专利名称：解淀粉芽孢杆菌添加前体物发酵法生产抗病毒药物利巴韦林的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生化工程领域，涉及一种基因工程菌添加前体物发酵法生产抗病毒药物利巴韦林的工艺。
背景技术：
利巴韦林(ribavirin)，化学名为1-β _D_呋喃核糖基-1H-1，2，4_三氮唑_3_羧酰胺，别名病毒唑，是一种广谱抗病毒药物，对多种DNA和RNA病毒均有显著抑制作用，在抗病毒临床实践中得到广泛应用。利巴韦林生产方法有化学合成法、发酵法和酶法三类。目前，国内在工业生产上实施的化学合成法占绝大多数，存在副产物多，产率低，操作步骤多，污染严重，成本高等不足。酶法生产利巴韦林由Witkowski等首创，在上个世纪80、90年代发展起来，随后被广泛应用于利巴韦林的生产,但酶法生产利巴韦林的酶源细胞生产成本较高,必须先经过对菌体进行分离后才能投入到反应中，菌体培养过程与利巴韦林生产过程分为两个阶段，不能实现偶联，且需要维持较高的反应温度。添加前体物发酵法(日本公开专利17830/1979)具有原料成本低，来源广泛，能耗低，菌体培养与利巴韦林生产的过程同步进行等优点，但是到目前为止，此法产量较低，仍然处于实验室研究阶段，不能投入到 工业生产当中，其关键原因在于:由于技术瓶颈，目前的利巴韦林生产菌株不能兼具高效生产核苷和高效表达嘌呤核苷磷酸化酶这两种特点。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的上述问题，提供一种利用解淀粉芽孢杆菌添加前体物发酵法生产抗病毒药物利巴韦林的生产工艺。该工艺以鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌TA208为改造对象，大幅度提高了该菌合成嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的能力，突破了一直以来不能突破的瓶颈，实现只要在培养基中添加前体物TCA (I, 2，4-三氮唑-3-羧甲酰胺)就可以直接生产利巴韦林。其优点在于工艺简单，生产周期短，产量高，糖苷转化率高，不需要高温条件，降低了利巴韦林的生产成本。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌添加前体物发酵法生产抗病毒药物利巴韦林的生产工艺，其步骤如下:A、利用分子生物学技术以鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌TA208作为宿主菌构建兼具高效表达嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的基因工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP):利用PCR技术从枯草芽孢杆菌BS168中扩增低分子量嘌呤核苷磷酸化酶编码基因pupG，与经过改造的表达载体PBSA43连接，构建了具有较高表达效率和很高质粒稳定性的分泌型表达载体pBSA43-Bs816PNP 和工程菌 RBVM (pBSA43_Bs816PNP)，详细过程见实施例1。
(注:鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌TA208的选育及发酵工艺的研究由本实验室的武改红于2005年完成；编码高酶活力的嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆表达、重组蛋白纯化及酶学性质研究由本实验室的夏俊刚于2010年12月在《中国生物工程杂志》第30卷第12期发表。经进一步改造获得的利巴韦林工程菌RBVM (pBSA43-Bs816PNP)现保藏于天津科技大学代谢工程研究室。)B、工程菌添加前体物发酵:将步骤A中获得的经扩大培养的菌种RBVM(pBSA43-Bs816PNP)接入发酵培养基进行工程菌添加前体物发酵，发酵培养基中碳源含量应为8% 12%，氮碳比N: C应介于10:100 15:100之间，无机盐含量应为0.1% 12%，发酵培养基的初始PH7.2 7.8，培养温度33°C 35°C，振荡培养或发酵罐培养60 80h，接种量为5% 10% (V/V)，发酵过程中，添加氨水调节发酵液的pH值维持在7.0 7.4，发酵开始12-24h添加TCA。(I).发酵培养基葡萄糖8% 12%,酵母膏0.8% 1.0%,豆浓1.6% 2%,玉米浆1% 2%, (NH3) 2S041% 1.5%, MgSO4.7Η20 0.1% 0.15%, KH2PO4 0.1% 0.3%, FeSO4 2 4mg/L，自来水 96% 98%，培养基pH值为7.0 7.4。(2).发酵控制工艺采用5L发酵罐，发酵温度33 35°C，空气流量为0.8 8.0L/min,罐压0.001
