肿瘤转移抑制基因htpap的单体型及其构建方法和应用的制作方法

专利名称：：肿瘤转移抑制基因htpap的单体型及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属基因工程领域，具体涉及一抑癌基因HTPAP的单体型及其构建方法和应用。
背景技术：
：现有技术公开了染色体8p缺失与肝细胞癌(h印atocellularcarcinoma,以下简称HCC)复发转移相关，并在此基础上克隆出一全长基因HTPAP。该基因是一候选肝癌转移抑制基因，其正式名为PPAPDCIB(Phosphatidicacidpho印hatasetype2domaincontainingIB),即含有IB功能域的2型磷脂酸磷酸酯酶。该基因定位于8p12，含有7个外显子，6个内含子。基因全长4459bp，cDNA长为826bp，编码一个具有175个氨基酸的蛋白质。该基因同源序列在动物(如黑猩猩、狗、小家鼠等)和植物(如水稻)、从低等生物到高等生物中广泛存在，说明该基因可能有重要作用以至于在长期进化过程中未被淘汰。已有研究发现一些人类肿瘤中该基因的异常转录表达，提示该基因具有抑制肿瘤细胞增殖，降低侵袭性，抑制肿瘤转移的发生发展的作用。现有技术还公开了经体内、体外研究初步证实该基因可抑制HCC的侵袭和转移，提示HTPAP基因是一新的HCC转移抑制基因.该基因是新近发现的肿瘤相关基因，其功能研究报道目前尚不多。单核苷酸多态性(SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性，是人类基因组中最常见的遗传变异，为第三代分子遗传标记。因为单个SNP本身的功能有限、利用单个位点SNP分析评价HTPAP基因作用是不够全面的，它提供的信息量也较少。已有研究发现，由于SNP之间存在连锁不平衡，位于同一条染色体上相邻的SNP等位基因往往倾向于同时出现，并以一个整体遗传给后代。而这些位于一条染色体特定区域的一组相互关联并倾向于以整体遗传给后代的SNP的组合即为单体型。它决定了基因的功能单位和人群遗传变异的内在特征。单体型的存在可以极大地减少疾病关联研究的工作量，在肿瘤侯选基因研究具有重要的作用。
发明内容本发明的目的是提供肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型。本发明的进一步目的是提供上述单体型的用途。本发明的更进一步目的是提供含上述单体型的诊断、预后预测HCC复发的试制盒。本发明可用于探讨不同的单体型与HCC的复发转移的关系，能为肝癌转移复发、预后预测提供新的途径和分子指标。本发明的目的通过下述技术方案实现，采用焦磷酸测序方法(Pyrosequencing96，PSQ96)对dbSNP多态性数据库中(美国国立生物技术信息中心NatinoalCenterofBiotechnologyInformation,NCBI)HTPAP基因的15个SNP位点(rsl149、rs3739252、rs7845496、rs4599776、rsl0087284、rs7007097、rsl0099288、rsl0102847、rsl5103、rs8349、rs3215009、rs3830326、rs28431298、rsl1539529、rsl3256516)进行检测；分析每个位点序列特点，设计并合成特定的PCR引物及测序引物，PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记。然后将PCR产物与偶联Avidin的S印harose微珠一起孵育经碱变性分开DNA双链后纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物特异性退火结合，PSQ仪器即可测序反应并给出SNP测定结果。上述结果均经采用ABI-3730测序仪直接测序相结合的方法进行验证。根据上述15个SNP的检测结果，选择有信息并最少等位基因频数(minorallelefrequency,MAF)大于或等于10%的SNP进行单体型构建分析。采用Haploviewversion3.32和PHASE2.1分析软件(http:〃丽w.broad,mit.edu/mpg/haploview/PHASE2.1)，分析单体型结构及其频数和连锁不平衡。本发明通过对864例HCC病人的肿瘤抑制基因HTPAP的目前所有的SNP位点检测，对该基因进行单体型构建。本发明构建的HTPAP基因单体型包括如下11种，按SNP在染色体上的位置顺序依次为rs7007097(C/T)(+3528)、rsll539529(A/G)(+1838)、rs3830326(-/TAAG)(+1648)、rsll49(C/G)(+357)、rs3739252(A/G)(-1053);上述的位置顺序中的rs7007097-rsll539529_rs3830326-rsl149-rs3739252顺序以1-2-3-4-5表示，其中rs3830326的插入TAAG基因型以G示，T示无插入，所述11种单体型分别为C-A-T-C-A、T-G-G-G-G、C-G-T-C-A、T-A-G-G-G、C-A-G-C-A、T-A-G-G-A、C-A-T-G-A、T-A-T-C-A、T-A-G-C-G、C-A-T-G-G和T_G-T-C-G。其中以C-A-T-C-A、T-G-G-G-G、C-G-T-C-A和T-A-G-G-G常见占近95X。表1是11种单体型及其具体频数。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>其中l-2-3-4陽5顺序代表rs7007097、rsl1539529、rs3830326、rsl149、rs3739252;其中rs3830326的插入TAAG基因型以G示，T示无插入。本发明的基因单体型通过下述方法和步骤构建1、选择病人对2005年4月至2006年10月间在复旦大学肝癌研究所进行肝切除手术的864例HCC病人进行研究，病人选择标准为手术切除；无肝外或远处转移；术前未行介入、放疗、无水酒精注射(PEIT)等，其中男性769例，女性95例，平均年龄50.3岁(2985岁)。