专利名称：一种新型高效的复杂载体构建的方法
技术领域：
本发明涉及的是基因工程或分子生物学中所用的载体构建的方法。特别是一种高效的复 杂载体构建的方法。适用于克隆的基因组DNA和PCR扩增产物。
背景技术：
载体构建技术是分子生物学和基因工程研究中的常用技术之一，传统的载体构建方法在 构建多片段拼接的复杂的载体时，不但要设计多个酶切位点，如果遇到所要用的酶切位点 DNA片段正好也有，还要做定点诱变去除DNA片段上的这些切点，需要构建多个中间载体， 进行多次连接、转化，不但设计复杂，操作麻烦，费时费力费钱，还成功率低。对于一些连 接准确性要求高的基因片段的拼接更是困难重重。
T4 DNA polymerase不但具有5'-3'聚合酶的活性，在引物、模板的引导下，将dNTP沿 着5，-3，的方向，逐个加到DNA片段上；T4DNApolymerase而且还具有3，-5，外切酶的活性， 可以作用于双链DNA，它能将DNA链上的碱基从3'-5'方向一个个地切下。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、通用的复杂载体构建的新方法，可以用来快速构建复杂 的载体，甚至进行基因内部的无缝连接。
本发明是这样实现的，在PCR引物设计时，在目的片段5'端加上随机设计的的2-6个核 苷酸接头，利用PCR克隆目的片段，在特定的碱基(dATP或dTTP或dCTP或dGTP)保护 下，利用T4DNApolymerase3，-5，方向的外切酶活性，作用于双链DNA，它能将DNA链上 的碱基从3，-5，方向一个个地切下，切到特定的保护碱基为止，这样产生多个首尾相互匹配的 粘性末端，进行多片段定向连接。这种方法既可以用构建各种复杂的载体，也可以进行基因 内部的无缝连接。
本发明的原理是根据碱基互补配对的原则，使各连接片段在T4 DNA polymerase 3'-5'方 向的外切酶活性作用下，产生首位能相互配对的粘性末端，同时避免DNA片段的自连和外 源片段的串连，从而极大的提高了连接效率。
本发明不仅可用于基因工程和分子生物学的各种复杂载体构建，也可以用于基因内部的 无缝连接。
图1是质粒pRSMGA的构建图
图2是质粒pMGA的构建示意图
图3是质粒pRSMGA的构建示意图
图4是PCR扩增aaW， w朋-她，；w6/J-;wr"片段
图5是质粒pMGA转化的结果
图6是PCR鉴定重组质粒pMGA的结果
图7是PCR克隆Mvi A04 、fmF和尸 T"-附a"-她-"ac3L4-戸M 4个片段
图8是质粒pMGA转化的结果
图9是PCR鉴定重组质粒pRSMGA的结果
具体实施例方式
实施例1
. 材料
质粒pAMG和pTRcDNA (均为本实验室构建保存)，Ex Taq PCR Core Kit, T4 DNA polymerase, dCTP， dGTP(以上试剂均购自TaKaRa Biotechnology (Dalian)Co丄td)，大肠杆菌 (XL-gold)用冷冻法自制超级感受态。 方法
实验方案设计
载体pRSMGA中的元件Prrn， man, gfp， aadA， psbA来自载体pAMG，但其排列顺序 不同，需要重排；载体pRSMGA中的元件16srRNA， Amp、 ori, trnF来自载体pTRcDNA, 且其排列顺序也不同，也需要重排。
对于pRSMGA这个复杂载体的构建，我们设计的实验方案是先将载体pAMG改造成 载体pMGA，即将载体pAMG上的元件Prrn, man, g*， aadA， psbA分成man-gfp， aadA， psbA-Prm3片段，利用3片段定向连接将其重排，使它们的排列顺序与载体pRSMGA上的 一致；再将重排的这5个基因作一个片段克隆下来，与载体pTRcDNA上扩增下来的3个片 段16srRNA， Ampr-ori， tmF—起作4片段定向连接(如图l)。
引物设计与合成
根据pAMG载体上aadA基因的序列设计引物，在其5'加上接头TATC和GTAC，即 aadA53F: 5，-TATCggggcagggatggctatatttc-3,， aadA55R: 5，-GTACaagcttacaatatttgccgacta cctt-3'。根据pAMG载体上man和gfp基因的序列设计引物，在其5'加上接头TGAC和ATAC， 艮卩man-gfp64F:5，-TGACccgagggagggatgggggagttg-3， ， man-gfp50R:5，-ATACatttgtagatggagcttcga tgtc-3'。
