阿拉伯木聚糖降解酶的制作方法

专利名称：：阿拉伯木聚糖降解酶的制作方法阿拉伯木聚糖降解酶本发明涉及分子生物学领域。本发明特别涉及到编码有阿拉伯木聚糖降解活性多肽的基因的克隆和表达。这些酶适用于工业加工，如烤面包、加工紙和紙桨和制备祠料及食物(添加剂)。植物细胞壁的組成是复杂和变化的。研究发现多糖主要以长链纤维素(植物细胞壁的主要结构成分)、半纤维素(含有各种(3—木聚糖链)和果胶的形式存在。植物细胞壁中多糖的存在、分布和结构特性由以下因素决定(l)植物种类，(2)变种，(3)組织类型，(4)生长条件，(5)年龄，(6)喂养前植物材料的加工情况。单子叶植物(如谷类和禾本科植物)和双子叶植物(如苜蓿属植物、油菜子和豆科植物)之间、植物的种子和營养器官部分之间存在基本的差另'KChesson，1987;CarreandBrillouet，1986)。单子叶植物的特点是以阿拉伯木聚糖复合体为主要半纤维素骨架。双子叶植物中半纤维素的主要结杓是木葡聚糖复合体。另外，还发现双子叶植物中果肢的浓度比单子叶植物中的高。通常，种子内.的果胶类物质量很高，而纤维素类物质较少。.细胞壁中可区分出三种或多或少相互作用的多糖结枸(l)中间层形成外细胞壁。它还作为植物組织、基质内各个细胞间的连接点。中间层主要由高度酯化的果胶的钙盐組成；(2)初生壁就位于中间层的内侧。它是由包埋于果胶、半纤维素、酚酯和蛋白质的无定形基质中的纤维素微纤丝组成的有序结构；(3)次生壁是在植物成熟时形成的。在植物生长和老化期期间，纤维素、微纤丝、半纤维素和木质素沉积。成熟的代谢旺盛的植物细胞初生细胞壁比次生细胞壁对酶的水解作用更敏感，此时，次生细胞壁已经高度木质化了。细胞壁内的纤维素、平纤维素和果胶间有着高度的相互作用。这些相当强地交镨连接的多糖结构的酶降解不是一个简单的过程。例如，至少需要5种不同的S每来完全破坧阿拉伯木聚糖。内切是用内—卩(1-—D—木聚糖酶进行。外_(1—4)一D—木聚糖酶在多糖的非还原端释放木糖单位。另三种酶(a—葡糖普酸酶、a—L一阿拉伯呋喃糖普峰和L酰酯酶)用于攻击木聚糖骨架上的取代基。具体酶的选择当然取决于要;jl皮降解的具休的半纤维素(McClearyandMath-eson，1986)。攻击木聚糖侧链的蜂可能有意义，因为它们改变聚合物的特性，使之更适于某些应用。此外，这些酶可以与主链裂解酶一内木聚糖酶协同作用(广泛的综述见Kormelink，1992，博士论文，UniversityofWageningerO。编码一种阿拉伯木聚糖降解酶活性的一段DNA片段是已知的。在欧洲专利申请463,706中，给出了塔宾曲霉的内木聚糖酶的分离、特性和基因克隆。这个酶不能攻击阿拉伯木聚糖骨架的側链。能攻击侧链的酶活性也是从黑色曲霉得知的(Kormelink,1992，Supra，Chapters6和7)。一种;f皮称为阿4立伯。夫喃糖普酶A(ArafurA)的S每，其特征是具有释放从阿拉伯木聚糖获得的寡糖结构的阿拉伯糖残基的能力。然而，ArafurA对高分子量物质无活性。另外，黑色曲霉产生的一种叫ArafurB的峰，对寡糖有活性，对高分子量的阿拉伯木聚糖结构也有活性。ArafuirB的酶活性限于从末端单取代的木糖残基释放阿拉伯糖残基。至今还不知其DNA片段。现在已经从泡盛曲霉中分离到了在寡糖和高分子量阿拉伯木聚糖结构中都能从非末端单取代的木糖残基释放阿拉伯糖残基的酶。这个酶被命名为阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶(AXH)。至今尚未得到DNA片段和/或序列数据。显然，并不是所有的阿拉伯木聚糖降解中涉及的酶都已被发现(Kormelink，1990)。例如，还没有发现攻击阿拉伯糖双取代的木糖分子的酶，其中的原因是这些酶的分泌量低。在适当的宿主中分子克隆和过量生产这些酶，虽然不容易，但也是一个获得足够量纯酶的方法，这些錄反过来可以在各种应用中估量它们的重要性。本发明提供含有编码有阿拉伯木聚糖降解活性的多肽或其多肽前体的DNA片段的重組DNA，其特征在于所迷DNA片段选自(a)编码含SEQIDNO:5中氬基酸1至306所代表的氬基酸序列的多肽或氮基酸一27至306所代表的上迷多肽的前休的DNA片段；(b)編码含SEQlDNO:7中氬基酸1至306所代表的氩基酸序列的多肽或氮基酸一27至306所代表的上述多肽的前休的DNA片段；(c)编码仍然有阿拉伯木聚糖降解活性的、SEQIDNO:5或7中所示氛基酸残基1至306所代表的多肽的变体或部分，及其多肽前体的DNA片段；(d)编码有阿拉伯木聚糖降解活性的多肽并含SEQIDN0:5中核普酸784至1779或SEQIDNO:7中核普酸823至1818所代表的核普酸序列的DNA片段；(e)编码有阿拉伯木聚糖降解活性的多肽或这种多肽的一个部分的DNA片段，该DNA片段能与SEQIDNO:5中核普酸784至1779或SEQIDNO:7中核普酸823至1818所代表的DNA片段杂交。本发明的重組DNA优逸从一种的丝状真菌，特别是从曲拿类获得。特别优逸的重组DNA序列包括源于黑色曲霉和塔宾曲霉、II码AXDA的DNA片段。根据另一个实施方案，本发明的重組DNA包括该DNA片段在原核或真核宿主细胞(当存在于其中时)中表达所需的5，和3，DNA调控序列。此DNA调控序列与上述DNA片段的多肽编码序列间优选是异源性的，更优选这样的DNA调控序列与连接到它的同源性DNA调控序列上时，此DNA片段在宿主中的表达相比，该调控序列增强所述DNA片段在所述宿主中的表达。根据另一个实施方案，上迷重组DNA以载休的形式存在。本发明还提供了含本发明重組DNA的转化的真核或原核宿主细胞(优逸曲霉属细胞)，以及通辻在转化条件下用本发明重組DNA处理宿主细胞和筛选增强了阿拉伯木聚糖降解酶表达的细胞，获得增强了表达所述阿拉伯木聚糖降解酶的宿主细胞的方法。本发明还提供了一种获得阿拉伯木聚糖降解酶的方法，包括在对产酶有利的条件下，培养能产生上迷酶的宿主细胞并回收上述酶的步骤，其特征在于，上述宿主细胞或其上一代，已用本发明的重7组DNA转化。根据另一个实施方案，本发明提供一种有阿拉伯木聚糖降解活性的基本纯的多肽，其特征在于SEQIDNO:6或SEQIDNO:8中所示氮基酸序列，及其仍有上迷活性的遗传变体和部分。本发明还包括含有权利要求14的基本純的多肽的組合物，配制该组合物用于祠料、食品、或紙和紙浆加工，其中酶被固定或不固定。本发明还提供一种使用本发明的多肽帮助阿拉伯木聚糖降解作为伺料或食品添加剂，在迻或紙浆的加工过程和面包烤制中的^f吏用方法。本发明还要求含本发明多肽的饲料或食品。另一个实施方案提供一种包括由SEQIDNO:5中1至783核普酸代表的、能调节连接到其上的DNA序列表达的DNA片段或它的亚片段的重組DNA，还有包括由SEQIDNO:7中1至822核普酸代表的、能调节连接到其上的DNA序列表达的DNA片段或它的亚片段的重组DNA。通过下列附图的说明进一步说明本发明。附困的简要说明困1.阿拉伯木聚糖降解S每的HPLC洗脱图(OD280)困2.图示AXDA对玉米的水不溶固体(WIS)活性做为PH值的函数图3.作为粗AXDA酶量的函数，休外消化玉米WIS的百分率图4.pIM3001的限制性位点困图5.pIM3002的限制性位点困。本发明提供了纯化和分离的包括阿拉伯木聚糖降解酶基因的DNA分子和它的遗传变异体。此DNA分子可包括阿拉伯木聚糖降解酶编码区和与它相邻的5，和3，调节区。遗传变异休包括编码突变.阿拉伯木聚糖蛋白的DNA分子和所表达的酶仍保留目的活性的简并DNA分子。本发明还提供了在目的表达宿主中表达阿拉伯木聚糖降解峰的DNA枸建物。这些表达构建物包括含有与调节区可操纵性地相连的阿拉伯木聚糖降解酶编码区的杂合DNA分子，调节区如为来源于同源或异源生物的启动子、分泌和终止信号，在合适的宿i中这些调节区能指导由阿拉伯木聚糖降解酶编码DNA分子编码的S每的增强表达。更可取地，表达构建物将整合到选择的表达宿主的基因组中。本发明还提供了载体，特别是质粒，用于通过将DNA枸建物引入微生物宿主中来克隆和/或转化微生物宿主，以实现阿拉伯木聚糖降解酶的表达。另外，本发明提供了用含上述DNA枸建物的载体转化的同源或异源宿主。异源宿主可以选自细菌、酵母或真菌。在本发明的上下文中，"同源的"一词可以被理解为所有与编码感兴趣的阿拉伯木聚糖降解酶的DNA分子(包括其调节区)有天然联系的。"同源"宿主定义为能从中分离到这种DNA分子的种类。因此"异源的"一词定义为所有与编码惑兴趣的阿拉伯木聚糖降解酶的DNA分子(包括其调节区)无天然联系的。"非同源"宿主定义为除了能从中分离到阿拉伯木聚糖降解S争编码基因外的所有微生物种类。在本发明的上下文中，"感兴趣的阿拉伯木聚糖降解酶的增强表达"定义为感兴趣的阿拉伯木聚糖降解酶的表达水平高于同源野生型生物中的普通水平。同样，增强表达也包括惑兴趣的阿拉伯木聚糖降解酶在异源生物中的表达，该异源生物本身正常不能产生阿拉伯木聚糖降解酶，除非将编码感兴趣的阿拉伯木聚糖降解酶的表达构建物或DNA分子导入异源表达宿主。当然这些表达宿主的下一代也可以理解为包含在本发明之内。本发明还包括与从上述真菌获得的DNA序列杂交的DNA序列，但密码序列可因遗传密码的簡并或种间变异而不同。因此，本发明包括从除曲霉以外种类得到的编码阿拉伯木聚糖降解酶的DNA片段。典型地获得类似DNA片段的步骤包括筛选用含DNA片段(从一已知或预期能产生本发明的阿拉伯木聚糖降解酶的生物获得)的重組质粒转化的细菌或噬菌紐。原位复制DNA后，DNA从细胞或噬菌众中释放，固定到滤膜上(通常为硝酸^i素膜)。然后，此滤膜可用于筛逸互补DNA片段，用基于任何决定曲霉AXDA基因之序列的标记核酸探针筛逸。