表2是864例HCC临床病理特征。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>血清AFP>20ng/L570(66%)<20ng/L294(34%)肿瘤直径55cm527(61%)>5cm337(39%)肿瘤分化I级78(9%)II级467(54%)in或iv级319(37%)肿瘤数目单个557(64.5%)308(35.5%)脉管癌栓有423(49%)无441(51%)2、SNP检测采用焦磷酸测序方法(Pyrosequencing96,PSQ96)，对目前美国国立生物技术信息中心(NatinoalCenterofBiotechnologyInformation,NCBI)上已经登录的dbSNP多态性数据库中HTPAP基因的所有15个SNP位点(rsl149、rs3739252、rs7845496、rs4599776、rsl0087284、rs7007097、rsl0099288、rsl0102847、rsl5103、rs8349、rs3215009、rs3830326、rs28431298、rsl1539529、rsl3256516)进行检测。SNP检测结果显示在所述的HCC人群中，15个SNP跨越基因全长4.5kb。15个SNP有rs4599776(A/C)和rsl3256516(C/T)2个由于基因型信号模糊未能检测出;rs7845496(A/C)、rsl0087284(A/C)、rsl0099288(A/G)、rsl0102847(C/G)、rsl5103(A/G)、rs8349(C/T)、rs3215009(-/T)、rs28431298(C/T)等8个表现为单态性；另有5个SNP呈多态性，分别为rs7007097(C/T)、rsl1539529(A/G)、rs3830326(-/TAAG)、rsll49(C/G)和rs3739252(A/G)，其较少等位基因频数分别为29.5%(T)、31.5%(G)、29.8%(TAAG)、29.2%(G)、27.8%(G);5个SNP的平均间距为916bp，其等位基因频率符合Hardy-Weinberg平衡。5个呈多态性的SNP中，rsl1539529(A/G)位于外显子-5，可伴有HTPAP(编码含175氨基酸的蛋白)的第83位氨基酸的改变(脯氣酸P——丝氨酸S);另4个SNP:rs7007097、rs3830326、rsl149、rs3739252位于内含子及非翻译区之中。表3是15个SNP位点引物和测序引物序列，其中*示该位点为反向测序，加粗标示该引物为biotin标记。表4是13个SNP基因检测结果及特征。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5009AGGCAGATGTTTACCAACAGTGACAACGCATCTGC*CTCAAGCTCAGCCCrsl00CCGTGCTGTTCTGTGCCTAATTTTGTAGCTTTRTACTAGGCCA99288TCTGAGATGGATGCACTGGCGAGAACTAAGACATTTCTGAATAGTTATGGrsl01CCTACAAAGTGTGCGTGGAGGGCACCTTTCSACCCCGAGA02847GCCGTCTCGGAAAGATCGGTGCGTTCGGCCTTTGTAGGGACrsl14CCTACGTGGTACAAAGGCCGGTGCCCGC/GGGTCATGGGGA9*AGGCGGAGTGTCTCGGGCGGGAAGCGGGAGGAAATCAGACGArs459AGCAGCTCCGTTCGCGGCCTTCCTCCCCCCMCTGCCCGAC9776GTCACCCTAGCTTCCTGTACGCTTCCCGCCGCCCCGTGACCGrs373TCTAGCCAACCGTTTTCATTACTTTGTAGCA/GTTACTTTGCC9252GTCACAGAATTCTCGTGTTCATCCTGTGTAAATCACTTGAGACTCATAACArs834CTCAAGCAATGCATAGTGTTTACTGAGAC/TTTTATTTTACAA9AATCTGAAAGAAACGTGTATGTTGCCTTATACTTTGGAATTTCAGTGAAGCrsl32TCTGGCAAACGC隱G-T隱C-ATGCCAGCGGYTCTGGTGCGTTC56516GGGTACGCAGATGATGGAC-G-T-C-ACAGCAGGGAGCCAG表4Contig.postiondbSNPS#Spacing(bp)RarealleleRareallclsfrequencyFunction8,443,57770770970T0.295Intron68,443,6542843129877T0Intron68,445,080151031426G0Intron58,445,2287845496140C0Coding，noiisyn.(K96Y)8,445,2671153952939G0.315Coding，nonsyn,(P83S)8,445,4593830326192TAAG0.298Intron48,445,61810087284159C0Intron48,445,7873215009169T0Intron48,446,03810099288251G0Intron38,446,71910102847681G0Intron28,446,748114929G0.292Intron28,446,812834964T0Untranslated8，448，15737392521345G0.278Untranslated3、构建单体型采用Haploviewversion3.32分析软件(http://www.broad,mit.edu/mpg/ha口loview)进行单体型结构，频数及连锁不平衡分析。根据15个SNP的检测结果，选择有信息并最少等位基因频数(minorallelefrequency,MAF)大于或等于10%的SNP进行单体型分析。