 2012)和 Zhou 等(Zhou etal，2012)研究中开发的与PGMS连锁的分子标记最为紧密。Ding等(Ding et al, 2012)分别在距该基因5’和3’端约5kb和5.8kb处找到了在农垦58S和DH80之间存在多态性的插入/缺失标记M4和M1，而Zhou等(Zhou et al, 2012)则在培矮64S和培矮64之间设计了标记PA301和PAIDL2，分别于突变位点的5，和3，端相距约5kb和Ikb0除上述提及的两系水稻不育系外，不同研究所还报道了不少独立发现的P/TGMS不育水稻材料，有的已经育成商用不育系在两系杂交水稻生产中应用，如琼香is (郭国强等，杂交水稻，2009，24 (I): 399-400)，绵9S(王志等，西南农业学报，1999，12 (4): 11-14)，雁农S (阳花秋等，杂交水稻，1996(1):9-10)等，但均未见有这些不育基因的分子标记的公开报道。在水稻两系不育系选育中，通常需要在田间自然条件下鉴定不育单株。但是，光温条件在各地及同一地点的不同季节存在很大差异，这对两系不育系的选育十分不利。如:(I)海南是我国水稻冬 、春季节水稻加代繁育的重要场所，但是由于日照较短，PGMS水稻一般不表现雄性不育，因此，在海南PGMS基本不能表达，从而制约了两系不育系的选育。(2)在广东等南方地区早季播种时，由于日照也较短，因此也较难开展PGMS水稻的选育工作；
(3)在长江流域及北方水稻区，PGMS水稻在正常水稻生产季节都表现为不育，一旦选到不育株，需要在割茬再生后才有可能结实；并需要将稻桩带海南、让其再生分蘖才能获得种子，不但费时费力，而且严重制约可选择群体的大小。分子标记辅助选择是目前作物育种中的一种先进育种方法。对PGMS这样的性状，基于如上所说的原因，利用分子标记辅助选择育种尤为重要。因为，即使生长环境无法使其PGMS特性得以展现，利用分子标记仍然可以确定其基因型。此外，一旦确定其基因型，还可以通过调节播期有意让其在可育环境下开花结实，避免需要采用割茬再生、冷水灌溉等费力但效果欠佳的方法。但是，可能是由于没有特别适宜的分子标记，迄今尚未见基于分子标记辅助选择PGMS水稻的报道。同时，由于尚无PGMS基因特异性分子标记，迄今尚未能将PGMS基因像其他基因一样如抗稻瘟病基因(董巍等，分子植物育种，2010,8(5):853-860)和白叶枯病抗性基因(兰艳荣等，中国水稻科学，2011，25(2): 169-174)聚合在一个不育系中，提闻不育系对环境的稳定性。目前用于辅助选择育种的分子标记主要有微卫星标记或SSR标记，INDEL标记，RFLP标记，RAPD标记，AFLP标记，STS标记和基于PCR扩增的限制性酶切的CAPS或dCAPS标记(冯建成，中国农学通报，2006，22(2):43-47)。最近，利用有序列变化的扩增子之间微弱的Tm值差异，通过DNA片段溶解曲线的差异进行突变检测的原理，还发展起了区分SNP的 HRM 分析方法(Reed et al.Pharmacogenomics, 2007, 8:597-608),以及基于 DNA 分子杂交的SNP芯片技术。与其他性状一样，在其基因被克隆之前，可以获得与目标性状基因无限接近、在不同品种之间具有多态性的的分子标记。根据与光敏不育紧密连锁的Ml，M4和PA301, PAIDL2 (Ding et al.2012, PNAS, 109(7):2654-2659 ；Zhou et al.2012, Cellresearch, 22:649-660)开发的分子标记只与研究的表型存在遗传上的连锁关系，在生物学上不存在因果关系，即不是功能性分子标记。这样，在实际应用中，首先要确定在研究的不育系和野生型材料之间是否存在多样性，只有在存在多样性的前提下，才能进一步用于分子标记辅助选择等。在很多情况下，特别是品种之间杂交时往往不存在多态性；同时，即使存在多态性，由于只是连锁关系，而减数分裂时的基因重组会打破这种连锁关系，从而影响选择效果。功能性分子标记是指根据在基因水平上决定某一性状差异的核苷酸序列而开发的分子标记，其特征是用该标记表示的不同等位基因直接代表一种表型性状，标记与性状之间不像其他标记只是连锁关系(连锁关系意味着标记与性状之间存在多种可能的相斥或相向关系；同时，在育种过程中这种连锁关系可能被打破)。迄今，尚无公开报道开发出了水稻PGMS基因的功能性分子标记，因此也未见有这类标记在PGMS水稻育种中的应用。