依据要篩逸的生物间关系的远或近，调整杂交和漂洗的条件，以便选出真正的阳性，减少假阳性的数量。滤膜固定化DNA杂交的典型步骤在《核酸杂交——实用方法》的第120和121页第五章表3中有述(B.D.Hames和S.J.HigginsEds.，1985，IRLPress,Oxford)。虽然最适条件是由经验决定的，但也可对有密切或稍不密切相关的序列给出一些有用的重要原则。为了鉴别与探针密切相关的DNA片段，杂交如上述Hames和Higgins书中的表3中描述的方法进行(其主要内容复述如下)，最后用0.IXSET緩冲液(20XSET:3MNaCl，20mMEDTA，0.4MTris—HCl，pH7.8，0.1%SDS)在68。C下进行高严格性漂洗。10鉴别与探针有限制同源性的序列要按上面提到的Hames和Higgins书中的表3中给出的步骤进行，但要降低杂交和漂洗的温度。例如，最后2XSET緩沖液在55。C下漂洗，可允许鉴定约有70%的同源性的序列。正如本领域技术人员所知道的，同源性和杂交条件间的确切关系取决于探针的长度、碱基組成(G+C^)和镨配的分布；随机分布对Tm值降低作用比镨配的非随机或成簇形式要强。'上述条件适用于长度至少为300bp，优选500bp，更优逸lkbp左右的探针，要探測的DNA的GC含量约为50±10%。如果给定生物的GC含量是已知的，那么反应条件可以考虑下列方程经验性优化(在1MNaCl中(G+C)^介于35%和75%之间时)Tm=81.5。C十0.41X(G+C)^。这大略的意思是如果GC含量即(G+C)^比平均值高10%，杂交条件(严格的)可通过提高4"C杂交和漂洗的温度调节。为了公开目的，上述与本发明的DNA片段杂交的片段被定义为在与SEQIDNO:5或7所述任何序列的至少300bp、优选500bp，更优选lkbp左右的探针杂交，并按Hames和Higgins书中第五章中表3提供的步骤(在下文中给出)在50"C下用2XSET緩冲液(即0.3MNaCl)进行漂洗后，在固定的DNA上给出了阳性信号。Hames和Higgins书中第五章表3的主要内容如下(1)无探针时滤膜的预杂交，(2)50—68"C下在下列緩沖液中杂交0.1—4XSET緩冲液(由严格性决定)，lOXDenhardt氏溶液(100XDenhardt氏;容液包括2%牛血清白蛋白，2%Ficoll，2%聚乙烯吡咯烷酮)，0.1%SDS，0.1%焦磷酸钠，50jug/ml的桂鱼精子DNA，声处理成200—500bp长度，置水浴中20分钟，加水稀释，终浓度为lmg/ml);杂交时间不十分严格，可以在1一24小时间任一值，优逸16小时(辻夜)；探针通常通过切口平移法用"P为放射性标记来标记，达比活性5X107—5X108c.p.m//ig;(3)用3XSET，0.1%SDS，0.1%焦磷酸钠于温度68°C(50—68"C间，由设计的严格性而定)下(重复)漂洗滤膜，重复漂洗同时SET浓度降为0.1%，4XSET中室温漂洗一次20分钟，在3MM紙上千燥滤膜，一70"C下在暗盒中将滤膜瀑光于X—光胶片上l一96小时(由信号的强度决定)，沖胶片。通常，预杂交和杂交混合物的休积应保持最小。所有"湿润"步骤应在一预热的水浴中的小封闭包中进行。上述方法是为定义按本发明能杂交的DNA片段。显然，鉴定和分离本发明DNA片段的方法可做许多修改。需要明确的是这样获得的DNA片段属于本权利要求范围，只要它们可以用上述方法检查出来，不论它们实标上是否已用上述方法鉴定和/或分离。适合用于鉴定和分离本发明DNA片段的许多方法已经描述在文献和手册(包括上面引用的Hames和Higgins的书)中了。上述方法是用于多核苷酸探针的。当用于寡核苷酸探针时，Td(在此温度下完全配对的杂合休半解离)由以下关系式估算Td-4^/GC碱基对+2'C/AT碱基对。在现有方法和这一重要原则的基础上，可设计寡核爷酸探针来从相关的和更远些的生物中有效地分离编码本发明阿拉伯木聚糖降解酶的DNA片段。如果一个酶已经从一不同的来源纯化，而且其部分氮基酸序列已经确定，用寡核苷酸的方法更有用。利用此序列，可制出许多簡并探针用于筛选DNA文库或做Southern杂交，基本上如上所述。用于筛逸的好候逸生物是其他丝状真菌类，如木霉属、青霉属、Dichotomitussqualus、Disporotrichumdimorphosporum，禾口细菌类，如芽孢杆菌类等等。如果最初的筛逸获得了似乎含有杂交片段的克隆，可分离这样的片段，必要时测序以确定序列相似性。一旦鉴定了某一感兴趣的阿拉伯木聚糖降解酶，编码这个酶的DNA序列可按如下从天然产生该酶的丝状真菌中获得，在含阿拉伯木聚糖的培养基中培养该真菌，用已知的方法(如实施例1中所示方法)分离目的阿拉伯木聚糖降解酶，并测定纯化蛋白的至少部分氯基酸序列。然后，根据推断的部分氨酸酸序列设计寡核苷酸序列可得到DNA探针。氩基酸序列可以由全蛋白的N—末端和/或利用蛋白酶解或化学消化的全蛋白的内部多肽片段的N—末端測定。得到后，DNA探针用于筛逸基因組或cDNA文库。基同組文库可以通过用识别4个连续核爷酸的DNA序列的限制酶(如Sau3A)部分消化真菌染然休DNA，并将得到的、片段克隆到速当的质粒或X—噬菌休载体(如入一GEM—11)中而制得。或者，cDNA文库可以通过克隆cDNA到一合适的噬菌体载体，如XgtlO中制各，从被诱导合成阿拉伯木聚糖降解酶的真菌细胞分离的mRNA合成cDNA。然后，倒平板生长出足量的菌落或p藍菌迩，基因組或cDNA文库可以用合适的DNA探针歸逸。如果这个方法不奏效，基因組或cDNA文库可能要用从非诱导的和诱导细胞中的mRNA所获得cDNA探针进行示差筛选。诱导mRNA是从生长在含阿拉伯木聚糖为碳源的培养基上的细胞制备的，而非诱导mRNA必需从生长在不以阿拉伯木聚糖碳源的培养基(如以葡萄糖为碳源)上的细胞制备。在只与诱导cDNA探针杂交的克隆当中，可以找到含有目的阿拉伯木聚糖降解酶编码基因的克隆。或者，可以将阿拉伯木聚糖降解酶基因与相关的序列进行交叉杂交来鉴别。优逸寡核苷酸探针从由黑色曲霉培养物的滤液所纯化的、表现分子量为32kDa的阿拉伯木聚糖降解酶N—末端氬基酸序列(见实施例1.5.1)和/或从酶用溴化氰消化得到的内部肽片段的氩基酸序列(见实施例l.5.2)获得。这样得到的寡核爷酸混合物可用于与基因組和cDNA文库杂交。或者就象这里描述的这样，纯化的AXDA酶可用来激发抗体。抗体用于表达文库的免疫舜选。这样来鉴定AXDA表达克隆。需要指出的是该蛋白质是从黑色曲霉塔宾变种分离的，cDNA是从黑色曲霉N400分离的，说明不同的曲霉有AXDA活性。随着新DNA扩增技术(如直接或反向PCR)的出现，已知道编码区的末端序列，就可以在体外克隆DNA片段。有了编码阿拉伯木聚糖降解酶的DNA序列，使得用定点诱变构建突变蜂分子成为可能。如果已知阿拉伯木聚糖降解酶的三级结构，而且它的催化和底物结合区已定位，就可以逸出发生最可能影响催化和/或底物结合功能的氱基酸，例如借助于计算机模型。如果不知道蛋白质的三级结构，可在整个密码序列产生随机突变，或者可以与从其他微生物分离到的已知的类似酶进行比较来预测蛋白质14的三级结枸。为了利用含AXDA编码序列的DNA片段插入到包括一个或几个异源调节区的表达拘建物中，可以用聚合酶链式反应(PCR，《PCR技术；DNA扩增的原则和应用》，(1989)H.A.Ehrlich，ed.，StocktonPress,NewYork)在AXDA编码序列的5，和3，端引入适当的限制性嗨切位点。限制性位点的逸择由表达载体的DNA序列而定，如DNA分子内其他限制性位点的存在。为了在原始(同源的)生产生物种，或者在异源真菌菌株中获得AXDA蛋白的增强表达，AXDA的DNA编码区(包括其控制区)要导入选择的表达宿主中以提高基因的拷贝数，结果提高蛋白质表达。如果优选异源表达宿主，逸择了一个酵母或细菌菌株，用一不间断的(无内含子的)DNA分子来构建异源表达载休，以避免异源宿主不识别基因组片段上存在的剪接信号的可能性。这种不间断的DNA分子可以从由引导AXDA合成的细胞分离的m8NA构建的cDNA文库获得。该文库可以用按上面提到的方法获得的寡核苷酸或cDNA探针来筛选。或者在从阿拉伯木聚糖引导的细胞RNA合成的cDNA第一链上用适当的5，和3，寡核苷酸进行聚合酶链式反应，得到不间断的DNA分子。目的AXDA的增强表达可以通过选择异源调节区(如启动子、分沁前导序列和终止区)来获得，它们用于提高表达，如果需要的话，还可以提高所逸表达宿主中目的蛋白的分泌水平和/或提供目标AXDA表达的诱导性调控。除了目标AXDA本身的启动子，其它启幼子也可用于指导AXDA的表达。启动子可以根据它在指导目标AXDA在目的表达宿主中的效率进行选择。在另一个实施方案中，可以逸择一个組成型启动子来指导目标AXDA的表达，而基本无其它酶表达。这样的表达构建物的另一优点是避免了对在含阿拉伯木聚糖为诱导底物的培养基中培养表达宿主的需要。优选用于真菌表达宿主的强組成型和/或诱导型启动子的例子是ATP—合成酶，亚单位9(oliC)，丙糖磷酸异构酶(tpi)，L醇脱氲酶(adhA)，a—淀粉酶(amy)，葡糖淀粉酶(gam)，乙酰臉酶(amdS)和甘油醛一3—磷酸脱氲酶启动子。强酵母启动子的例子是乙醇脱氲酶、乳糖酶、3—磷酸甘油酸激酶和丙糖磷酸异构酶启动子。强细菌启动子的例子是a—淀^^争启幼子、Spo2启动子和细胞外蛋白酶基因启动子。杂合启动子也可有利地用于提高表达构建物的诱导性调节。通常，希望目标AXDA从表达宿主中分泌到培养液中。根据本发明，目标AXDA自身的分泌前导序列可用于实现所表达AXDA的分泌。