一组SNP的单尾95%置信区间(ConfidenceInterval,CI)的D'值上限大于0.95，下限大于0.7即定为该组SNP之间存在强的连锁不平衡关系；相反，SNP的单尾95%置信区间的D'值上限小于0.9即认为该SNP之间存在历史上的重组；一染色体区域中SNP存在历史上的重组的比例小于5%即认为该区域SNP处于同一单体型块中。Haploview软件单体型构建结果在所述的864例HCC人群中，跨越HTPAP基因全长的上述5个SNP的最少等位基因频数均大于10%，较适用于单体型构建；4个SNP(rs7007097、rs3830326、rsl149、rs3739252)表现为强连锁不平衡(linkagedisequilibrium,LD)关系，处于同一单体型块中；而rsl1539529出现重组现象，但是从整体看，他们还是在一个单体型块中。在所述的单体型块中，5个SNP的平均间距为916bp，且5个之间实际间距较均匀。本发明根据侯选基因的单体型一般应小于lSNP/5kb且实际间距趋于均匀，方适于单体型分析(Gabriel等的建议)，本发明所构建的HTPAP的单体型能代表该基因的功能单位，并可以应用于HTPAP基因的功能研究(图1)。表5是5个SNP之间LD分析。表5rs7007097rsl1539529rs3830326rsl149rs3739252rs7007097-111'rsl15395290.637(0.58-0.69)-rs38303260.952(0.93-0.97)0.621(0.57-0.67)-1'rsl1490.938(0.91-0.96)0.632(0.58-0.68)0.937(0.91-0.96)-+64g/c0.988(0.97-1)0.688(0.63-0.74)0.973(0.95-0.99)0.955(0.93-0.98)rs37392520.988(0.97-1)0.688(0.63-0.74)0.973(0.95-0.99)0.955(0.93-0.98)-4、不同单体型与HCC病人侵袭转移潜能分析研究在上述基础上，SNP基因型，单体型与与肝癌侵袭性(子灶和癌栓)的关系结合临床病理特征统计864例HCC的子灶及癌栓情况，有子灶和(或)癌栓等肝内转移征象的为有高侵袭性组，两者皆无则为低侵袭性组。临床病理特征分析提示SNP+357C/G的基因型GG+GC与HCC高侵袭转移潜能正相关[GC:OR=1.77，95°/。dI.=1.32-2.36，P=0.0001;GG:OR=2.11(1.28-3.48)，尸=0.003]，呈等位基因G剂量依存性，呈等位基因G剂量依存性。而+1838A/G虽然处于外显子之中,但是与HCC侵袭转移潜能并无相关[GA:OR=1.09(0.81-1.46),/M).564;GG:OR=1.39(0.91-2.12),P=0.126]。单体型T-G-G-G-G与高侵袭潜能正相关，而C-A-T-C-A，C-G-T-C-A和T-A-G-G-G则与HCC侵袭性潜能未见统计相关。表6是+357G/C和+1838^0的Genotype与肝癌侵袭转移潜能的关系。表7是HTPAP的四种主要单体型与肝癌侵袭转移潜能的关系。表6SNPgenotypeHMgroup(n=453)No.(%;>aLMgroup(n=411)No.(%)ORb(95%d.)P+357G/CCC192(42.4)239(58.2)ReferenceGC208(45.9)143(34.8)1.77(1.32-2.36)O扁lGG53(11.7)29(7.1)2.11(1.28-3.48)0.003PtrendC0.0009CC199(43.9)239(58.2)ReferenceGC+GG261(57.6)172(41.8)1.82(1.38-2.40)0扁2+1838A/GAA198(43.7)198(48.2)ReferenceGA185(40.8)165(40.1)1.09(0.81-1.46)0.564GGPtrendAAGG+GA70(15.5)198(43.7)255(56.3)48(11.7)198(48.2)213(51.8)1.39(0.9卜2.12)0.1260.28Reference1.16(0.88-1.52)0.291其中，a:HMorLM分别为肝癌高低侵袭转移潜能，b:多因素非条件Logistics分析，c:趋势分析。表7HTPAPHaplotyp6'HMgroup(n=834)LMgroup(n=801)ORL(95。/oc丄)PNo.(%)No.(%)C-A-T-C-A472(56.6)506(63.2)ReferenceC-G-T陽C-A86(10.3)100(12.5)0.95(0.69-1.31)0.759T-A-G-G-G41(4.9)35(4.4)1.22(0.76-1.96)0.405T-G-G-G-G235(28.2)160(20.0)1.50(1.18-1.91)0.001Ptrend0.007其中，a:PHASE2.1单体型频数分析，b:HMorLM分别为肝癌高低侵袭转移潜能，c:多因素非条件Logistics分析，d:趋势分析。5、HTPAP基因的SNP基因型和单体型影响肝癌侵袭转移潜能的相关机制实验研究1)对HCC中不同HTPAP单体型与基因表达关系研究，结果显示含有T-G-G-G-G单体型的HCC中HTPAP的表达较只有C-A-T-C-A和C-G-T-C-A单体型的HCC明显降低，提示HCC中不同HTPAP单体型能影响HTPAP表达水平(P=0.061)，见图32)利用表达谱基因芯片研究HTPAP单体型调控HCC侵袭转移潜能的调控机制进行分析，结果显示了41个差异表达基因谱。对T-G-G-G-G和C-A-T-C-A纯合子HCC各16例行SAM分析，结果显示41个差异表达基因(包括2个转录本)，其中以IL-8在T-G-G-G-G上调表达8倍；聚类分析显示该41个差异表达基因(转录本)可以将两组很好地区分开(图5)。表8是41个差异显著差异表达基因(转录本)列表。