发明内容
本发明提供了一种引物，特异性强。一种引物，碱基序列为:上游引物:5’-ATCCCACAAATCCTTTAGCA-3’ ；下游引物:5’ -CCGTTATAGATAGACCCGAGA-3，。本发明还提供了所述引物在水稻光敏雄性核不育基因IncR分型中的应用。采用CAPS标记方法，利用上述引物，可以用来对水稻光敏雄性核不育基因IncR进行分型，具体包括:(I)提取水稻样品的DNA ；(2)以DNA为模板，采用所述的引物，进行PCR扩增；(3)用限制性 内切酶Rsa I对PCR扩增产物进行酶切，酶切产物进行凝胶电泳分离，成像；(4)根据成像结果，判断水稻样品的基因型:如果只出现414bp的特征带，则该水稻样品为携带IncR基因的纯合非光敏不育材料；如果只出现329bp和85bp两条特征带,则该水稻样品为携带突变型IncR基因的纯合光敏雄性不育材料；如果出现414bp、329bp和85bp三条特征带,则该水稻样品为携带IncR基因和突变型IncR基因的杂合材料。造成水稻光敏雄性不育的IncR基因内的C — G的变化产生了一个Rsa I的酶切位点，因此围绕包含该变异位置设计特异性PCR引物，扩增DNA片段，用Rsa I酶切后，根据切出的片段大小即可判断水稻样品的基因型。所述的水稻样品可以为籼稻、粳稻或非洲栽培稻，也可以为不同类型水稻杂交产生的非典型的籼稻、粳稻、非洲栽培稻等。按品种划分，所述的水稻样品可以为水稻常规品种、杂交品种、育种中间材料等，当然，所述水稻样品也可以为采用杂交以外的方法得到的新品系。提取水稻DNA时，可以采用水稻的种子、叶片、根、花器等组织。对水稻DNA的提取方法也没有特殊要求，可以为CTAB法、SDS提取法、ROSE —管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用试剂盒进行DNA的提取。所述PCR 扩增的体系为:2XPCR Master Mix，10 μ L ; 10 μ M 的上游引物，0.4 μ L ;10 μ M的下游引物，0.4 μ L ；25ng/ μ L的DNA, I μ L ;补充无菌水至20 μ L。
所述PCR扩增的程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，50_60°C退火30s，72°C延伸30s，共35-45个循环；72°C延伸7min。所述酶切的反应体系为:10XTBuffer, I μ L ；0.1%BSA, I μ L ；Rsa I ,0.3μ L ；PCR扩增产物，5 μ L ;无菌水补足至10 μ L。所述酶切的反应条件为:37°C水浴4_12h。采用HRM标记方法,利用上述引物,可以用来对水稻光敏雄性核不育基因IncR进行分型，具体包括:(I)提取水稻样品的DNA ；(2)以DNA为模板，采用探针引物和所述的引物，进行PCR扩增；其中，所述探针引物的喊基序列为:5’ -GTGCATTGTTTGTGTACCATCCATC-3’ ；(3)获取PCR扩增产物的溶解曲线，判断水稻样品的基因型:如果只在62 64°C出现特征峰，则该水稻样品为携带IncR基因的纯合非光敏不育材料；如果只在67 69°C出现特征峰，则该水稻样品为携带突变型IncR基因的纯合光敏雄性不育材料；如果在62 64和67 69°C均出现特征峰，则该水稻样品为携带IncR基因和突变型IncR基因的杂合材料。`
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所述PCR扩增的体系为:2XPCRMaster Mix，10 μ L ; 10 μ M 的上游引物，0.02 μ L ;10 μ M 的下游引物,0.2 μ L ;10 μ M 的探针引物，I μ L ;10XLC green-Plus, I μ L ；25ng/y L的DNA，I μ L ;补充无菌水至6.78 μ L ;矿物油10-20 μ L。所述PCR扩增的程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，50_60°C退火30s，72°C延伸30s，共35-45个循环；72°C延伸7min。PCR扩增产物的溶解曲线可由HRM分析仪分析得到。