专利名称：：海藻酸钠-壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法
技术领域：
：本发明涉及一种固定腈水合酶菌株的方法。
背景技术：
：腈水合酶(Nitrilehydratase，Nhase)酶学分类号为EC4.2丄84，是一类可以催化腈类物质转化成相应酰胺类物质的酶，工业上的主要应用是催化水合丙烯腈生产丙烯酰胺。目前，腈水合酶的固定化在日本主要采用聚丙烯酰胺凝胶包埋切块法，在我国一般采用海藻酸钠包埋法。海藻酸钠包埋法固定的微生物具有酶活损失少、机械强度较高、制备简单、对生物的毒性较小等优点，但是在含有多价阴离子以及高浓度电解质溶液中不稳定，尤其在磷酸盐体系中，钙离子容易脱落，小球极易溶解，导致反应批次少，不能进行连续生产。
发明内容本发明的目的是为了解决现有方法固定的腈水合酶菌株酶活损失大、反应批次少的问题，提供了一种海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法。本发明海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法如下一、将质量浓度为3.0°/。-4%的海藻酸钠、浓度为50000cfU/ml80000cfti/ml的腈水合酶菌悬液、硅藻土和活性炭混合均匀，然后将混合溶液滴入质量浓度为3.5%-8%的CaCl2溶液中，得到直径为2.5~3.5mm的小球后，在温度为4'C的条件下将小球固化24h，再滤出小球；二、将经过步骤一得到的小球置于醋酸体积分数为2%、壳聚糖质量分数为1.2%-1.8%的壳聚糖醋酸溶液中覆膜20min40min，然后滤出小球，再用蒸馏水洗涤3次，即得海藻酸钠一壳聚糖微囊；其中步骤一中浓度为50000cfU/ml80000cfii/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠的体积比为1:1030，浓度为50000cfU/ml80000cfu/ml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为lml:0.06g~0.1g，浓度为50000cfU/ml80000cfU/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.015g0.025g。本发明得到的海藻酸钠一壳聚糖微囊具有最高的相对酶活，可达91.6%，比采用海藻酸钠包埋法得到的海藻酸钠一壳聚糖微囊的相对酶活提高了23.3%。本发明得到的腈水合酶菌株可实现IO批次反应后，与海藻酸钠包埋法相比本发明具有更好的操作稳定性、连续性，可实现工业化连续生产。图1是具体实施方式一中不同硅藻土用量得到的海藻酸钠一壳聚糖微囊酶活曲线图。图2是具体实施方式一中不同活性炭用量得到的海藻酸钠一壳聚糖微囊酶活曲线图。图3是具体实施方式一中采用不同质量分数的壳聚糖得到的海藻酸钠一壳聚糖微囊酶活曲线图。图4是具体实施方式一中不同的覆膜时间得到的海藻酸钠一壳聚糖微囊酶活曲线图。具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式中海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法如下一、将质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠、浓度为50000cfu/ml80000cfb/ml的腈水合酶菌悬液、硅藻土和活性炭混合均匀，然后将混合溶液滴入质量浓度为3.5%-8%的CaCl2溶液中，得到直径为2.5~3.5mm的小球后，在温度为4'C的条件下将小球固化24h，再滤出小球；二、将经过步骤一得到的小球置于醋酸体积分数为2%、壳聚糖质量分数为1.2%-1.8%的壳聚糖醋酸溶液中覆膜20min40min，然后滤出小球，再用蒸馏水洗涤3次，即得海藻酸钠一壳聚糖微囊；其中步骤一中浓度为50000cfii/ml80000cfli/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠的体积比为1:1030，浓度为50000cfli/ml80000cfij/ml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为lml:0.06g-O.lg，浓度为50000cfo/ml80000Cfli/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.015g~0.025g。本实施方式中配制浓度为50000cfti/ml80000cfii/ml的腈水合酶菌悬液所用的腈水合酶菌为由哈尔滨理工大学微生物实验室分离筛选并保藏的腈水合酶产生菌株及/wfifococc^sp.HUST-3。本实施方式中浓度为50000cfii/ml80000cfo/ml的腈水合酶菌悬液的配制方法如下向1000ml摇瓶中加入100ml液体培养基，接入10ml培养48h的新鲜菌液，在28。C，200r/min条件下，摇瓶培养96h。然后将发酵液在转速为6000r/min、温度为4。C的条件下离心分离20min后，弃去上清液，再用PBS磷酸缓冲液(pH为7.0)洗涤菌体，在同样的条件下重复离心分离、洗涤操作，采用平板菌落计数法，得到浓度为50000cfU/ml80000cfU/ml的均匀悬液，冰箱保存，备用。本实施方式中不同硅藻土用量得到的海藻酸钠一壳聚糖微囊酶活曲线图如图l所示，不同活性炭用量得到的海藻酸钠一壳聚糖微囊酶活曲线图如图2所示，由图1和图2可知，多孔性物质硅藻土和活性炭的加入都能够提高固定化细胞的酶活力，图1中当硅藻土的加入量为0.08g/(mL菌液)时，相对酶活提高到79.3%，这时再加入0.02g活性炭/(mL菌液)，相对酶活可达84.5%,比采用海藻酸钠包埋法得到的海藻酸钠一壳聚糖微囊相对酶活提高了16.2%。图3是采用不同质量分数的壳聚糖得到的海藻酸钠一壳聚糖微囊酶活曲线图，从图3中可以看出，随着壳聚糖质量分数的提高，微囊相对酶活逐渐升高，当质量分数为1.6%时达到最高值89.5%。图4是不同的覆膜时间得到的海藻酸钠一壳聚糖微囊酶活曲线图，由图4可知在覆膜时间为30min时，得到的海藻酸钠一壳聚糖微囊具有最高的相对酶活，可达91.6%，比采用海藻酸钠包埋法得到的海藻酸钠一壳聚糖微囊的相对酶活提高了23.3%。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfWml80000cfii/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠的体积比为1:15~25。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfU/ml80000cfWml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0°/。-4%的海藻酸钠的体积比为1:20。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的CaCb溶液的质量浓度为3.8%-7.5%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的CaCh溶液的质量浓度为4.1%-7%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的CaCl2溶液的质量浓度为4.5%-6.5%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的CaCl2溶液的质量浓度为5.5°/。-6%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式八本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的CaCl2溶液的质量浓度为4%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式九本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的海藻酸钠的质量浓度为3.2%-3.8%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的海藻酸钠的质量浓度为3.5%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十一本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfti/ml80000cfu/ml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为lml:0.07g~0.09g。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十二本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfli/ml80000cfti/ml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为lml:0.08g。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十三本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfo/ml80000cfii/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.018g0.023g。