表8Probe—Set—IDGene—SymbolChromosomal—LocusFold—Changeq_value1558217_atSLFN13chrl7ql20.255293096.308757617WSB1〃/201295-一s一atLOC401876chrl7ql1.10.4731085910201761—一atMTHFD2chr2pl3.10.3918661927.097352319201858-一s一atPRGlc固q22.10.3080582588.767317571202260—一s—atSTXBP1chr9q34.10.4570376477.097352319202388——atRGS2chrlq310.26729210202637—一s一atICAM1chrl9pl3.3-p13.20.4552907966.308757617202859_一x—atIL8chr4ql3陽q210.1328065730203028_—s_atCYBAchrl6q240.3844428438.767317571204319_—s_atRGS10c固q250.486892047.097352319204328——atTMC6chrl7q25.30.4533129524.731568213204446画—s—atAL0X5chrl0ql1.20.2923761087.097352319204470画—atCXCUchr4q210.3796372257.097352319204897—-atPTGER4chr5pl3.10.2960988587.097352319204924_—atTLR2chr4q320.3194546950208893—一s一atDUSP6chrl2q22-q230.427281147.742566167209457_—atDUSP5c固q250.3276208424.731568213209732_—atCLEC2Bchrl2pl3-p120.3130432060211675_—s_atMDFICchr7q31.1-q31.20.469882188.767317571212311—atKIAA0746chr4pl5.20.4507730677.097352319212314—atKIAA0746chr4pl5.20.4145683774.731568213213620_—s—atICAM2chrl7q23-q250.4505282927.097352319215034__s—atTM4SF1chr3q21-q250.4261789397.742566167215078—_atS0D2chr6q25.30.363749874.731568213217867—_x_atBACE2chr21q22.30.3406260157.097352319218313—_s—atGALNT7chr4q31.10.3007759957.097352319221059——s—atCOTUchrl6q24.10.3781484647.097352319222108——atAMIG02chrl2ql3.110.2443111340222731—_atZDHHC2chr8p21.3-p220.3286704840223501——at——0.3660441137.097352319223502—一s一atTNFSF13Bchrl3q32-340.3588320487.097352319225622——atPAG1chr8q21.130.3843571690<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>其中Fold-Change为基因表达水平比值K:-A-T-C-A纯合子/T-G-G-G-G纯合子。同时应用该41个差异表达基因(转录本)对后续20例HCC聚类分析，结果显示，可以将T-G-G-G-G纯合子、C-A-T-C-A纯合子、T-G-G-G-G/C-A-T-C-A杂合子、C-A-T-C-A/C-G-T-C-A杂合子、T-A-G-G-G/C-A-T-C-A杂合子等五组HCC很好地区分为两大组即T-G-G-G-G纯合子+T-G-G-G-G/C-A-T-C-A杂合子+T-A-G-G-G/C-A-T-C-A杂合子和C-A-T-C-A纯合子+C-A-T-C-A/C-G-T-C-A杂合子。同时对总52例HCC聚类分析显示相似结果。52例中临床表型分析发现前组的28例中有19例具有高侵袭转移潜能，而后组24例中有8例具有高侵袭转移潜能(P=0.025)。Real-timePCR和RT-PCR均验证了上述差异表达。提示不同HTPAP单体型的HCC具有不同的基因表达谱，这些在不同HTPAP单体型HCC中具有显著差异表达的基因可能于HTPAP基因有关，并影响肝癌的不同临床表型，改变其侵袭转移潜能，提示HCC中HTPAP的不同单体型可能是潜在侵袭转移相关的预测指标。6、不同SNP基因型和单体型HTPAP蛋白在肝癌中的表达及其与术后无瘤生存(术后复发)的关系应用免疫组织化学染色方法，检测不同单体型的HCC中HTPAP蛋白的表达，探讨两者间的关系；同时检测665例HCC的5个SNPs位点，探讨SNPs基因型、单体型与术后DFS(术后复发)的关系。结果显示，HTPAP蛋白的表达在377例HCC中有177例阳性染色(++++)，占46.9%。染色特点与肝癌侵袭转移潜能(有无肝内播散灶和脉管癌栓)分析发现，377例中193例具有高侵袭转移潜能的HCC中有80例HTPAP染色为阳性(41.5%)，而184例低高侵袭转移潜能的HCC中有97例为HTPAP染色阳性(52.7%)(尸=0.028),提示HCC的侵袭转移潜能与HTPAP蛋白表达负相关(图6)。TagSNP+357C/G基因型与HTPAP染色发现GG+GC基因型的HCC较CC型的HTPAP蛋白表达低(尸=0.002);而TagSNP+1838A/G分析发现GG+GA基因型的HCC较AA型的HTPAP蛋白表达无统计差异低(/M).130)。