但酶表达的增加有时会导致蛋白产量水平高于表达宿主能够加工、分泌的水平而产生瓶颈，结果蛋白产物在细胞内积累。相应地，本发明还给出了异源引导序列以使S每从选择的表达宿主最有效地分泌。根掂本发明，分泌前导序列可以在目标表达宿主的基础上选择。可逸择与表达枸建物的其他调节区同源的l异源分泌前导序列。例16如，高分泌性葡糖淀粉酶蛋白的前导序列可与它自己的葡糖淀粉酶启动子结合，也可以与其他启动子结合。在本发明的上下文中，也可有利地应用杂合信号序列。优逸的异源分泌前导序列的例子是那些来源于葡糖淀粉酶基因(真菌类的)，a—因子基因(酵母类的)或a—淀粉酶基因(芽胞杆菌属的)的序列。一般地，不认为终止子是基因增强表达的重要元件。如果需要，可以从与启动子一样的基因中选择终止子，或者用同源终止子。除了上面提到的基因組片段，转化DNA可含一个选择标记，来从非转化细胞堆中区分出结合了目标基因的细胞。这个选择标记，带有逸当的5'和3"周节序列，可能在含有目标基因的同一DNA分子上或者在另外的分子上。在后一情况下，必需进行共转化。以适当方式调节表达载休与选择载体之比，使高百分比的所逸转化子同时掺入了含目的AXDA表达构建物的载体。最逸合于工业徵生物的选择系统是由在宿主生物中不需要突变的一组逸择标记組成的。真菌类的选择标记的实例为L酰M"酶基因(amdS)、ATP合成酶基因、亚单位9基因(oliC)和benomyl抗性基因(benA)。非真菌类逸择标记的例子是细菌G418抗性基因(也可用于酵母，但不能用于真菌)、氮辛青霉素抗性基因(大肠杆菌)和新霉素抗性基因(芽孢杆菌属)。一旦目的表达构建物装配好了，就转化到合适的克隆宿主(如大肠杆菌)中以增殖构建物。然后，将表达构建物引入适当的表达宿主中，在那里表达构建物就优选整合到基因組中。象芽孢杆菌类的宿主可作为克隆宿主又可作为表达宿主，因此避免了额外的转化步骤。根据本发明，多种生物可用作产生目的AXDA的宿主。在一个实施方案中，可以用同源表达宿主。这包括表达枸建物导回分离到AXDA编码DNA序列的菌株，提高基因拷贝数，或在上述异源调节区的控制下，或两者均有。在另一个实施方案中，目的AXDA的产生是通过在异源宿主(如细菌、酵母或真菌)中，在适当调节区的控制下，导入并表达编码阿^粒伯木聚糖降解酶的DNA构建物而实现的。为此，编码目的AXDA的DNA序列优逸在来源于异源宿主的启动子和终止子序列控制下表达。另外，为了获得产物的最大表达和分泌效率，有必要用与表宿主同源的前导序列取代原来的分泌前导序列。象大小(分子量)、适当的糖基化或目的AXDA细胞外分泌的需要等因素，在逸择表达宿主中起重要的作用。革兰氏阴性菌——大肠杆菌广泛用作异源基因表达的宿主。但是大量的异源蛋白倾向于在细胞内累积。从大肠杆菌细胞内蛋白中純化目的蛋白有时不容易。与大肠杆菌不同，芽孢杆菌属细菌非常适合于作为异源宿主，因为它们有将蛋白分泌到培养基中的能力。根据AXDA编码DNA分子本身的性质，和/或者对表达蛋白进一步加工的需要，可以优选象酵母、真菌这样的真核宿主。一般来说，酵母细胞优于真菌细胞，因为它们容易操作。但一些蛋白从酵母细胞中分泌的量少，.或者有时加工不正确(如在酵母内过多地糖基化)。在这样的条件下，应该逸择真菌类宿主。通过选择正常不能产生该酶的宿主(如乳克鲁维氏酵母)，异源宿主也可选来用于表达基本无其他多糖降解酶的目的AXDA。本发明范围内优逸的表达宿主，例如是真菌类，如曲霉种(在EP.184,438和284,603中有述)和木霉种，细茵，如芽孢杆茵种(在EP.134,048中有述)和酵母类，如克鲁维氏菌种(在EP.96,430和EP.301,670中有述)和糖酵母类。特别优逸的表达宿主可逸自,f、色曲霉，黑色曲霉泡盛变种、棘孢曲霉、米曲霉、木霉、枯草芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、乳克鲁维氏酵母和畔酒糖酵母。目的AXDA錄的表达受用适当的表达枸建物转化的表达宿主在常规的營养发酵培养基中的培养情况影响。发酵培养基由含有碳源(如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜等)、氮源(如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等)，有机氮源(如酵母膏，麦芽提取物、蛋白胨等)和无机營养源(如磷、镁、钾、锌、铁等)的普通培养基組成。可任逸地包含一种诱导物(如阿拉伯木聚糖)。合适培养基的选择是基于表达宿主的选择和/或基于表达构建物的调控要求而定的。这样的培养基是本领域技术人员熟知的。如果需要，培养基中可含对转化的表达宿主有利而对其他潜在的污染微生物不利的附加成分。发酵可用分批或补料分批工艺进行0.5—20天，温度0—45"C，pH2—10。优逸的发酵条件是温度20—37'C，pH3—9。最适条件依据选择的表达宿主而定。发酵结束后，用离心或过滤法从发酵液中移出细胞。去除细胞后就可回收酶，如果需要，用常规方法纯化和分离。产物可以稳定地配制成液体或固体的形式，对某些应用，优选将酶固定在固体基质上。用本发明的方法产生的酶可单独或与逸择的基他酶一起应用于需要阿拉伯木聚糖降解酶作用的各种加工工艺中。本发明的阿拉伯木聚糖降解酶可用于处理或制各食物(如面包)、伺料和饮料(如呌酒和果汁)。阿拉伯木聚糖降解酶也可有利也用于制各和处理纸和紙浆，尤其是与内木聚糖酶结合使用。正如本发明中所述，将阿拉伯木聚糖降解酶加到富含阿拉伯木聚糖的动物饲料中。当加到喂单胃动物(如家禽或猪)的饲料(包括青贮饲料，其中含有象大麦、小麦、玉米、黑麦和燕麦等谷类植物或谷类植物的副产品，如小麦結或玉米錄)中时，该酶可以显著改善植物细胞壁的破坏情况，使动物能更好地利用植物營养。最终，生长率和/或食物转化率提高。另外，阿拉伯木聚糖降解S每可以用于降低含阿拉伯木聚糖的伺料的粘度。如果优选预浸或湿饲料，阿拉伯木聚糖降解酶可以提前加到祠祠料或青贮饲料中。更有利的是，通过本发明产生的AXDA可在体内继续水解饲料中的阿拉伯木聚糖。阿拉伯木聚糖降解酶还可用于制作面包(如实施例8所述)。实验—菌抹大肠f茵BBS(Silvavetal.,1984):el4(mcrA)hsdR514,supE44,supF58,lacYl,orCi(laclZY)6galK2,galT22,metBl,trpR55,O(argF-lac)U1SS[F',proABlacIqZCiM15,TnlO,(te亡"〕大肠杆萄DH5o;(Hanahan,1983):supE44,iCdacU169,(<!>80〗scZCiM15),hsdR17,recAl,endAl,gyrA96thi-l,大肠杆菌LE392(Murray,1977):el4(mcrA)hsdR514,supE44,supF58,lacYl,orO(laclZY)SgalK2,galT22,metBl,trpR55大肠杆菌XL1-BlueMRF'(Jerpsethetal.,1392):O(mcrA)183,0(mcrCB-hsdSMR-mrr)173,endAl,supE44,thi-1,recAl,gyrA96,relAl,lac,[F',proAB,lacIqZ<2iM15,TnlO,(tet"].黑色曲霉N彻(CBS120.49)N402(cspAl)Gooseneta丄.，IS87)黑色曲霉NW219(leuAl,_nicAl,pyrA6)载体pBluescriptSK+/-(Short,J.M.,etsipUC19(Yanish-Perroneta工.，1985)按Sambrook等(1989)制备了下列溶液1988緩沖液TE'50*TAE'20*SSC;Denhardts,SM,DNA力a样培养基NZYCM,LB和基本培养基杂交按Visnkc和Santer(1957)制备Visniac;容液实施例实施例1:酶的分离实施例1.1:黑色曲霉泡盛变种的阿拉伯木聚糖降解酶活性A(AXDA)的纯化与特征黑色曲霉泡盛变种DS16813的培养按照EPA0463706中的描述进行，但不用酵母膏并用2%的粗制小麦阿拉伯木聚糖部分代替斯保耳特燕麦木聚糖，细胞通过过滤、去除，上清通过超滤干燥。为了纯化AXDA，将5g粗酶制备物稀释到100ml10mMTris/HCKpH8.0)中。过滤酶溶液(Seitz/suprono250和Sekz/S寧oEKS)并稀释到蛋白终浓度为5.2g/KBiorad蛋白測定)。粗酶通过HPLC(WatersPreparative650AdvancedProteinPurificationSystem)在DEAETSK650(M)阴离子交换柱(600mD上进行分部分离(速度25ml/min)。柱子用25mMTris/HCl(pH8,O)平衡，样品(3g蛋白)上柱并用含lOOmMNaCl的平衡缓沖液梯度洗脱。AXDA酶在53mMNaCl浓度处被洗脱下来，如固1所示。实施例1.2:最适pH为了确定AXDA粗酶制品的最适pH，用玉米的水不溶固体(WIS)聚合物部分作为底物。将1.6mg粗酶制品加入0.5gWIS并用从3.40到7.65的不同pH的緩沖液(100mMNaAc)稀释到5ml。样品在39。C保温60分钟并离心15分钟(2800g)，上清液中还原糖用Sumner试剂测定。Sumner试剂的制备10g苯酚加入到22ml10%NaOH.中，随后用去矿质水将休积调至106ml并加10gNaHS03。70ml该溶液依次加入300ml4.5%NaOH，255g酒石酸钾或酒石酸钠和800ml1%3.5—二碎基水杨酸，混和物随后在室温下欖拌直到化学试剂溶解。200^1样品中加入0.5mlSumner试剂并煮滞10分钟，冷却后加入5ml去矿质水，在515mn测定.