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十四本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfo/ml80000cfU/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.02g。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十五本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfU/ml80000cfo/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.016g0.02化。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十六本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfb/ml80000cfo/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.019g0.022g。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十七本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中腈水合酶菌悬液的浓度为55000cfii/ml70000cfti/ml。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十八本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中腈水合酶菌悬液的浓度为60000cfWml。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十九本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖的质量浓度为1.4-1,7%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式二十本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖的质量浓度为1.6%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式二十一本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二覆膜时间为30min。具体实施方式二十二采用海藻酸钠包埋法固定腈水合酶菌株的方法如下将质量浓度为3.5%的海藻酸钠溶液与浓度为50000cfti/ml80000cfo/ml的腈水合酶菌悬液按20:1体积比混合均匀，然后用医用注射器将所得混合溶液平稳滴入质量浓度为4%的CaCl2溶液中制成直径2.53.5mm的小球，然后在温度为4t:的条件下固化24，即得固定化的腈水合酶菌株。采用本方法所得的固定化的腈水合酶菌株的相对酶活为68.3%，可以进行3批次连续反应。采用海藻酸钠包埋法得到的腈水合酶菌株与采用海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法得到的腈水合酶菌株的反应批次如表1:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1可以看出，采用海藻酸钠包埋法得到的腈水合酶菌株只能进行3批次反应酶活即下降到50%以下，而采用海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法得到的腈水合酶菌株在经过10批次反应后，活力下降50%左右。这表明海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法比海藻酸钠包埋法具有更好的操作稳定性、连续性。权利要求1、一种海藻酸钠-壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于海藻酸钠—壳聚糖微囊固定腈水合酶的方法如下一、将质量浓度为3.0％-4％的海藻酸钠、浓度为50000cfu/ml～80000cfu/ml的腈水合酶菌悬液、硅藻土和活性炭混合均匀，然后将混合溶液滴入质量浓度为3.5％-8％的CaCl2溶液中，得到直径为2.5～3.5mm的小球后，在温度为4℃的条件下将小球固化24h，再滤出小球；二、将经过步骤一得到的小球置于醋酸体积分数为2％、壳聚糖质量分数为1.2％-1.8％的壳聚糖醋酸溶液中覆膜20min～40min，然后滤出小球，再用蒸馏水洗涤3次，即得海藻酸钠—壳聚糖微囊；其中步骤一中浓度为50000cfu/ml～80000cfu/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0％-4％的海藻酸钠的体积比为1∶10～30，浓度为50000cfu/ml～80000cfu/ml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为1ml∶0.06g～0.1g，浓度为50000cfu/ml～80000cfu/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为1ml∶0.015g～0.025g。2、根据权利要求1所述的海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中浓度为50000cfU/ml80000cfii/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠的体积比为1:20。3、根据权利要求1所述的海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中所述的饱和硼酸溶液中CaCl2的质量浓度为4%。4、根据权利要求1所述的海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中所述的海藻酸钠的质量浓度为3.5%。5、根据权利要求1所述的海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中浓度为50000cfWml80000cfb/ml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为lml:0.07g~0.09g。6、根据权利要求1所述的海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中浓度为50000cfWml80000cfo/ml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为imi:o.o8g。7、根据权利要求1所述的海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中浓度为50000cfU/ml80000cfU/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.018g~0.023g。8、根据权利要求1所述的海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中浓度为50000cfii/ml80000cfU/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.02g。9、根据权利要求1所述的海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤二壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖的质量浓度为1.4-1.7%。10、根据权利要求1所述的海藻酸钠一壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤二壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖的质量浓度为1.6%。全文摘要海藻酸钠-壳聚糖微囊固定腈水合酶菌株的方法，它涉及一种固定腈水合酶菌株的方法。本发明解决了现有方法固定的腈水合酶菌株酶活损失大、反应批次少的问题。本发明方法如下将海藻酸钠、腈水合酶菌悬液、硅藻土和活性炭混合均匀后滴入CaCl<sub>2</sub>溶液中，得到小球后在温度为4℃的条件下将小球固化24h，再滤出小球，然后将滤出的小球放入壳聚糖壳聚糖醋酸溶液中覆膜。本发明得到的海藻酸钠-壳聚糖微囊具有最高的相对酶活，可达91.6％，比采用海藻酸钠包埋法得到的海藻酸钠-壳聚糖微囊的相对酶活提高了23.3％。本发明得到的腈水合酶菌株可实现10批次反应，与海藻酸钠包埋法相比本发明具有更好的操作稳定性、连续性，可实现工业化连续生产。文档编号C12N11/00GK101358186SQ20081013714公开日2009年2月4日申请日期2008年9月19日优先权日2008年9月19日发明者孙晓君,蕾张,智秦申请人:哈尔滨理工大学