本发明又提供了一种所述弓I物在选育光敏雄性核不育水稻中的应用。该应用具体为:采用光敏不育水稻和其它水稻材料杂交,获得杂种F1，进一步采用杂交育种、回交育种或单倍体育种方法获得后代材料，利用上述引物，采用CAPS或HRM分子标记对水稻光敏雄性核不育基因IncR进行分型，确定后代材料的基因型，进而育成稳定的光敏不育系。所述光敏不育水稻是指任何携带突变型IncR基因的水稻，包括携带突变型IncR等位基因的纯合型光敏不育水稻和只携带一个突变型IncR等位基因的杂合水稻材料；所述其它水稻材料包括携带一个突变型IncR等位基因的杂合水稻材料和不携带突变型IncR等位基因的纯合型非光敏水稻材料。所述杂交育种是指携带突变型IncR等位基因的杂交水稻材料通过自花授粉产生后代，如F2代水稻材料自交获得F3群体；杂合F3代水稻材料自交获得F4群体等。所述回交育种是指携带突变型IncR等位基因的水稻材料与其他水稻材料杂交产生的杂种进一步与光敏不育系杂交，获得BC1代材料，并继续回交或自交产生后代，如BC2或BC1F2 等。所述单倍体育种方法是指采用花药培养等手段获得纯合水稻群体。
所述稳定的光敏不育系是指IncR位点已经纯合，均为突变型IncR等位基因，同时基因组的其他位点也已经纯合在表型上不再有明显分离，可以用做光敏不育系生产。与现有技术相比，本发明的有益效果为:(I)本发明的引物特异性好，将其运用到CAPS (酶切扩增多态性序列)或HRM (高分辨率溶解曲线)分子标记中，对水稻光敏雄性核不育基因IncR进行分型，简单，有效，准确率高，同时费用也较低。(2)本发明针对光敏不育基因IncR的序列特点，设计引物，开发了 CAPS或HRM分子标记。
本发明开发的分子标记是根据造成水稻光敏雄性不育性状变异的遗传基础，即在确定造成水稻光敏雄性不育生物学机制的基础上发展起来的，因此属于功能性分子标记。这样，本发明开发的分子标记在育种中不但适用于任何组合，而且也不会因遗传重组而发生变化，具有通用性和广适性。(3) HRM分子标记易于高通量操作。采用HRM分子标记时，由于在PCR结束后，扩增产物可以在仪器上如LightScanner上直接分型，因此较其他类型的分子标记更加适用于高通量分析。(4)利用本发明的引物辅助育种，方便、准确，节约成本，能大大提高品种选择效率，加快光敏不育水稻品种育种进程，而且可以避免环境因素对于表型的影响。
图1为利用CAPS分子标记检测水稻光敏雄性核不育基因IncR的基因型的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M:DNA分子量标准，由上到下依次为600bp，500bp，400bp，300bp，200bp ;泳道1:日本晴(WT);泳道2:华201S(光敏不育);泳道3:华201S/日本晴F1 ;泳道4-24分别为检测样本:玉兔 S ;华 201S ；DS403 ；GS48 ；GS79 ；DS550 ；DS551 ；DS552 ;蜀光 612S/ 云 R58F!；广湘 24S 5N422S/R8272F!；W6154S ；ZhulS ;广占 63S ；Y58S ;海丰 IS ；1892S ;桂科-1S ;桂科-2S ；X07S ；图2a为水稻光敏不育基因IncR的高分辨溶解曲线(HRM)基因分型中不同基因型随温度变化的溶解曲线图；图2b为水稻光敏不育基因IncR的高分辨溶解曲线(HRM)基因分型中对不同基因型分型的峰图；其中，图2a-图2b中，灰色为日本晴(WT)，红色为华201S(光敏不育)，蓝色为日本晴与华201S的混合型，横坐标为温度(°C)；图3为利用CAPS分子标记对花培得到的不育系进行鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M =DNA分子量标准；泳道1:株IS ;泳道2:日本晴；泳道3 华201S ;泳道4:玉兔S ;泳道5和6:花培得到的不育单株。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。实施例1水稻光敏不育基因功能性分子标记的开发