消光值。样品的还原糖含量利用木糖标准曲线计算。该酶的最适pH为5.0，如困2所示。实施例1.3:氮基酸組成来自DEAE柱的AXDA部分的氬基酸組成在PICO—TAG150MM柱上测定(在254nm检测)，发现下列組成'。氛基酸:,'-:威;:计算的摩尔百分数:ASP1.1113.43GLU0.8.13SER1.0012.13GLN0.000，00GL>Y0，8410.25HIS0.121.30ARG/ASN0182.12THR0718.48ALA0748.83PRO0.344.00TYR0.465.54VAL0.435.06MET0.111.30工LE0.293.42LEU0.526.12PHE0.435.18LYS0.384.5923表l:AXDA的氮基酸組成HPLC泵CM4000;检測M440,254nm;加样4filGilson232;柱PICO—TAG150MM;数据系统Maxima实施例1.4:生化特征(等电点和分子量)AXDA的等电点(IEP)在Pharmacia微型凝胶(minigel)pH3—9上測定。蛋白用Pharmacia银染溶液染色。AXDA酶的等电点约为3.6。AXDA的分子量在Pharmacia微型梯度SDS凝胶(10—15%)上測定，蛋白用银染(Pharmacia)检測。AXDA的分子量约为32kDa。实施例1.5:黑色曲霉泡盛变种阿拉伯木聚糖降解酶活性A(AXDA)的蛋白测序实施例1.5.1:黑色曲霉泡盛变种阿拉伯木聚糖降解酶活性A(AXDA)的N末端氮基酸测序大約lnmol(&30Mg)AXDA在15%SDS—聚丙烯酰臉凝胶中进行电泳，而后根据Matsudaiza(1987)所描述的方法电转印到Im-mobilon—P膜(Millipore)上。含有具有32kDa表现分子量(SDS—PAGE)的主带的膜片段在气相测序仪(SONfacility，Leiden)中进行序列分析(Amons，1987)，确定出下列序列:ILys--Ala-Leu-Pr。-ser〈er,rI(SEQIDNO:1)实施例1.5.2阿拉伯木聚糖降解酶活性A(AXDA)的CNBr肽段的氮基酸序列测定大约2nmo1AXDA用CNBr进行化学裂解将大约2nmol("60pg)AXDA冷冻千燥并重新悬浮在含125fxgCNBr的60pil70%甲酸(2.5mg/ml)中，该反应混和物黑暗中室温下保温48小时。液体在Speedvac中蒸发，用无菌双蒸水清洗并再次蒸发。该清洗步骤重复两次。然后反应混和物在15%SDS—聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，随后根据Matsudaira(1987)所描述的方法电转印列Immobilon一P膜(Millipore)上，含有具有大约9kDa表现分子量(SDS—PAGE)的主带的膜片段在气相測序仪(SONfacility，Leiden)中进行序列分析(Amons，1987)，确定出下列序列CNBr肽段Ile-Val-Glu-Ala-Ile-Gly-SenG^His,-,Phe-(Arg/Asn)-(Ser)-(Phe)-(Thr)(SEQI聽2)不明确的氬基酸在括号中给出。实施例2:AXDA的酶特征用对确基苯阿拉伯呋喃糖爷为底物(Sigma)测定《—阿拉伯呋喃糖爷酶的活性。在lml底物中加300^1酶溶液。30"C温育15分钟后用5mlNa2C03(5M)中止反应。測402nm处的消光度。计算a—阿拉伯呋喃糖苷酶活性(休积X消光度)/(Ex时间)。制备的粗酶中含0.3pNPAFU/mg的a—阿拉伯呋喃糖普酶活性。测定从DEAE柱所得流份的活性。阿拉伯呋喃糖普酶活性部分含3.0pNPAFU/mg活性(见困1)。其他部分未发现有a—阿拉伯呋喃糖普峰活性。然后在玉米的水不溶性聚合物部分上測试a—阿拉伯呋喃糖普酶活性合并液，没有测到对此底物的活性。这表明AXDA对对辟基苯类底物无a—阿拉伯呋喃糖苷酶活性。为了进一步测定AXDA的S每活性，在含小麦阿拉伯木聚糖的底物上歸选用塔宾曲霉axdA—基因转化的黑色曲霉的培养物滤液的活性。塔宾基因被置于丙酮酸激酶(一种糖酵解酶)启动子控制之下，逸择生长条件以利于转基因的表达，而避免内源性阿拉伯糖降解酶的表达。相应地测出了AXDA对大分子量阿拉伯木聚糖底物有释放阿二粒伯糖的活性。用Sedmak的方法测蛋白质含量。AXDA活性的測定取lOO/il培养物滤液的不同释液(在10mML酸钠緩冲液中pH5.O)加到150^1的50mM乙酸钠(pH5.O)和250^10.4%小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme)混合液中，40"C温育1小时。10b"C加热此混合物IO分钟以终止反应。用HPAEC(高故阴离子交换层析)来跟踪阿拉伯木聚糖降解产物，用热灭活的培养物作为样品。结果如下表0塔宾曲霉AXDA对小麦阿拉伯木聚糖的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>1个单位的阿拉伯呋喃糖水解酶活性定义为每分钟从阿拉伯木聚糖释放l/^mole阿拉伯糖所需酶的量。推论塔宾曲霉的AXDA酶有阿拉伯呋喃糖水解酶(AXH)活性。用Megazyme的阿拉伯聚糖峰检测试剂盒并按其说明进行操作，测定阿拉伯聚糖酶活性。实验中，DEAE柱的AXDA合并液对线性阿拉伯聚糖无活性。这表明AXDA不是阿拉伯聚糖酶。用燕麦斯拜耳特木聚糖测定内阿拉伯木聚糖酶活性。将10ml5^的木聚糖悬液(100mMNaAc，pH3.5)煮淬10分钟。冷却后，39"C温育10分钟。加0.5ml蜂溶液开始反应。几次温育(5，10，15，20，25分钟)后，取在39"C温育的样品1.5ml，加到1.5ml脱矿质水中，煮沸10分钟。离心(2800g)样品15分钟。用Sumner试剂(见实施例1.2)检查上清液中的还原糖。在AXDA合并液中，发现了399.0U/mg的内木聚糖酶活性。然后在休外消化系统中(见实施例6)測定内木聚糖酶和AXDA。由此得出结论在AXDA合并液中的内木聚糖酶活性是与不同的多肽活性相关的活性。Kormelink(1992，phD论文，第6章，P107最后二段和P108)发现了与类似AXDA的酶共洗脱具有内木聚糖酶活性多肽的进一步"i正据。因此推断AXDA本身无内木聚糖酶活性。实施例3:cDNA表达文库的构建实施例3.1:mRNA的诱导和分离按EPA0463706中所述，分别培养黑色曲霉N40069和81小时，但无酵母膏，2%的粗制小麦阿拉伯木聚糖部分代替燕麦斯拜耳特木聚糖，然后辻滤收集菌丝体，用无菌盐水漂洗。然后在液氮中冷冻菌丝体，再用微脱膜器(Braun)磨成粉。按照Sambrook等人(1989)提出的异疏氰酸胍/氯化铯法从菌丝体粉中分离总RNA，只是用氯化绝梯度离心RNA两次。带polyA的mRNA是用oligo(dT)—纤维素层析法从5mg的总RNA中分离的(Aviv和Leder，1972，Sambrook等，1989)，并做如下修改所有的溶液中均无SDS，载样緩冲液用9^(V/V)的二甲基亚砜补充。实施例3.2:cDNA文库的构建用ZAP—cDNA合成试剂盒(Stratagene)按照厂商说明从7ygpolyA十mRNA合成cDNA，并连接到i菌体入一Uni—ZAPXR中。cDNA连到Uni—ZAPXR的载体臂后，根据操作说明用Packa-geneTMextracs(Promega)包装喧菌体DNA。将120ngcDNA连接到1.2pg载体臂上，然后包装反应混合物，产生包括3.5X104重組噬菌体的初级文库。用大肠杆菌XLl—BlueMRF，扩增此初级文库，滴定并在4"C保存。实施例4:用抗AXDA的抗休篩选黑色曲霉N400cDNA文庠并分离cDNA克隆实施例4.1:在兔体中制备抗AXDA的抗体对pH7.0的lmM石岸酸緩沖液中透析500pgAXDA并冷冻千燥。重悬蛋白质于lml无菌PBS(O.136MNaCl，2.7mMKC1，8mMNa2HP〇4，1.75mMKH2P04，pH7.4)中。向此蛋白质混合物中加入28lml福氏完全佐剂，涡旋30分钟，得到稳定的乳状液。将此混合物注入家兔皮下。第六周，加强注射加入O.5ml福氏不完全佐剂的溶于0.5ml无菌PBS的250MgAXDA。在第七周取家兔血并检查血清。第13周进行第二次加强注射250pg，第十四周取血。这一间隔6周取血的加强注射过程可重复儿次。收集的血样置于37"C保持30分钟，然后在4。C保存16小时。在Sorvall高速离心机中5000irpm离心收集血清。实施例4.2:用抗AXDAtub的抗体免疫f|选黑色曲霉N400的cDNA文库为了筛逸按实施例3.2所述枸建的黑色曲霉N400的cDNA文库，如已述(Maniatis等，1982，pp64)的方法在直径85mmNZYCM(含1.5%琮脂)平板(其顶层琮脂中含0.7%琮脂糖)上，每板铺5X103pfu的axdA克隆，用E.codiBB4为铺板细菌。按Sambrook等人(1989，ppl2.16—12.17)的方法，每个平板用硝酸纤維素滤膜(SchleicherandSc磁l，BA85)印两份。用欧洲专利申请91205994.5(公布号0463706Al)描述的免疫染色法染色后，可用高抗纯化AXDATUB的抗休(实施例4.l)显现AXDANIG。鉴定出重复出现在复制膜上的免疫染色的噬菌磁，筛逸了8个阳性噬菌斑。每个^菌免都用巴斯德吸管从平板中吸出，在含2(Vl氯仿的lmlSM緩冲液中使噬菌体从碌脂块中扩散出来(Mnaiatis等人，1982，pp64)。