单体型分析发现T-G-G-G-G+T-A-G-G-G单体型HCC较其它单体型的HTPAP表达亦显著降低(P=0.001)，免疫组化染色分析提示不同的单体型能影响HTPAP蛋白的表达水平。表9是TagSNP和不同单体型HCC的HTPAP蛋白免疫组化染色情况。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>a.IHC，免疫组织化学染色Kaplan-Meier生存曲线分析提示:TagSNP+357GC的Genotype为GG,GC，CC的HCC之间的术后无瘤生存时间具有统计差异，Genotype为CC的HCC术后无瘤生存较为GG和GC明显好(PO.001);而TagSNP+1838A/G的Genotype为GG,GA,AA的HCC之间的术后无瘤生存时间无统计差异(尸=0.282)。单体型与预后分析发现T-G-G-G-G纯合子较T-G-G-G-G杂合子和其它单体型术后无瘤生存差(PO.001)，提示具有较高的术后复发风险。Cox风险比例模型多因素分析发现TagSNP+357GG+GC基因型和T-G-G-G-G纯合子或杂合子单体型是术后无瘤生存(术后复发)差的独立相关因子(分别为GG:P=0.021,HR(HazardRatios)=1.51,95%C1=1.07-2.15，GC:P=0.030，HR=1.29，95%CI=1.03-1.62;T-G-G-G-G纯合子P=0.009,HR=1.59，95%CI.=1.12-2.27，T陽G-G-G-G杂合子尸=0.022，HR=1.32，95%CU.=1.04-1.67)。表10是Cox比例风险模型(多因素)分析HTPAP基因型和单体型与术后无瘤生存(术后复发)关系。表10AdjustedHR(95%CI)CoxmodelsVariables*PFor+357C/GgenotypeSex(male)1.13(0.83-1.54)0.435Age(^55years)0.94(0.75-1.19)0.628HBsAg(present)0.75(0.54-1.05)0.094Livercirrhosis(present)1.03(0.82-1.29)0.501AFP(，ng/ml)1.28(1.00-1.23)0.047TNMstageII1.07(0.87-1.33)0.516TNMstageIII1.49(0.91-2.75)0.113Portallymphnodemetastasis(present)1.31(0.78-2.21)0.309Capsule(absent)1.23(0.99-1.53)0.058DifferiationI-II/II0.45(0.31-0.66)<0週DifferiationII-III/III0.66(0.45-0.95)0.026DifferiationIII-IV/IV1.19(0.76-1.87)0.440Diamter(25cm)1.13(0.90-1.42)0.282Numbe论2)1.50(1.17-1.93)0.001Thrombus(present)2.14(1.70-2.69)<0週+357GC1.29(1.03-1.62)0.030+357GG1.51(1.07-2.15)0.021ForT-G-G-G-GhaplotypeSex(male)1.13(0.83-1.54)0.435Age(255years)0.93(0.74-1.17)0.543HBsAg(present)0.76(0.55-1.06)0.103Livercirohsis(present)0.91(0.71-1.17)0.469AFP(，ng/ml)1.27(1.00-1.62)0.053TNMstageII1.08(0.87-1.34)0.506TNMstageIII1.55(0.94-2.54)0.087Portallymphnodemetastasis(present)1.27(0.76-2.15)0.363Capsule(absent)1.24(1.00-1.53)0.054DifferiationI-II/II0.44(0.31-0.64)O.001DifferiationII-III/III0.66(0.45-0.95)0.026DifferiationIII-IV/IV1.22(0.78-1.62)0.384Diamte论5cm)1.14(0.91-1.43)0.260Number(^2)1.48(1.16-1.90)0.002Thrombus(present)2.13(1.70-2.68)<0.001T陽G-G-G-Gheter.1.32(1.04-1.67)0.022T隱G-G-G-Ghomo.1.59(1.23-2.26)0.009其中，*,HR危险度实验研究结果表明，肿瘤转移抑制基因HTPAP上的SNPs会改变肿瘤的侵袭转移潜能(1)Tag+357GG+GC基因型和T-G-G-G-G和T-A-G-G-G单体型的HTPAP蛋白表达较+357CC和C-A-T-C-A等其它单体型显著降低；(2)TagSNP+357GG+GC基因型和T-G-G-G-G纯合子或杂合子单体型是HCC术后无瘤生存差相关的独立因素，为HCC术后高复发风险的独立相关因子。本发明通过对HCC病人的肿瘤抑制基因HTPAP的SNP检测，构建了中国HCC人群中HTPAP基因的单体型，验证了HTPAP基因的单体型与HCC的复发转移的关联性，并结合临床进行机制研究和预后分析，为肝癌转移复发、预后预测提供了新的途径和分子指标。本发明的突出优点为(1)通过对HCC病人的SNP检测，可以指导病人的术后转移复发，简单、方便、实用。(2)对HCC病人预后进行评估，并及时采取综合手段干预，提高病人远期生存率，改善预后。(3)可与其他分子指标相结合，为HCC复发诊断、预后预测提供新的试制盒，方便于临床应用。图1是示纯肿瘤细胞的显微切割A:切割前肿瘤组织内混有间质成分(箭头所示)，三角形所示为纯肿瘤细胞，B:显微切割后，H-E染色，100X。图2是5个SNP之间LD分析。