根据pAMG载体psbA终止子和prrn启动子上的序列设计引物，在其5'加上接头TACG 禾口 TCAG，艮卩psbA-prrn54F: 5，-TACGcgacatcgaagctccatctacaa-3，， psbA-prrn52R: 5'隱TCAGgccata aatccctcccatccaa-35 <
根据载体pTRcDNA上16srRNA的序列设计引物，在其5'加上接头TGAC和ATAC，即 16srRNA53F: 5' -TGACtggctagaggatttgaaaggc-3' ， 16srRNA47R: 5' - ATACtggaaaaataaatagaaaaaga aatc-3，。
根据载体pTRcDNA上Ampf-ori的序列设计引物，在其5'加上接头TATC和TTTC，并 在其两侧引物接头的内侧加上SacII酶切位点，以便在转化前用SacII将载体pRSMGA线性 化，切去Ampr和ori，这样对环境更安全友好，其引物为Ampf-ori54F: 5'-TATCccgcggcagct cactcaaaggcggtaat-3， ， Ampr-ori55R: 5，-TTTCccgcggggggaaatgtgcgcggaa-3，。
根据载体pTRcDNA上trnF的序列设计引物，在其5，加上接头AAAC和GTAC，即tmF48F: 5，—AACggtagatagtaggaacggcacat隱3'， trnF55R: 5'-GTACgcgaagcttacccaggggatgt-3'。引物设计后， 由上海博亚生物技术有限公司合成。
目的片段的PCR克隆体系和条件
PCR反应体系
模板DNA (质粒pAMG、 pTRcDNA和pMGA各稀释200倍)力B 1 " L，引物1 (10uM) 力口5uL，弓1物2 (IOpM)力口5uL， MgCl2 (25mM)力口 5 u JL， dNTP (25mM)力口4uL， 10 X buffer力口 5 p L， Ex隱Taq酵力口 0.2 u L，补力口7K至廿50 ix L。
PCR反应程序
质粒pAMG上的aadA片段扩增程序为:94。C预变性5min。 94°C， 0.5min;54。C， 0.5min;72 °C， lmin;共进行35个循环。最后72'C延伸7min。
质粒pAMG上的man-gfp基因片段扩增程序为:94'C预变性5min。 94°C， 0.5min;57'C， 0.5min;72。C， 2min;共进行35个循环。最后72。C延伸7min。
质粒pAMG上的psbA-prrn片段扩增程序为:94。C预变性5min。 94°C， 0.5min;53。C， 0.5min;72。C， 3.5min;共进行35个循环。最后72。C延伸12min。
质粒pTRcDNA上的16srRNA片段扩增程序为:94'C预变性5min。 94°C， 0.5min;5(TC ， 0.5min;72。C， 2.5min;共进行35个循环。最后72。C延伸10min。
质粒pTRcDNA上的Ampf-ori片段扩增程序为:94。C预变性5min。 94°C， 0.5min;54。C，0.5min;72'C， 1.8min;共进行35个循环。最后72。C延伸10min。
质粒pTRcDNA上的trnF片段扩增程序为:94。C预变性5min。94。C ， 0.5min;52。C ， 0.5min;72 。C， 1.8min;共进行35个循环。最后72。C延伸10min。
质粒pMGA上的Prrn-man-gfjj-aadA-psbA片段扩增程序为:94。C预变性5min。 94°C， 0.5min;53。C， 0.5min;72。C， 3.5min;共进行35个循环。最后72。C延伸12min。
目的片段粘性末端的产生