用从含50—100个所分离噬菌体噬菌斑的平板得到的滤膜复制品，重复上述方法，纯化得到的噬菌体。純化以后，将噬菌休(5X103个)铺在NEYCM培养基中增殖噬菌体。37。C辻夜培养，得到铺满的平板，加5mlSM緩冲液从中洗脱噬菌休，平板置4"C、4000xg保存2小时，间断摇动。用吸管取上清后，4。C离心10分钟从溶液除去细菌。在上清液中加入0.3%氯仿，测定滴度pfu。此噬菌休储液的滴度约为10"pfu/ml。实施例4.3:axdAcDNA克隆的限制酶切分析根据厂商说明，利用与丝状辅助噬菌体ExAssistTM(包括在Stratagene的ZAPTM—cDNA合成试剂盒中)双重感染，将含axdAcDNA的重組Uni—ZAPXR克隆转到Bluescript噬菌粒中。然后按Sambrook等人(1989，ppl.25—1.28)的方法分离-藍菌粒DNA。8个axdAcDNA克隆的分离DNA用下列限制性内切酶EcoRI和Xhol进行限制酶切分析。DNA在由下列溶液組成的反应混合物中在37"C消化2小时2卩1(=l;ig)DNA溶液；2^1适当的10X反应緩冲液(BRL);10U的各种限制性内切酶(BRL)和无菌蒸馏水，终体积为20W。加DNA载样緩冲液后，加样于0.7%TAE—碌脂糖凝胶。80伏电泳分离DNA片段1.5小时。限制性酶切分析表明axdAcDNA克隆的分子大小约为1.2kb。实施例4:,f、色曲霉axdAcDNA克隆的序列分析用序列分析结合在测序反应中用物异的寡核普酸作引物来測定cDNA克隆的一级结构。用双脱氣寡核爷酸链终止法(Sanger等，1977)用PharmaciaT7DNA聚合酶测序试剂盒测定寡核普酸序列。用PC/GENE程序进行计算机分析。实施例4.5:片段的"P标记,f、色曲霉axdAcDNA克隆片段的分离和标记按照欧洲专利申请91205944.5(公布号0463706Al，实施例2.2和7.1，并入本文作为参考)描述的方法进行。实施例4.6从黑色曲霉黑色变种的基因组文库筛逸axdA基因，并分离该基因。为了歸逸按照Hamisen等人(1990)的方法构建的黑色曲霉黑色变种文库，每个平板铺3X103pfu的axdA基因，平板为5个Ma-niatis等(1982，pp64)所述的85mm直径的NZYCM(含1.5%^脂)，顶层碌脂为含0.6%琮脂糖的NZYCM，.用大肠杆菌LE392为铺板细菌。37。C过液培养，按照Maniatis等人的方法(1982，pp320—321)每个平板在HybondN滤膜(Amersham)上印二份。用3XSSC湿润滤膜后，室温下用3:XSSC沖洗60分钟。滤膜在65"C下预杂交二小时，预杂交緩沖液含有6XSSC，0.5%SDS，10XDenhardt氏溶液，0.01MEDTA和100pg/ml热变性的绯鱼精子DNA(BoerhingerMannheim)。预杂交二小时后，用杂交緩冲液代替预杂交緩沖液。杂交緩沖液与预杂交緩沖液相同，只是含有按实施例4,5制备的"P标记的含黑色曲霉axdAcDNA克隆(见实施例4.3)的1.2kb片段。滤膜在65。C温度下杂交18小时。杂交后滤膜先在65"C下用5XSSC/0.1%SDS漂洗30分钟，再于2XSSC/0.1%SDS中65"C漂冼30分钟。然后于0.1XSSC/0.1%SDS中65T漂洗30分钟，最后在0.1XSSC中65。C漂洗30分钟。风千的滤膜置于一张3MMWhatman紙上，用放射性墨水做标记，用SaranWrap盖上Whatman紙和滤膜。用KodakXARX—光胶片在一7(TC时放置72小时，用增敏屏鉴定杂交噬菌论。31找到了出现在复制滤膜上的10个阳性杂交噬地。用巴斯德吸管吸出4个阳性噬紐。按Maniatis等人的方法(1982，pp64)在含20^x1氯仿的lmlSM緩冲液中，使噬菌体从碌脂块中扩散出来。用含分离的噬菌休的50—100个噬菌&的平板滤膜复制物重复上述方法，纯化得到的噬菌休。纯化以后，^菌休(5X103个)铺于NZYCM培养基中增殖。37。C培养过夜，得到铺满的平板。加5mlSM緩沖液洗脱噬菌体，平板置4。C保存2小时，间断摇动。用吸吸管取上清液后，4"C、4000Xg离心IO分钟从溶液中除去细菌。在上清液中加0.3%氯仿，測滴定度。此噬菌体储存液的滴度约为107pfu/ml。实施例4.7:从入噬菌体中分离DNA在300/ilSM緩冲液中，5X109E.coliLE329和2X106嗜菌体一起在37'C培养15分钟来增殖每个分离的噬菌休。然后将被感染的细菌接种到100ml预热的(37"C)NZYCM培养基中，置于NewBrunswick旋转振荡器上(转速250rpm)37"C培养9—12小时。然后裂解细菌，用Sorvall高速离心机，4"C，10，000rpm离心10分钟去除细菌碎片。加入10g聚L二醇一6000和11.7gNad于上面得到的上清液(100ml)中并将溶液置于4"C过夜，以沉淀噬菌休。沉淀的噬菌体经4"C、14，OOOXg离心20分钟收集。吸出上清液，最后泉量液体用紙巾吸出。小心地重悬噬菌体于4mlSM緩冲液中并用等体积的氯仿抽提一次。在从^菌体颗粒中提DNA之前，先在37"C用DNaseI和RNaseA(都是100/ig/ml)温育噬菌体悬液30分钟，以除去来自裂解细菌的DNA和RNA。然后加入EDTA达终浓度20mM，使噬菌休DNA从峻菌休中释放出来，同时用等体积的酚氯仿异戊醇(25:24:1)抽提两次去蛋白质。用Sorvall离心机(1400Xg，10分钟)离心使液相分层后，水相用等体积的氯仿异戊醇(24:1)抽提一次。离心分离噬菌体，然后加入0.1倍体积的5M高聚酸钠和0.1倍体积的异丙醇，冰上温育30分钟使DNA从水相中沉淀。4'C离心(14000Xg)10分钟回收DNA。吸去上清，重悬DNA于400/jiITE缓冲液中。加入0.1倍体积的3M乙酸钠和2倍休积的L醇再沉淀一次DNA。4。C离心(14000Xg)10分钟收集DNA。吸去上清.，真空千燥留下的固休物，然后在含0.lyg/mlRNaseA的125pdTE緩沖液中重悬DNA。这样的纯化步骤可从每一噬茵体中分离大约50—lOOpgDNA。实施例4.8:含黑色曲霉黑色变种axdAcDNA噬菌体的Southern分析。用下列限制性内切酶对Xnigaxd1至入nigaxd4喧菌体的分离DNA进行Southern分析Kpnl，Sail,Sstl，Xbal和Xhol及S每組合kpnl+Xbal，kpnl+Sstl及Kpnl+Xhol，在37"C下反应5小时，反应混合物中包括下列溶液5fxl("lpig)DNA溶液，2yl适当的10X反应緩沖液(BRL)，10U限制性内切酶(BRL)和无菌蒸馏水，调节终休积为20/^1。消化后，加入0.1倍体积3MNaAc和2倍休积的L醇来沉淀DNA。室温下离心(14000Xg)10分钟收集DNA。吸去上清液，真空下迅速千燥留下的因体物，重悬在无菌蒸馏水中。加入4ylDNA载样緩沖液后65"C保温10分钟，迅速在冰上冷却，之后加样到TAE緩冲液中的0.6%碌脂糖凝胶中。25V下电泳15—18小时分离DNA片段。电泳后，用碱性真空印迹法(VacuGeneXL，PharmaciaLKB)变性并转移DNA至尼龙膜(HybondN，Amersham)上，(按指导手册中的方法，pp25—26)，然后如实施例4.6所述，用标记的黑、色曲霉axdAcDNA克隆预杂交和杂交，杂交条件如实施例3.3中所迷。杂交固用增敏屏在一7(TC下用KodakXAR—5X光胶片曝光而获得。从所得的结果推断全部4个分离克隆的DNA与黑色曲霉ax-dAcDNA杂交。在全部4个克隆中，找到了来源于同一基因組区域的片段。、实施例4.9:黑色曲霉黑色变种的axdA基因的亚克隆用冷冻挤压法从0.7%的琮脂糖凝胶中分离来自Xnigaxdl的3.7kb的Xhol片段电泳后，切出合适的带，在lmlFSl溶液(0.3MNaAc，pH7，0，lmMEDTA)中轻轻摇荡30分钟。将碌脂糖胶条转移至一个0.5ml的eppendorf管中(其中有一个小的砝烷化的玻璃棉塞，底部有一小孔)，在液氮中冷藏。从此O.5ml管移至一只1.5ml的eppendorf管中，然后离心10分钟。在上清液中加入1/50体积的FS2溶液(O.5MMgCl2，5%乙酸)和2.5倍体积的100%乙醇。一7(TC保存20分钟，4"C(U000Xg)离心15分钟收集DNA。移去上清液后，用SavantSpeedvac真空离心机千燥DNA沉淀。将此DNA溶于1(^1TE緩冲液中，用碌脂糖电泳测定其浓度，用已知浓度的XDNA作为参照，溴化L锭染色检测DNA。载体PBluescriptSK—用Xhol消化，用碱性磷酸酶去磷酸化。按下述方法制各lpl(WMl)pBl薦ript与10X反应液2(BRL)，lptKlU/pd)Xho1和无菌蒸馏水混合。DNA在37。C下消化2小时，然后加入0.5^1碱性磷酸酶(lU/yl，Pharmacia)，再继续在37。C温育30分钟。如上所述线性化的载休用0.7%碌脂糖凝胶分离。按下述步骤将3.7kbXhol片段连接到Xhol消化的去裤酸化的pBluescriptSK-载体中将40ngpBluescript片段与300ng3.7kbXhol片段混合，再加入4^15X连接緩冲液(500mMTri—H￡l，pH7.6;lOOmMMgCl2，100mMATP，10mM二硫苏糖醇，25%PEG—6000)和lfil(lU/(il)T4DNA连接酶(BRL)，最终休积为20pl。得到的质粒被称为pIM3002。、混合物在16"C温育16小时后，用Ca—HEPESpH7.0的緩冲液稀释到100^1。取10pl所稀释的混合物来转化E.coliDH5a感受态细胞。