0.006MPa,溶氧维持在15 40%，发酵pH值控制在7.0 7.4，发酵开始12_24h添加TCA，继续发酵至60-80h结束。C、产物利巴韦林定量分析:
取样离心，取上清液经无菌去离子水稀释适当倍数，采用高效液相色谱(HighPerformance Liquid Chromatography, HPLC)定量检测利巴韦林。工作条件为:Agilent1200型高效液相色谱仪；检测器VWD (可变波长紫外检测器)；检测波长207nm ;进样器标准型自动进样器；进样量5μ L ;色谱柱Kromasil C18，5 μ，250mmX 4.6mm ;流动相水:乙腈=96:4 (V/V);柱温 300C ;流速 lml/min。利巴韦林转化率定义:
产物利巴韦林质量 x1_/
_化率(％)=———.........................................................................Xl00%
雌葡萄_量本发明的优点和积极效果I)采用基因工程手段，突破了鸟苷高产和PNPase高效表达无法在同一株菌上得到实现的瓶颈，使PNPase得以在鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌ΤΑ208中得到高效表达，并且能很好的分泌到培养基中且保持活性，较改造之前的PNPase活力有大幅度提高。2)操作简单，采用传统的发酵工艺、设备使本发明容易实现普及，发酵温度控制在33 35°C，避免为了维持较高的转化温度而消耗额外的能源。3)发酵周期短，产量高，经60-80小时发酵即可在发酵液中检测到较高的利巴韦林含量，目前最高可达27g/L，糖苷转化率35%-44%。
图1是转化子提取质粒酶切验证。
具体实施例方式实施例1构建基因工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP)采用相关分子生物学技术对载体pBE2进行改造后命名为PBSA43，其具有如下特点:①配备有可以被解淀粉芽孢杆菌RNA聚合酶识别的P43启动子，保证目的基因可以在宿主菌内高效表达，并且无需化学诱导剂IPTG或乳糖诱导。②针对解淀粉芽孢杆菌限制-修饰系统的特点，移除了质粒上的BamH I酶切位点，使质粒更容易转化可以将sacB基因序列中编码信号肽的序列融合到目的基因的5’端，使目的基因可以分泌到培养基中。pBSA43质粒的构建:采用PCR技术，分别将P43启动子的序列和sacB基因序列中编码信号肽的序列从枯草芽孢杆菌BS168基因组上克隆扩增，插入到pBE2质粒的多克隆位点，使sacB基因序列中编码信号肽的序列的5’端位于P43启动子的序列的3’端的下游，形成的新质粒命名为PBSA43。P43启动子的PCR扩增所采用的引物参见序列表SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，序列见序列表SEQ ID N0.7 ;SacB信号肽的PCR扩增所采用的引物参见序列表SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4，序列参见序列表SEQ ID N0.8。重组质粒pBSA43_Bs816PNP的构建:采用PCR技术，将编码嘌呤核苷磷酸化酶的基因pupG从枯草芽孢杆菌BS168基因组上克隆扩增，并与PBSA43质粒重组，使pupG序列的5’端位于sacB基因序列中编码信号肽的序列的3’端的下游(此处注意保证阅读框架的完整)，构建了高效表达嘌呤核苷磷酸化酶的重组质粒pBSA43-Bs816PNP。pupG的PCR扩增所采用的引物参见序列表SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6，序列参见序列表SEQ ID N0.9。重组质粒的转化:根据解淀粉芽孢杆菌具限制-修饰系统的特点，在构建质粒的时候尽量避免选用BamH I作为酶切位点，并且尽量保证质粒上不含有BamH I酶切位点。通过电击转化法，将重组质粒pBSA43-Bs816PNP转化鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌TA208，取I 10 μ L浓度为IOOng/ μ L重组质粒溶液加入到100 μ L感受态细胞中冰浴30min后转移至2mm冰浴预冷过的电转杯中，在1800V电压下进行电击转化，电击后立即加入900 μ L LB培养基，35°C振荡培养2h，转速为220r/min，进行复苏培养。复苏培养结束后取200 μ L培养液涂布至含10 μ g/L卡那霉素的LB平板上，35°C倒置培养18h，待长出菌落后挑取单菌落接种于装有5ml LB培养基的摇管中35°C振荡培养12h，转速为220r/min，提质粒进行酶切验证，结果见图1。实施例2工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP)质粒稳定性采用平板稀释计数法。