图3是四种主要单体型HCC的HTPAP绝对定量和RT-PCR半定量表达分析，四种主要单体型HCC的HTPAP绝对定量和RT-PCR半定量表达分析，其中，a，gro叩A-E分别示T-G-G-G-G纯合子，C-A-T-C-A/T-G-G-G-G杂合子、C-A-T-C-A/T-A-G-G-G杂合子、C-A-T-C-A/C-G-T-C-A杂合子和C-A-T-C-A纯合子HCC的HTPAP的表达P>0.05;b，RT-PCR检测不同单体型的HTPAPmRNA的表达，Lanel-5依次为T-G-G_G-G纯合子，C-A-T-C-A/T-G-G-G-G杂合子、C-A-T-C-A/T-A-G_G-G杂合子、C-A-T-C-A/C-G-T-C-A杂合子和C-A-T-C-A纯合子HCC的HTPAP表达。图4是41个差异表达基因对不同HTPAP单体型2组HCC的聚类分析，其中，A:T-G-G-G-G纯合型，B:C-A-T-C-A纯合型。图5是HTPAP免疫组化染色特点，其中，B:HTPAP阳性染色可见广泛表达于癌巢中，呈颗粒状强阳性表达于胞浆内，A为对应HE染色；D:癌结节中呈片状,条带状染色，C为对应HE染色；E:部分标本阳性表达于增生的胆管上皮细胞；F:正常及肝硬化组织未见明显表达；均为20X。具体实施方式实施例11、激光捕获显微切割(LaserC即tureMicrodissection,LCM)行纯肿瘤细胞的切割和DNA的抽提取新鲜肿瘤标本，O.C.T包埋后，行8um连续冰冻切片，贴于专用于LCM的敷膜片上，各10张。快速苏木素-伊红(HE)染色后，打开Veritas激光捕获显微切割系统(美国Arcturus公司)，切取纯净肿瘤细胞于C即Sure帽中(注意不要切取混杂的间质成分)。利用QIAampDNAMicroKit(德国Qiagen公司)方案提取纯肿瘤细胞DNA，提取DNA经紫外分光光度计计量后-2CTC保存备SNP检测用。所有病例行LCM均获成功，切取并得到足够的纯净肿瘤细胞DNA(图l)。2、SNP检测采用焦磷酸测序方法，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段，具体步骤如下第1步1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Uiciferin)。第2步向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3'末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。第3步在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。第4步反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。第5步加入另一种dNTP，使第2—4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。3、Haploview和PHASE2.1软件单体型构建分析打开Haploviewversion3.32和PHASE2.1分析软件。将编辑好864例HCC的5个SNP的信息导入，根据软件提示，系统即给出每个HCC的单体型结果，每个HCC有两种单体型，两种单体型一样者为纯合子，否则为杂合子。4、HCC病人的SNP基因型，单体型与临床肝癌侵袭转移潜能分析对有癌栓(包括肉眼和镜下)或子灶进行统计，将有癌栓(包括肉眼和镜下)或子灶判为肝癌高侵袭转移潜能，无癌栓(包括肉眼和镜下)和子灶判为低侵袭转移潜能，Logistics回归分析探讨HCC病人的SNP基因型，单体型与临床肝癌侵袭转移潜能关系，P〈0.05为有统计意义。5、HTPAP基因的SNP基因型和单体型影响肝癌侵袭转移潜能的相关机制研究1)HCC中HTPAP单体型与基因表达关系检测HCC中HTPAP基因的表达，探讨HTPAP基因的TagSNP+357C/G基因型和相关的单体型对与基因表达的的影响。(1)构建pEGFP-HTPAP载体真核表达质粒，应用绝对定量PCR(quantitativereal-timePCR)检测HCC中HTPAPRNA的表达(含3种同素异构体);(2)随机选取170例以C-A-T-C-A，T-G-G-G-G，C_G-T-C-A和T-A-G-G-G等四种HTPAP基因主要单体型组成的HCC组织，并提取总RNA。结果显示成功构建pEGFP-HTPAP载体真核表达质粒；对4种单体型组成的170例HCC进行HTPAP基因表达水平的定量分析，其中T-G-G-G-G纯合子21例、C-A-T-C-A纯合子65例、C-A-T-C-A/T-G-G-G-G杂合子52例、C-A-T-C-A/T-A-G-G-G杂合子13例、C-A-T-C-A/C-G-T-C-A杂合子19例；其中HCC中HTPAP基因表达在C-A-T-C-A纯合子和C-A-T-C-A/C-G-T-C-A杂合子病人较T-G-G-G-G纯合子、C_A-T-C-A/T-G-G-G-G杂合子和C-A-T-C-A/T-A-G-G-G杂合子表达升高，但未达到统计意义(尸〉0.05)。结果表明，HCC中不同HTPAP单体型能影响HTPAP表达水平，但是无统计学差异。2)利用基因芯片研究HTPAP单体型调控HCC侵袭转移潜能的调控机制应用表达谱芯片分析不同单体型HCC的差异表达，探讨不同单体型HTPAP基因影响HCC的侵袭性潜能可能机制。选择T-G-G-G-G和C-A-T-C-A纯合子的HCC各16例，用AffymetrixHumanGenomeU133表达谱芯片进行分析，SAM分析(SignificantAnalysisofMicroarray)两组表达谱差异，并聚类分析后，Real-timePCR法进行验证；在此分析基础上，另分别选择T-G-G-G-G纯合子、C-A-T-C-A纯合子、T-G-G_G-G/C-A-T-C-A杂合子、C-A-T-C-A/C-G-T-C-A杂合子、T-A-G-G-G/C-A-T-C-A杂合子HCC各4例，行聚类分析验证。