该细胞的制备方法如下200;i1的预生长在LB培养基(LB培养基/lOOml:10g胰蛋白酶胨(BBL)，5g酵母膏(BBL)，10gNaCl，0.5mMTris—HCl，pH7.5)的E.colipH5a过夜培养物。此培养物在定轨摇床上37"C培养，直至其浓度达到OD.600介于0.15—0.2之间。4"C、5000rpm离心收集细菌。弃上清，迅速置细胞于冰上。用100ml的100mMMgCl2、5mMTris—HClpH7.4漂洗细菌沉淀，悬浮细胞，再如上离心。用100ml的100mMCaCl2、5mMTris—HClpH7.4重复该操作。最后将细胞悬浮在2ml的100mMCaCl2、5mMTris—HClpH7.4，14%甘油的混合液中。各等份可以立即用于转化，也可于一70'C冷藏。E.coliDH5a感受态细胞用于转化实验50^1的细胞悬液与4.5^1的连接混合物混合，冰育30分钟后，42"C温育细胞2分钟。然后加入lmlLB培养基，在37"C温育1小时。14000g离心30秒收集细菌。弃上清，将细胞重悬于200W的LB增培养基中。形成的细菌悬液铺在含1000/ul/ml氮苄青霉素、50jLtgX—(Gal)半乳糖和60ptg/mlIPTG的LB培养基平板上。.从形成的菌落中挑出12个，在含100pg/ml氮苄青霉素的LB培养基中培养过夜。用Maniatis等人(1982，pp368—369)的碱裂解.法从培养物中分离质粒DNA，它可用于如实施例4.3所述的限制性酶切分析以选出带有目的质粒的克隆。根据厂商的操作说明，用NuckobondPC—500试剂盒(Nagel)从250ml含质粒pIM3002的E.coliDH5a培养物(生长在含100fil/ml氬节青霉素的LB培养基中)中大量分离质粒DNA。质粒pIM3002进一步用限制性内切酶分析，得到的限制性酶切困见图4。一个含pIM3002的E.codiDH5a样品于1995.8.28日保藏在荷兰Baarn的CBS，保藏号为CBS637-95。实施例4.10:克隆基因在黑色曲霉NW219中的超量表达。实施例4.10.1:利用共转化法将黑色曲霉黑色变种的axdA导入黑色曲霉NW219中。在实施例4.9得到的质粒pIM3002通过黑色曲霉NW219的共转化导入果色曲霉中，用黑色曲霉pyrA基因作为质粒PGW635(Goosen等，1987)上的逸择性标记，质粒plM3002为共转化质粒。黑、色曲霉NW219的一个样品于1995,8,25保藏在荷兰Baarn的CBS，保藏参为CBS635.95。用生长在补加了5%酵母膏0.2%酪蛋白氛基酸，50mM葡萄糖、10mM烟酰脍和10mM尿普的基本培养基中18小时(3(TC下)的黑色曲霉NW219的菌丝体制各原生质体，并按照Goosen等人(1987)的方法进行转化操作。得到的PYR+转化子用Westernblot分析法分析黑色曲霉黑色变种axdA基因的表达。实施例4.10.2:筛选表达黑色曲霉黑色变种的axdA基因的转化子。对实施例4.10.1获得的转化子进行黑色曲霉黑色变种axdA基因产物(AXDA,蛋白质)的形成分析。在一个生长实验中，，用19个这样的转化子来分析AXDA^g的表达。黑色曲霉N402抹用作野生型对照。按实施例3.1所述，转化子分别生长了24、40、48和68小时。然后，过滤去除菌丝休，培养物滤液用从家兔中获得的抗AXDAtub抗休(实施例4.1)进行Western印迹分析。用此方法检測发现，分析的19个转化子中有8个超量产生AXDAnk蛋白。实施例4.11:黑色曲霉黑色变种axdA基因的序列分析和描述。在测序反应中用来自pBluescriptSK-中pIM3002和pUC19的亚克隆片段结合特异寡核普酸作为引物，測定黑色曲霉黑色变种的axdA基因的序列，它的启动子/调节区，基因的结构部分和终止区。核酸序列的测定如实施例4.4中所述(SEQIDNO:5)。得到的序列包括2101个bp，783个bp在5'端非编码区，332个bp在3'端非编码区。在5'非编码区的665—670位置，发现了一个TATA盒。黑色曲霉axdA基因的编码部分有996bp长，未被内含子打断。该基因编码一个有332个氬基酸的蛋白质。N—末端序列(象在实施例1.5.1中根据黑色曲霉塔宾变种的AXDA蛋白质那样测定)之前有一段长度为26个氩基酸的前肽。成熟蛋白质大小为306个氩基酸，预测其分子量为33.OlkDa，理论等电点为4.07。实施例5.1:PCR所得含黑色曲霉塔宾变种axdA基因序列的cDNA片段的克隆37实施例5.1.1:利用PCR法生成cDNA片段内部CNBr片段(SEQIDNO:2)的部分氩基酸序列(见AX-DAxuB的测定)用于设计寡核普酸混合物。由此得到下面的混合物5'—ATGATKGTIGARGCTATKGG—31(20个碱基)(SE-QIDNO:3)，其中，I代表次黄嚯呤核普，K代表A、T或C，R代表A或G。这个寡核普酸是从上迷实施例1.4.2中所述的AXDAtub的内部氱基酸序列(氱基酸l(I)到6G)推演出来的。ATG是从甲硫氛酸推出的，如人们所知因为CNBr裂解机制，甲硫氮酸出现在肽片断N—末端。这个寡核苷酸混合物与寡核苷酸T7(Stratagene)51—AATACGACTCACTATAG—31(17个碱基)(SEQIDNO:4)起用于如实施例4.7中分离的cDNA的PCR反应。为进行PCR反应，将2^1的入一cDNA与5/LtllOX反应緩沖液(100mMTris—HC1，pH8.3，500mMKC1，15mMMgCl2，0.01%明胶)、4.0^11.25mM四种脱氣核苷三磷酸，和0.5yg的寡核苷酸混合，终体积为50pl。混合反应混合物，加入0.5fxlTAQ聚合酶(5U/pd，HTBiotechnology,Cambridge,UK)。DNA置于95"C温育3分钟热变性，然后进行25次循环，95。Cl分钟,42'Ct分钟，72"C1分钟。25次循环后，混合物置于72X:温育5分钟。对反应产物的分析揭示了两个分立的产物:'500bp和600bp。根据AXDA的表现分子量32kDa和CNBr肽的表现分子量9kDa，此片段在预计范围内。实施例5.1.2:500bp和600bpPCR片段的克隆和分析实施例5.1.2.1:500bp和600bpPCR片段的克隆依照厂商操作说明，两个500bp和6.00bp的PCR片段都连到一个pGEMTM—T(Pomega)载休上。U"C温育16小时后取4.5yl的连接混合物转化E.codiDH5a感受态细胞。每个连接反应选出6个菌落在含100pg/ml氩爷青霉素的LB培养基中培养过夜。按照Ma-niatis等人(1982，pp368—369)的碱裂解法分离培养物的质粒DNA。实施例5.1.2.2:500bp和600bpPCR片段的序列分析按照实施例4.4的方法测定片段序列确定500bp和600bpPCR片段的一级结枸。两个PCR片段的核爷酸序列的计算机分析表明600bp的PCR片段与已知的阿拉伯木聚糖降解基因无相似性，因此被看成是一个PCR反应的假相。500bpPCR反应片段的核普酸序列与困4所示的cDNA克隆的核爷酸序列，从706至1204很相近。实施例5.2:500bpPCR片段的"P标记PCR反应得到的500bp片段按欧洲专利申请91205944.5(公布号0463706Al，实施例2.2和7.1并入本文中作为参考)中所述方法进行分离和才示记。实施例5.3:从黑色曲霉塔宾变种基因組文庠筛选axdA基因为了筛选黑色曲霉塔宾变种的基因組文庠(按照欧洲专利申请91205944.5，公布号0463706Al实施例2的方法构建)，按实施例4.6的方法铺平板，每板铺3X103pfuaxdA基因，用"P标记的500bpPCR片段(按实施例5.1.1的方法制备)作为探针。出现在复印膜上的重复的三个杂交噬地被鉴别并定名为入tubaxM到入tubaxh3。按实施例4.6的方法分离和扩增噬菌休。实施例5.4:含黑色曲霉塔宾变种axdADNA的喧菌体的Southern分析按实施例4.7的方法分离入噬菌休的DNA。用下列限制性内切酶对从噬菌休Xtubaxdl.至Xtubaxd3分离的DNA进行Southern分析BamHI、EciRI、Hind迈、KpnI、SalI、Sstl和Xhol。按实施例4.8的方法进行Southern分析。从得到的结果推断全部三个分离克隆的DNA与黑色曲霉塔宾变种的axdAcDNA杂交。在全部三个克隆中都发现了来自相同基因组区的片段。实施例5.5:黑色曲霉塔宾变种axdA基因的亚克隆来自入tubaxds的5.5kbSstl片段被分离并连到按实施例4.9的方法用Sstl消化并去磷酸化的pBluescriptSk—载休上，产生一个被称为pIM3001的质粒。进一步用限制性内切酶分析质粒pIM3001，得到的限制性S每切固示于困6中。一份含pIM3001的E.coldiDH5a样品于1995，8.28保藏荷兰Baarn的CBS，保藏号为CBS636.95。实施例5.6，黑色曲霉塔宾变种的axdA基因在黑色曲霉NW219中的表达。实施例5.6.1:通过共转化将黑色曲霉塔宾变种axdA基因引入黑色曲霉NW219中。按实施例5.5得到的质粒pIM3001，按实施例4.10.1的方法对黑色曲霉NW219共转化，引入黑色曲霉中。然后用Western印迹分析法分析得到的PYR+转化子的黑色曲霉塔宾变种axdA基因的表达o实施例5.6.2:筛选表达黑色曲霉塔宾变种axdA基因的转化子。实施例5.6.1获得的转化子被用于分析,f、色曲霉塔宾变种ax-dA基因产物(AXDAruB蛋白)的形成。在生长实验中用了19个转化子来分析AXDAtub的表达。