1、区分光敏不育和野生型等位基因的功能性CAPS分子标记Ding 等(Ding et al.PNAS, 2012，109:2654-2659)和 Zhou 等(Zhou et al.CellResearch, 2012, 22:649-660)的研究显示，光敏核雄性不育水稻农垦58S和培矮64S的光敏核雄性不育(PGMS)是由一个编码长链非编码RNA (IncR)基因的第789位碱基C — G的突变引起。将衍生自农垦58S的光敏不育水稻携带的IncR等位基因定名为IncRg，而非光敏水稻的等位基因定名为lncRe。据此,在Gramene网站(http://www.gramene.0rg/)下载相应的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1所示,利用Primer Premier5.0软件在突变位点区域附近设计一对PCR引物扩增片段包含C — G的突变位点。引物的碱基序列为:上游引物(LR-F):5’ -ATCCCACAAATCCTTTAGCA-3’ ；下游引物(LR-R):5’ -CCGTTATAGATAGACCCGAGA-3’ ；由于该突变产生了一个内切酶的酶切位点Rsa I，因此任何包含该突变位点的扩增片段均可以被Rsa I酶切成329bp和85bp两段，而其他水稻材料不能被酶切，从而开发了一个区别IncRg和IncIT等位基因的CAPS分子标记。如图1所示，该CAPS分子标记能将只携带IncRg等位基因的纯合光敏不育材料和只携带IndT等位基因的纯合野生型材料以及携带这2种等位基因的杂合(但雄性可育)材料加以区分。2、区分光敏不育和野生型等位基因的功能性HRM分子标记直接利用PCR引物LR-F/LR-R进行HRM的Scanning分型时，不能够很好的将不同类型的材料进行区分，因此针对突变位点设计了 3’末端封闭的探针引物，碱基序列为:5’ -GTGCATTGTTTGTGTACCATCCATC-3’ ；利用PCR引物LR-F/LR-R和探针引物根据HRM分析要求进行不对称PCR扩增，积累与探针序列相互互补配对的那条引物的扩增产物，PCR扩增产物直接在HRM分析仪(如LightScanner)分析。如图2a所示，扩增产物在HRM分析仪可以获得每个样本的溶解曲线，这些溶解曲线在60 70°C区段释放的荧光信号强度明显不同，因此扩增产物随着温度的变化具有的不同的溶解曲线，表明属于不同的基因类型。通过软件Grouping分组分析,可以看到与探针序列完全互补配对的纯合光敏不育类型IncRg在较高温度(68°C附近)出现溶解峰，而不与探针序列完全互补配对的纯合可育类型IndT在较低温度(63°C附近)出现溶解峰，含有两种基因型的杂合可育类型则在这两个温度处均出现峰值，因此可以直观清楚地将不同样本分为纯合IncIT (只携带IncIT等位基因)、纯合IncRg (只携带IncRg等位基因)和杂合基因型三类(图2b)。可见只携带IncRg等位基因的纯合光敏材料和只携带IndT等位基因的纯合野生型材料以及携带2种等位基因的杂合(但雄性可育)材料根据温度的变化具有不同的溶解曲线，通过分组操作，三种基因型可以直观地加以区分。实施例2利用CAPS分子标记区分光敏不育和非光敏不育水稻品种2012年收集不同的水稻材料，包括纯合的光敏不育系和含光敏不育基因的杂合型材料以及非光敏不育的材料。这些材料于2012年夏季种植于浙江大学实验农场，自田间处于营养生长期的植株取叶片备用。1、水稻基因组DNA的提取(I)将水稻叶片剪碎后置于2.0mL离心管中，同时放入一粒钢珠，用组织碾磨仪磨碎；(2)加入 800 μ L CTAB 提取缓冲液(Tris-HCl, IOOmM, ρΗ8.0 ；EDTA, 20mM, ρΗ8.0 ；NaCl,500mM ；CTAB, 2%)，65°C水浴 40min,期间摇动 3-4 次；(3)加入等体积的氯仿:异戊醇(24:l,v/v)混合液，上下颠倒混匀，10000r/min离心 IOmin ；(4)转移上清至新的1.5mL离心管中，加入等体积_20°C预冷的异丙醇，轻轻颠倒混勻，置 _20°C下沉淀 30min, 10000r/min 离心 IOmin ；(5)弃上清液,70%乙醇洗漆I次，IOOOOrpm离心IOmin;(6)弃上清液，无水乙醇洗涤I次，自然风干，溶于适量(100-200 μ L) TE溶液中，-20°C保存。2、包含C — G变异的DNA片段的PCR扩增、酶切和分析以提取的水稻DNA为模板，采用实施例1中设计的特异性引物LR-F和LR-R，进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系见表I。表I用于CAPS分子标记的PCR反应体系