结果显示对T-G-G-G-G和C-A-T-C-A纯合子HCC各16例行SAM分析发现41个差异表达基因(包括2个转录本)，其中以IL-8在T-G-G-G-G上调表达8倍；聚类分析发现该41个差异表达基因(转录本)可以将两组很好地区分开来。同时应用该41个差异表达基因(转录本)对后续20例HCC聚类分析发现可以将T-G-G-G-G纯合子、C-A-T-C-A纯合子、T-G-G-G-G/C-A-T-C-A杂合子、C-A-T-C-A/C-G-T-C-A杂合子、T-A-G-G-G/C-A-T-C-A杂合子等五组HCC很好地区分为两大组即T-G-G-G-G纯合子+T-G-G-G-G/C-A-T-C-A杂合子+T-A-G-G-G/C-A-T-C-A杂合子和C-A-T-C-A纯合子十C-A-T-C-A/C-G-T-C-A杂合子。同时对总52例HCC聚类分析见相似结果。52例中临床表型分析发现前组的28例中有19例具有高侵袭转移潜能，而后组24例中有8例具有高侵袭转移潜能(^=0.025)。Real-timePCR和RT-PCR均验证了上述差异表达。结果表明，不同HTPAP单体型的HCC具有不同的基因表达谱，这些在不同HTPAP单体型HCC中具有显著差异表达的基因可能于HTPAP基因有关，并影响肝癌的不同临床表型，改变其侵袭转移潜能，提示HCC中HTPAP的不同单体型可能是潜在侵袭转移相关的预测指标。6、不同SNP基因型和单体型HTPAP蛋白在肝癌中的表达及其与术后无瘤生存(术后复发)的关系研究检测不同单体型的HCC中HTPAP蛋白的表达，探讨两者间的关系；检测665例HCC的5个SNPs位点，探讨SNPs和单体型与预后的关系。(1)应用免疫组织化学染色方法，观察HTPAP蛋白在377例HCC中的表达，分析SNPs和单体型与蛋白表达的关系；(2)显微切割2002—2003年手术切除的具有完整术后随访资料的665例HCC的石蜡包埋的肿瘤组织样本，提取DNA，应用焦磷酸测序方法对5个SNPs进行检测、单体型构建后，并统计665例术后无瘤生存时间(DFS，Disease-freeSurvival)，探讨SNPs基因型、单体型与术后DFS(术后复发)的关系。结果显示，(1)HTPAP蛋白的表达在377例HCC中有177例阳性染色(++++)，占46.9%，染色特点与肝癌侵袭转移潜能(有无肝内播散灶和脉管癌栓)分析发现，377例中193例具有高侵袭转移潜能的HCC中有80例HTPAP染色为阳性(41.5%)，而184例低高侵袭转移潜能的HCC中有97例为HTPAP染色阳性(52.7%)(/^0.028)，提示HCC的侵袭转移潜能与HTPAP蛋白表达负相关。TagSNP+357C/G基因型与HTPAP染色发现GG+GC基因型的HCC较CC型的HTPAP蛋白表达低(/M).002);而TagSNP+1838A/G分析发现GG+GA基因型的HCC较AA型的HTPAP蛋白表达无统计差异低(/M).130)。单体型分析发现T-G-G-G-G+T-A-G-G-G单体型HCC较其它单体型的HTPAP表达亦显著降低(ZM).OOl),免疫组化染色分析提示不同的单体型能影响HTPAP蛋白的表达水平。Kaplan-Meier生存曲线分析提示TagSNP+357GC的Genotype为GG,GC，CC的HCC之间的术后无瘤生存时间具有统计差异，Genotype为CC的HCC术后无瘤生存较为GG和GC明显好(代O.001);而TagSNP+1838A/G的Genotype为GG，GA，AA的HCC之间的术后无瘤生存时间无统计差异(/M).282)。单体型与预后分析发现T-G-G-G-G纯合子较T-G-G-G-G杂合子和其它单体型术后无瘤生存差(代O.OOl)，提示具有较高的术后复发风险。Cox风险比例模型多因素分析发现TagSNP+357GG+GC基因型和T-G-G-G-G纯合子或杂合子单体型是术后无瘤生存(术后复发)差的独立相关因子，分别为GG:/M).021，HR(liazardRatios)=1.51，95%C.I.=1.07-2.15,GC:/M).030，HR=1.29，95%CI=1.03-1.62;T-G-G-G-G纯合子/M).009,HR=1.59,95%C.I.=1.12-2.27，T-G-G-G-G杂合子AO.022，HR=1.32，95%C.I.=1.04-1.67。结果表明，肿瘤转移抑制基因HTPAP上的SNPs会改变肿瘤的侵袭转移潜能(1)Tag+357GG+GC基因型和T-G-G-G-G和T-A-G-G-G单体型的HTPAP蛋白表达较+357CC和C-A-T-C-A等其它单体型显著降低；(2)TagSNP+357GG+GC基因型和T-G-G-G-G纯合子或杂合子单体型是HCC术后无瘤生存差相关的独立因素，为HCC术后高复发风险的独立相关因子。序列表<110>复旦大学附属中山医院<120>肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型及其构建方法和应用<130>11<160>30<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>13<212>DNA<213>A伴<400>1cctgcctgcctag<210>2<211>14<212>DNA<213>人体<400>2cctcccaaagtgct<210>3<211>14<212>DNA<213>人体<400>3一ayttactatagcat<210>4<211>13<212>DNA<213>人体<400>4tcagcttaaattt<210><211>12<212>DNA<213>人体<400>5ctcytgtttcta<210>6<211>9<212>DNA<213>人体<400>61314141312aaaatcccc<210>7<211>13<212>DNA<213>人体<400>7ggkataaggagtg13<210>8<211>14<212>DNA<213>人体<400>8gtgaatgagggccg14<210>9<211>14<212>DNA<213>人体<400>9—ttcyctgatgggct14<210>10<211