黑色曲霉N402株被用作野生型对照。转化子按实施例3.1的方法分别培养20、41、60和86小时。然后辻滤，去除茵丝体，用从家兔中获得的抗AXDATue的抗体(实施例4.l)用Western印迹法分析培养物滤液。分析的19个转化子中有12个产生能用此方法检查到的AXDAtub蛋白盾。实施例5.7:黑色曲霉塔宾变种axdA基因的序列分析及描述在测序反应中，用来自pBluescriptSK—中pIM3001和pUCl9的亚克隆片段结合用特异的寡核苷酸作为引物，测定黑色曲霉塔宾变种axdA基因的序列，它的启动子/调节区、基因的结构部分和终止区。核酸序列的测定如实施例4.4中所述(SEQIDNO:7)。得到的序列包括2859个bp，823个bp在5，端非编码区，1041.个bp在3'端非编码区。在5'端非编码区的651—655位置发现了一个CAAT盒，在713—720的位置发现了一个TATA盒。，f、色曲霉塔宾变种axdA基因的编码部分长度为996个bp，未被内含子打断。该基因编码的蛋白质有332个氨基酸。按实施例1.5.l测定的N—末端序列之前有一个长26个氬基酸的前肽。成熟的蛋白质有306个氛基酸大小，预计其分子量大小为33.250kDa，理论等电点为4.20。实施例6:用AXDA休外消化玉米。实施例6.1:水不溶性固体(W1S)的分离分离用于体外消化系统的玉水的不溶于水的聚合物部分。用Retsch研磨机磨玉米(3mm大小)，用己烷(索氏蒸馏装置)脱脂6小时，然后在105"C千燥，再磨碎(lmm，Retsch研磨机)。在脱脂的400g玉米中加1.5升1.5%SDS/0.05^卩一玟基L醇，室温搅拌1小时(以破坏蛋白质)，然后24000g离心15分钟。蛋白质变性后，用1升SDS/P—统基乙醇洗沉淀三次，再用1升脱矿质水洗二次。沉淀重悬在4升的脱矿质水中，舜滤(32pm)。.重复漂洗和筛滤过程。粗WIS沉淀部分(大于32ptm)溶于1升的马来酸緩沖液中(pH6.5)90。C保存50分钟。再加2mga—淀粉酉|(MaxamylTMGist—brocades),30"C下保存16小时。然后24000g离心15分钟。65"C脱矿质水洗三次后，重复酶消化。冷冻干燥沉淀(WIS)。WIS含30%木糖，29%阿拉伯糖、23%葡萄糖和7%半乳糖。测定的葡萄糖不来自淀粉(BoeringerMannheim，淀粉測定试剂盒)。实施例6.2家禽休外消化系统120"C烘千前后分别測定WIS的千物质含量(95.73%)在家禽体外消化系统中向lg的WIS中加入200yNaN3(Merck)和1ml内标(山梨醇35mg/ml，Sigma)。为进行谷物的酶消化(含200)Mg蛋白质或不含酉每)，用緩冲液(NaAc，pH5.5)调节样品休积至15ml，39"C温育1小时，对胃消化，加5ml的胃蛋白睡(5.28g/L，pH3.0，Merck)，39"C温育1小时。对肠道消化，加入2.5ml的胰酶制剂/胆汁盐(浓度分别为16g/l，0.lg/l，Merck),39€温育1.5小时。离心样品(2800g)15分钟。取上清测在S每消化过程中被释放出来的单糖(HPLC，SpectraPhysics;HPX—87P柱，Biorad)。12(TC千燥沉淀，并称重。计算千物质的百分率。作为对照，在体外系统中加入不同剂量粗酶制品(结果见困3)。与空白对照相比，AXDA酶(加入了200/agAXDA蛋白)对干物质42消化率有很大的提高。对玉米WIS部分的千物质消化率(15.8%)比对照的提高了4.1%。实施例7:玉米WIS的,体外消化率实验实施例7.1:玉米WIS的分离按实验例6的方法分离玉米WIS，由于SDS/硫基L醇不适于温育动物饲料而做一些改动。用lkg脱脂玉米进行分离。在lkg脱脂的玉米中，每100g玉米蛋白力a4g木瓜蛋白酶(Gist-brocades)，3CrC悬浮2小时。然后，用Maxamyl(Gist—brocades)(2ml/l)在100"C消化，再离心(24000g)15分钟。弃上清，沉淀再次用酶消化。再离心悬浮液，用脱矿质水(1L)洗三次。然后冷冻千燥沉淀(水不溶固体物)。用三氟L酸(TFA)分析法测定玉米WIS中的单/寡糖类含量。在0.3gWIS中，加入lml35mg/ml山梨醇(内标)，2ml脱矿质水和450fxlTFA，然后，12(TC水解1小时。冷却后，加入20ml脱矿质水，继续在120。C水解1小时。冷却后，将样品冷冻千燥，重悬于3ml脱矿质水中。在HPLC系统中(SpectraPhysics)用HPX—87P柱(Bio-rad)除去单糖。玉未的WIS聚合物部分含有124.8mg/g木糖；96.6mg/g阿拉伯糖；28.2mg/g半轧糖和156.0mg/g葡萄糖。由于葡萄糖含量高，分析WIS部分的淀粉(淀粉测定试剂盒，BoehringerMannheim)，发现WIS部分不含淀粉。实施例7.2，小鸡消化率试验为測定AXDA酶对一种食物(其中加入了20%的玉米WIS)的实标可代谢能量含量的影响，进行了一种试验。所用方法是改进的"同胞分析"。雄鸡(三周龄)分别养在人工调节室的笼子里禁食48小时，然后用试管喂进准确定量的饲料。为校正含内源性能量成分的损耗，试验还包括一对照組。喂这些鸡10gD—葡萄糖，其他的喂10g饲料。每份铜料分喂给,6只鸡。葡萄糖对照.組有5只鸡。再禁食48小时，其间定量收集其排泄物。排泄物存放在一2(TC条件下，直到用于分析。此间喂一次水(也用试管喂)。冷冻千燥所收集的消化物，空气中平衡后称重。分析伺料和消化物千物质样品中的氮和能量含量。对照組动物的试验结果用于校正哏试验祠料的动物的结果。所用方法是McNab和Blair(1988)的方法做适当调节。此文中给出了分析和计算方法的描述。根据实施例6.2的方法还測定了干物质的休外消化率。试验处理如下I玉米基础饲料(见表2)I玉米基础饲料+10%玉米WIS皿玉米基础饲料+20%玉米WISW玉米基础饲料+20^玉米WIS+100mg/kgAXDAV玉米基础饲料+20%玉米WlS+45mg/kg粗酶VI玉米基础饲料+20%玉米WlS+90mg/kg粗酶VE玉米基础饲料+20^玉米WlS+200mg/kg内木聚糖酶。基础祠料的组成见表2。表2:实验中基础饲料的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>*每千克伺料中的维生物/矿物质预混物中含核黄素4mg，烟酸40mg，d—泛酸12mg，胆碱一氯化物500mg，维生素B1215ng，维生素E，15mg，维生素K35mg，視黄基L酸3.44mg，胆钙化醇50pg，生物素0.lmg，叶酸0.75mg，FeS047H20300mg，Mn02100mg，CuS045H2〇10。mg，ZnS047H2〇150mg，Na2Se030.15mg，抗氧化剂lOOmg和佛吉尼亚霉素20mg。试验结果(氮校正的实标可代射能量TMEn)和休外分析的结果)见表3。表3:实标可代谢能量(氮量校正，TMEn)和千物质体外消化率。<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>*)残余才示准误差0.42LSD(5%):0.76根据LSD—检验，用不同字母标出的TMEn值有显著性差异，(p<0.05)。随着玉米一WIS的增加，TMEn水平显著下降。所有酶制品都提高了TMEn—值，只是内木聚糖酶(+7.0%)和AXDA(+10.7%)的提高有显著性。根据平均值，AXDA将能量值提高到加10%玉米WIS的基础铜料的水平。在体外模型中(模仿小鸡中消化过程)，AXDA大大提高了千物质的消化率(+24.5%)。此模型中的内木聚糖酶和粗酶制品不如AXDA有效。实施例8:AXDA用于烤面包用模制面包在P叩loaf烤制试验中測试AXDA。用150g生面团烤puploaf面包。生面团经混合200g面粉(Robijn""/Columbus""80/20)，104ml水，1.4g干烤制酵母(Fermipan"")，4g盐，3g糖，400mgCaCl22H2〇，3mg(15ppm)抗坏血酸和5mg(25ppm)真菌a一淀粉酶(Fermizyme加P200)和25卩g纯化的AXDA制成。在绞式和面机中以52卬m转速混合6分钟15秒，切分生面团，30"C发45分钟，用力按揉，再发25分钟，放入模子中。最后在30"C再发70分钟后，在225。C烤20分钟。用油菜子置换法测面包的体积。面包体积因为含有AXDA由490ml(对照)增加到535ml，即增加了9%。参考文献Amons,R.(1987),FEBSlett.,212:68-72.Carre,B.andBrillouetJ.M.(1986〉，J.SpienceandFoodAg:ric.37:341-351.Chesson,A.(1987),RecentAdvancesinAnimalFoodNutrition.Goosen,—T.et.(IL387)Curr.Genet.11:499-503.Hanahsn,D.(1983)J.Mol.Biol.1S6:557.Harmsen,J.A.M.eta_l.,(1990)Curr.Genet.18:161-16SHaresign,W.andColeD.J.A.,eds.Butterworth,London,71-89.Jerpseth,B.,etal(1992),Strategies5:81-83ManiatisT.,E.F.Fritsch,J.Sambrook(1982):Molecularcloning,alaboratorymanual;ColdSpringHarborLaboratory,NewYork.Matsudaira,P.