因为T4 DNA polymerase具有3'-5'方向的外切酶活性，可以作用于双链DNA，它能将 DNA链上的碱基从3'-5'方向一个个地切下；同时该酶又具有5'-3'聚合酶的活性，在dNTP 存在的条件下，表现出聚合酶的活性。因此，我们可以加入一种特定单核苷酸对设定的位置 使T4 DNA polymerase的外切停止，而产生我们设计的粘性末端。将用dGTP保护碱基，利 用T4 DNA polymerase3'-5'方向的外切酶活性，处理aadA片段，使之产生能分别与man-gfp 片段、psbA-prrn片段相匹配的末端W;用dGTP保护碱基，利用T4 DNA polymerase 3'-5' 方向的外切酶活性，处理man-gfp片段，使之产生能分别与aadA片段、psbA-prrn片段相匹 配的末端；用dCTP保护碱基，利用T4 DNApolymerase3，-5，方向的外切酶活性，处理psbA-prrn 片段，使之产生能分别与aadA片段、man-gQ)片段相匹配的末端。(如图2)用dCTP保护碱 基，利用T4DNApolymerase 3，-5，方向的外切酶活性，处理Prrn-man-gfj)-aadA-psbA片段， 使之产生能分别与16srRNA片段、trnF片段相匹配的末端；用dGTP保护碱基，利用T4 DNA polymerase 3，-5，方向的外切酶活性，处理16srRNA片段，使之产生能分别与Prrn-man-gfp -aadA-psbA片段、Ampr-ori片段相匹配的末端；用dGTP保护碱基，利用T4 DNA polymerase 3，-5，方向的外切酶活性，处理Ampr-ori片段，使之产生能分别与16srRNA片段、trnF片段相 匹配的末端；用dGTP作保护碱基，利用T4 DNA polymerase 3'-5'方向的外切酶活性，处理 trnF片段，使之产生能分别与图3质粒pRSMGA的构建图Ampt-ori片段、 Prm-man-gfi)-aadA-psbA片段匹配的末端(如图3)。
目的片段分别磷酸化
DNA片段12.0 u L，10Xbuffer2.0 u L， ATP5 u L， T4 polynucleotide kinase 1.0 y L， 总体积20uL，在37'C温育lh，溶液回收。 目的片段的连接
处理好的片段aadA， man-g^， psbA-prrn各1 u L，弹匀，力n solution I 3 u L混匀，16 。C连接2h后转化；处理好的片段Prrn-man-gfp -aadA-psbA， 16srRNA， Ampf-ori和trnF各1 PL，弹匀，力f] solution 14uL混匀，16。C连接2h后转化。
大肠杆菌的常规转化在1.5mL离心管内加入待转化的DNA 3 u L，大肠杆菌感受态细胞40 u L，轻柔混匀， 冰浴30min。 44°C，热激45sec，迅速冰浴2-3min。加入200 y LNZY液体培养基，于37。C， 250rpm培养lh。取150u L培养物涂布补加了氨卞的LBS平板，37'C倒置培养16h。 LBS(固):l。/oTryptone， 0.5% Yeast extract, l%NaCl， 1%魔芋粉，0.02% Trypan Blue. 121°C 灭菌20min.
结果
质粒pAMG的目的片段的PCR克隆结果
利用质粒pAMG为模板，分别以aadA， man-gfp， psbA-prm的引物，按照1.2.3的条件 对aadA， man-g&, psbA-prrn 3个片段进行PCR克隆，并克隆到了预计大小的3个片段，即 泳道l、 2、 3中的片段大小分别为3.67kb、 1.90 kb、 0.85kb.(如图4)并对它们进行了胶回 收和酶切验证。
aadA， man-gfi5， psbA-prrn 3个片段的处理、连接与转化结果 用T4DNA聚合酶按1.2.4的条件分别对aadA， man-gfp， psbA-prrn 3个片段进行消化，产生 相互匹配的粘性末端；再用磷酸激酶按1.2.5的条件分别对aadA， man-gfp， psbA-prrn 3个片 段进行磷酸化；将磷酸化处理好的aadA， man-gfp， psbA-prrn片段按1.2.5的条件进行连接； 再将连接物常规转化大肠杆菌(XL-Gold),取150yL培养物涂布补加了氨苄青霉素(Amp) 和壮观霉素(Spc)的LBS(固)平板，37'C倒置培养16h后，平板上出现60多个带水解圈的 菌落(如图5)。
3个片段重组质粒pMGA的验证
根据补加了氨苄和壮观霉素的LBS(固)培养皿转化结果判断，转化质粒上含有Ampr、 aadA、 man基因，因为这些大肠杆菌能抗氨苄青霉素、壮观霉素，也能水解魔芋平板，产生 明显的水解圈。这分别和3个目的片段aadA， man-gfp， psbA-prrn上含有的基因一致。为了 进一步验证转化的质粒是pMGA，而不是质粒pAMG，理论上，以man-gfj)片段正向引物