将冻存于_80°C甘油管中的工程菌(实施例1构建)在含10 μ g/L卡那霉素的LB平板上三区划线，37°C培养16h，挑取单菌落接种于5ml液体选择性培养基(LB/Knf)中，摇管培养12h后以I %的接种量转入5ml液体非选择性培养基(LB)，开始连续摇管培养试验。每12h转种一次，接种量为1%，连续传代30次，每隔5次取样进行平板稀释检测质粒的缺失程度。检测时，取菌液Iml用无菌水逐级稀释，取三个合适的梯度，本实验选择10_7、10_8、10_9三个梯度分别涂在固体选择性培养基和非选择性培养基平板上，每个处理三个重复。倒置在37°C培养箱中培养16h，计算各皿中的菌落数。将选择性培养基中的菌落数与非选择性培养基中菌落数进行比较， 即可根据公式计算出质粒的缺失率，见表I。表I工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP)质粒结构稳定性
权利要求
1.一种解淀粉芽孢杆菌添加前体物TCA (1，2，4-三氮唑-3-羧甲酰胺)发酵法生产抗病毒药物利巴韦林的生产工艺，即利用自行构建的兼具高效生产核苷和高效表达嘌呤核苷磷酸化酶这两种特点的基因工程菌RBVM (pBSA43-Bs816PNP)通过发酵过程中添加前体物TCA实现发酵法生产利巴韦林，具体工艺包括: A.利用分子生物学技术以鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌TA208作为宿主菌构建兼具高效表达嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的基因工程菌RBVM (pBSA43_Bs816PNP):即利用PCR技术从枯草芽孢杆菌BS168中扩增低分子量嘌呤核苷磷酸化酶编码基因pupG，与经过改造的表达载体PBSA43连接，构建了具有较高表达效率和很高质粒稳定性的分泌型表达载体pBSA43-Bs816PNP 和工程菌 RBVM (pBSA43_Bs816PNP)； B.工程菌添加前体物发酵:将步骤A中获得的经扩大培养的菌种RBVM(pBSA43-Bs816PNP)接入发酵培养基进行工程菌添加前体物发酵，发酵培养基中碳源含量应为8% 12%，氮碳比N: C应介于10:100 15:100之间，无机盐含量应为0.1% 12%，发酵培养基的初始PH7.2 7.8，培养温度33°C 35°C，振荡培养或发酵罐培养60 80h，接种量为5% 10%V/V，发酵过程中，添加氨水调节发酵液的pH值维持在7.0 7.4，发酵开始 12-24h 添加 TCA。
2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于B步生产利巴韦林发酵采用的培养基:葡萄糖8% 12%，酵母膏0.8% 1.0%,豆浓1.6% 2%，玉米浆1% 2%，(NH3) 2S04 1% 1.5%, MgSO4.7H20 0.1% 0.15%, KH2PO4 0.1% 0.3%, FeSO4 2 4mg/L,自来水 96% 98%，发酵pH值控制在7.0 7.4，发酵开始12_24h添加TCA。
3.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于B步生产利巴韦林发酵采用的控制工艺:发酵温度33 3 5°C，溶氧维持在15 40%，发酵时间为60 80h。
全文摘要
一种解淀粉芽孢杆菌添加前体物TCA(1,2,4-三氮唑-3-羧甲酰胺)发酵法生产抗病毒药物利巴韦林的生产工艺。本发明首先构建了一个能在解淀粉芽孢杆菌细胞内稳定复制并高效分泌表达嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的重组质粒pBSA43-Bs816PNP，并将此质粒转化鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌TA208，得到一株兼具高效生产鸟苷和高效表达嘌呤核苷磷酸化酶这两种特点基因工程菌RBVM(pBSA43-Bs816PNP)。采用该工程菌，以葡萄糖、酵母膏、豆浓、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁和自来水为原料，添加前体物TCA进行发酵，添加前体物几小时后便可在培养基中检测到较高浓度的利巴韦林。本发明具有发酵周期短，产量高，糖苷转化率高，工艺简便，成本低，能耗低，污染小等优点。
文档编号C12R1/125GK103146785SQ20131009783
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月25日 优先权日2013年3月25日
发明者陈宁, 马跃超, 刘莉, 徐庆阳, 谢希贤, 张成林 申请人:天津科技大学