权利要求
1.一种引物，其特征在于，碱基序列为: 上游引物:5 ’ -ATCCCACAAATCCTTTAGCA-3，； 下游引物:5’ -CCGTTATAGATAGACCCGAGA-3’。
2.如权利要求1所述的引物在水稻光敏雄性核不育基因IncR分型中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括: (1)提取水稻样品的DNA； (2)以DNA为模板，采用如权利要求1所述的引物，进行PCR扩增； (3 )用限制性内切酶Rsa I对PCR扩增产物进行酶切，酶切产物进行凝胶电泳分离，成像； (4)根据成像结果，判断水稻样品的基因型: 如果只出现414bp的特征带，则该水稻样品为携带IncR基因的纯合非光敏不育材料；如果只出现329bp和85bp两条特征带，则该水稻样品为携带突变型IncR基因的纯合光敏雄性不育材料； 如果出现414bp、329bp和85bp三条特征带，则该水稻样品为携带IncR基因和突变型IncR基因的杂合材料。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的体系可以为:2XPCRMasterMix, 10 μ L ;10 μ M 的上游引物，0.4 μ L ;10 μ M 的下游引物，0.4 μ L ；25ng/ μ L 的 DNA, IyL ；补充无菌水至20 μ L0
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为:94°C预变性5min；94°C变性 30s，50-60。。退火 30s，72。。延伸 30s，共 35-45 个循环；72°C延伸 7min。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括: (1)提取水稻样品的DNA； (2)以DNA为模板，采用探针引物和如权利要求1所述的引物，进行PCR扩增；其中，所述探针引物的喊基序列为:5’ -GTGCATTGTTTGTGTACCATCCATC-3’ ； (3 )获取PCR扩增产物的溶解曲线，判断水稻样品的基因型: 如果只在62 64°C出现特征峰，则该水稻样品为携带IncR基因的纯合非光敏不育材料； 如果只在67 69°C出现特征峰，则该水稻样品为携带突变型IncR基因的纯合光敏雄性不育材料； 如果在62 64°C和67 69 °C均出现特征峰，则该水稻样品为携带IncR基因和突变型IncR基因的杂合材料。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的体系为:2XPCRMasterMix, 10 μ L ; 10 μ M的上游引物，0.02 μ L ; 10 μ M的下游引物，0.2 μ L ; 10 μ M的探针引物，I μ L ;10XLC green-Plus, I μ L ；25ng/y L 的 DNA, I μ L ;补充无菌水至 6.78 μ L ;矿物油10_20u L0
8.如权利要求1所述的引物在选育光敏雄性核不育水稻中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于水稻光敏雄性核不育基因lncR分型的引物及其应用，其中所述引物的碱基序列为上游引物5’-ATCCCACAAATCCTTTAGCA-3’；下游引物5’-CCGTTATAGATAGACCCGAGA-3’。本发明还提供了所述引物在水稻光敏雄性核不育基因lncR分型中的应用，以及在光敏雄性核不育水稻选育中的应用。本发明用于水稻光敏雄性核不育基因lncR分型的引物特异性好，将其运用到CAPS或HRM分子标记中，对水稻光敏雄性核不育基因lncR进行分型，简单，有效，准确率高。
文档编号C12Q1/68GK103146696SQ20131009697
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月25日 优先权日2013年3月25日
发明者舒庆尧, 张华丽, 黄建中 申请人:浙江大学, 浙江之豇种业有限责任公司, 无锡求是生物农业有限公司