>15<212>DNA<2D>人体<400>10agcccattctgactt15<210>11<211>12<212>DNA<213>人体<400>11aaagtaaggctt12<210>l丕<211>18<212>DNA<213>人体<400>12ttctcttagtgtggtgac18<210>13<211>13<212>DNA<213>人体<400>13gmgcccaggtgtc13<210>14<211>14<212>DNA<213>人体<400>14acct鹏ggactga14<210>15<211>12<212>DNA<213>人体<400>15ctaaccacccca12<210>16<211>16<212>DNA<213>人体<400>16gcatctgcctc吗ccc16<210>17<211>14<212>DNA<213>人体<400>17tttrtactaggcca14<210>18<211>15<212>DNA<213>人体<400>18aagacatttctgagg15<210>19<211>13<212>DNA<213>人体<400>19ttcsaccccgaga13<210><211><212><213><400>20cggcctttgtagggac16<210>21M体<211><212><213>13DNA人体<400>21cgggtcatgggga<210>22<211>14<212>DNA<213>人体<400>22gggaggaaagacga14<210>23<211>13<212>DNA<213>人体<400>2〗cccmctgcccgac13<210>24<2U>16<212>DNA<213>人体<400>24ccgccgccccgtgccg16<210>25<211>13<212>DNA<213>人体<400>25cagttactttgc&13<210>26<2U>14<212>DNA<213>人体<400>26taaatcacttgaga14<210>27<211>14<212>DNA<213>人体<400>27cttttattttacaa14<210>28<211>13<212>DNA<213>人体<400>28atactttggaatt<210>29<211>13<212>DNA<213>人体<400>29ytctggtgcgttc<210>30<211>13<212>DNA<213>人体<40O30agc^ggagccag权利要求1、肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型，其特征是所述的单体型包括下述11种，其结构分别为C-A-T-C-A、T-G-G-G-G、C-G-T-C-A、T-A-G-G-G、C-A-G-C-A、T-A-G-G-A、C-A-T-G-A、T-A-T-C-A、T-A-G-C-G、C-A-T-G-G或T-G-T-C-G。2、按权利要求l所述的肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型，其特征是所述的单体型按SNP在染色体上的位置顺序依次为rs7007097C/T、rsl1539529A/G、rs3830326-/TAAG、rsl149C/G、rs3739252A/G，所述的位置顺序中的rs7007097-rsll539529-rs3830326-rsll49-rs3739252顺序分别以1-2-3-4-5表示；其中rs3830326的插入TAAG基因型以G示，T示无插入。3、按权利要求1所述的肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型，其特征是所述的单体型其中C-A-T-C-A、T-G-G-G-G、C-G-T-C-A和T-A-G-G-G占94.75%。4、权利要求1所述的肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型的构建方法，其特征是通过下述方法和步骤(1)选择有临床病理特征病人；(2)SNP检测采用焦磷酸测序方法对HTPAP基因的15个SNP位点进行检测，行焦磷酸测序；所述的15个SNP位点引物和测序引物序列是，SNP位引物序列引物序列测序引物待测序列<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage0</image>(3)构建单体型及单体型分析采用Haploviewversion3.32分析软件对单体型结构，频数及连锁不平衡分析，根据15个SNP的检测结果，选择有信息并最少等位基因频数大于或等于10%的SNP进行单体型分析。5、一种含有权利要求1的肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型的诊断试剂盒。6、权利要求1的肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型在制备诊断肝癌试剂盒中的用途。全文摘要本发明属基因工程领域，具体涉及一抑癌基因HTPAP的单体型及其构建方法和应用。本发明通过对肝癌病人的SNP检测、分析，构建了下述结构的HTPAP的单体型C-A-T-C-A、T-G-G-G-G、C-G-T-C-A、T-A-G-G-G、C-A-G-C-A、T-A-G-G-A、C-A-T-G-A、T-A-T-C-A、T-A-G-C-G、C-A-T-G-G或T-G-T-C-G。本发明的单体型可以为预测肝癌术后转移复发提供指导，且简单、方便、实用；对肝癌病人预后进行评估，并对及时采取综合手段干预，提高病人远期生存率，改善预后，提供参考；可与其他分子指标相结合，为肝癌复发诊断、预后预测提供新的试制盒，方便临床应用。文档编号C12N15/12GK101544978SQ20081013616公开日2009年9月30日申请日期2008年7月8日优先权日2007年7月31日发明者宁任,叶青海,周海军,孙海晶,武金才,汤钊猷,贾户亮,钦伦秀申请人:复旦大学附属中山医院