(man-gfp64 F:5，-TGACccgagggagggatgggggagttg-3，)禾Q aadA片段反向引物(aadA55R: 5，-GTACaagcttacattatttgccgactacctt-3，)做菌落PCR，如果质粒是pMGA，则PCR产物大小应 为2.75kb，如果质粒是pAMG，则PCR产物大小应为60bp。我们随机挑取了 10个带水解 圈的菌落，做菌落PCR,结果扩出2.75kb带(如图6)，证明转化的是目的质粒pMGA。这 也证明这种方法连接转化效率高。
4个目的片段的PCR克隆
利用质粒pTRcDNA为模板，分别以16srRNA 、 AmpLori、 trnF的引物，按照的条件16srRNA 、 Ampr-ori、 trnF 3个片段进行PCR克隆，并克隆到了预计大小的3个片段，即泳 道l、 2、 3中的片段大小分别为2.185kb、 1.80kb、 1.739kb的带(如图7)，并对它们进行了 胶回收和酶切验证。利用质粒pMGA为模板，以psbA-prrn的引物，按照条件对 Prrn-man-gfp-aadA-psbA片段进行PCR克隆，并克隆到了预计大小的片段，即泳道4中的片 段大小为3.578kb，并对它们进行了胶回收和酶切验证。 4个片段的处理、连接与转化结果
用T4DNA聚合酶按1.2.4的条件分别对Prrn-man-gfp-aadA-psbA、 16srRNA 、 Ampr-ori、 trnF 4个片段进行消化，产生的相互匹配的粘性末端；再用磷酸激酶按条件分别对上述4个 片段进行磷酸化；将磷酸化处理好的片段按条件进行连接；再将连接物常规转化大肠杆菌 (XL-Gold),取150U L培养物涂布补加了 Amp和Spc的LBS (固)平板，37。C倒置培养16h 后，平板上出现多个带水解圈的菌落(如图8)。 重组质粒pRSMGA的连接物的验证
根据补加了 Amp和Spc的LBS(固)平板转化结果判断，转化质粒上含有Ampf、aadA、 man 基因，因为这些大肠杆菌能抗氨苄青霉素、壮观霉素，也能水解魔芋平板，产生明显的水解 圈，菌体还发绿光。这分别和Prrn-man-g*-aadA-psbA、 Ampf-ori、两个目的片段上含有的4 个基因一致。为了进一步验证转化的质粒是pRSMGA，而不是其它质粒，用Prrn-man -gfp-aadA-psbA、 16srRNA 、 Amp'-ori、 tmF4个片段的引物做菌落PCR，均得到与以上4个 片段大小一致的带(如图9)，酶切验证也正确。
权利要求
1、一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法，在PCR引物设计时，在目的片段5’端加上随机设计的接头，利用PCR克隆目的片段，再用T4DNA聚合酶3′→5′外切酶活性处理PCR克隆目的片段，产生多个首尾相匹配的粘性末端，进行多片段定向连接。
2、 根据权利要求1所述的载体构建的方法，在目的片段5'端加上随机设计的2-6个核苷酸接 头，在特定的碱基(dATP或dTTP或dCTP或dGTP)保护下，利用T4 DNApolymerase 3，-5， 方向的外切酶活性，作用于双链DNA,它能将DNA链上的碱基从3'-5'方向一个个地切 下，切到特定的保护碱基为止。这样产生多个首尾相互匹配的粘性末端，进行多片段定向 连接。
3、 根据权利要求1或要求2所述的DNA片段处理方法，其特征在于该方法可以用构建各种 复杂的载体。
全文摘要
本发明提出一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法。在PCR引物设计时，在目的片段5’端加上随机设计的接头，利用PCR克隆目的片段，再用T4DNA聚合酶3′→5′外切酶活性处理PCR克隆目的片段，产生多个首尾相匹配的粘性末端，进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。应用上述方法构建复杂载体，其重组、连接、转化效率高，适用于构建各种复杂的载体。
文档编号C12N15/66GK101445807SQ20081013659
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月24日 优先权日2008年12月24日
发明者陆云华 申请人:宜春学院