(1987),J.Biol.Chem.,262:10035-10038.McCleary,B.V,andMatheson,N.K.(1986),Adv.Carb.Chem.andBiochem.44:147-276.47McNab,J.M.andBlairJ.C.(1988),BritishPoultryScience2S:697-707.Murray,N.(1977),Mol.Gen.Genet.150:S3-58SaikiR.K.et.(1988),Science,239,487-491Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.(1389).In:MolecularClonincr:aLabatorvManual,2ndedn.,ColdSpringHarborLabatoryPress,NY.Sanger,F.,Nickelen,S.andCoulson,A.R.(1S77),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol,74:5463-54S7Silvay,T.J.,Berman,M丄.，andEriquist,Ii.W.(1984)Experimentswithgenefusions,ColdSpringHarborLabatory:NewYork.pp.xi-xiiShort,J.M.e仁aJ.,(1988)NucleicAcidsRes.IS:7583-7S00.Visniac,W.andSanter,M.(1957),Bact.Rev.21:195-213Yanishjerron,C.etal.(1985)Gene33,103-113序列表(l)一般信息(1)申请人:(A)名字Gist—brocadesB.V.(B)街道-Wateringseweg1(C)城市Delft(D)国别:荷兰(F)邮编(ZIP):2611XT(U)发明名称阿拉伯木聚糖降解酶(iii)序列号8(iv)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBMPC兼容机(C)搡作系统PC—DOS/MS—DOS(D)软件:PatentlnRelease#1.0，版本ttl.25(EPO)(2)SEQIDNO:1的信息(i)序列特点:(A)长度8个氮基酸(B)类型氛基酸(C)拓朴结构:线型(ii)分子类型:肽(iii)假拟无(iv)反义:无(v)片段类型N—末端(vi)最初来源:(A)生物黑色曲霉塔宾变种(B)菌株DS16813Xaa=cys(xi)序列描迷:SEQIDNO:1LysXaaAlaLeuProSerSerTyr(2)SEQIDNO:2的信息(i)序列特征:(A)长度17个氛基酸(B)类型氛基酸(C)拓朴结构:线型(iO分子类型:肽(iii)假拟:无Gii)反义无(V)片段类型内部(vi)最初来源(A)生物黑色曲霉塔宾变种(B)菌抹DS16813(ix)特点(A)名字/关键词氮基酸残基(B)位置14(D)其他信息Arg或Asn(ix)特点(A)名字/关键词氬基酸残基(B)位置15(D)其他信息残基=未确定(ix)特点:(A)名字/关键词氬基酸残基(B)位置16(D)其他信息残基=未确定(ix)特点(A)名字/关键词氨基酸残基(B)位置17(D)其他信息残基=未确定(xi)序列描述:SEQIDNO:2lieValGluAlaHeGlySerThrGlyHisArgTyrPheXaaSerPhe(2)SEQIDNO:3的信息(i)序列特点(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓朴结构线型(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)假拟:无(iii)反义无(iv)最初来源(A)生物，f、色曲霉塔宾变种51(B)菌抹DS16813(xi)序列描述:SEQIDNO:3ATGATKGTIGARGCIATKGG(2)SEQIDNO:4的信息(1)序列特点(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓朴结构线型(ii)分子类型DNA(基因組的)(iii)假拟:无(iii)反义-无(iv)最初来源(A)生物黑色曲霉塔宾变种(B)菌珠DS16813(xi)序列描述:SEQIDNO:4AATACGACTCACTATAG(2)SEQIDNO:5的信息(i)序列特点(A)长度2101个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓朴结构:线型(ii)分子类型DNA(基因組的)(iii)假拟:无(iii)反义无(vi)最初来源(A)生物黑色曲霉(B)菌株CBS120.49(ix)特点(A)名字/关键词TATA—信号(B)位置665..670(ix)特点(A)名字/关键词CDS(B)位置784..1779(D)其他信息/产物="阿拉伯木聚糖降解酉每"/基因-"axdA"标准一名称="阿拉伯木聚糖降解酶"(ix)特点(A)名字/关键词Sig—肽(B)位置784..861(ix)特点(A)名字/关键mat—肽(B)位置862..1779(xi)序列描述:SEQIDNO:5C丁GATTGGGATTCTGCAGGAATTCTCTGGGGTATGCCAAAAAAGTATACCGACC丁GTAAA60AGTCCAACCAGTTCGAAA丁TACTAACAATATGTTTT丁GATCAGGATATCTTTGGCATCTATGG丁GAGAGCCATATCATCATCTCT丁CTTCCGGCAGC丁GTCAACTGCCTGCCGAAAGTAC180TGGAAGCCATTG丁GTTT丁AAGGTGAAACAAGA丁CAGGGCGGCTATGTGTCAGGGTAGAAC240CAGTTTGCTTAGCGCCATCAGGGTCCACGTCTAGACTTTCGATGCCCGGAGTTATTCGCC300TTCCCACAGCAGTCATTTCCCCGAATCTAAACCGATGGACGGATATTGTGGTGTAATGAT360AGAACAACACGGTGTAGTGTAGTTTTAAGTGCCGTGCTAGACACGGCAACGTTCCGGTGG420GCGATTGT丁TCTGGCTAATGTAC丁CCGTAGTT了AGGCAACAGGCCGA丁CATCl"TCCCCCA480TAGGAAAGGACCCTGAATAGTGCGTCAAAAAGAGCTTGAGGCAAAGGAGGAC丁GCACTTT540CCAAGGCCGAAGTGGGGGGGGGGGATAACCAAGO^GCCCAACTTTTATCCGAAACC丁TTC600AGGTGTCATCTAATTTGGATAAATCCGGATTGTTCTTCGGCATATGTGGATGTCACCATGSSOAGCCATAAATACAAATATCTGGACAAGCTGTTGCCCTTTGTTCAAGT丁ATTCGTTCTCTG720TGGACCACGATCCCAACCATTGATCTCT"TT丁GTTTG丁TCCTCAGCGGATAAAGTCATACG780AAAATGAAATTCCTCAAAGCCAAGGGTAGCTTGCTGTCGTCTGGCATA828MetLiysPheLeuLysAlaLysGlySerLeuLeuSerSerGly工le_25-20-ISTACCTCATTGCATTGGCCCCCTTTGTCAACGCAAAATGCGCTCTTCCG87STyrLeu工leAlaLeuAlaProPheValAsnAlaLysCysAlaL^uPro-10-515TCGACATATAGTTGGACTTCGACCGATGCTCTTCGCCACCCCAAAGTCC324SerThrTyrSerTitdThrSerThrAspAlaLeuAlaThrProLysSerlb1520GGATGGACTGCACTCAAGGACTTCACCGATGTCGTCTCTAACGGCAAA372GlyTrpThrAlaLeuLvsAs。PheThrAspValValSerAsnGlyLys25—_3035CATATTGTCTATGCGTCCACTACCGACACACAGGGAAATTACGGCTCCH丄s工leValTyrAlaSerThr丁hrAspThrGinGlyAsnTyrGlySer4045501020ATGGGCTTTGGCGCCTTTTCGGACTGGTCGGACATGGCATCCGCTAGTMetGlyPheGlyAlaPheSerAspTrpSerAspMetAlaSerAlaSer5SSOS51068CAAACGGCCACAAGCTTCAGCGCCGTAGCTCCAACCTTGTTCTACTTCGinThrAlaThrSerPheSerAlaValAlaProTtirL*euPheTyrPhe707580851116CAGCCAAAGAGTATCTGGGTTCTGGCCTACCAATCGGGCTCCAGCACTGinProLysSerlieTrpValLeuAlaTyrGinTrpGlySerSerThr303510011"TTCACCTACCGCACCTCT-CAACjATCCCACCAATGTCAACGGCTGGTCAPheThrTyrArgThrSerGinAsdProThrAsnValAsnGlyTrpSer105110IISTCCGAGCAAGCTCTT丁TCACGGGCAAAATCAGCGGCTCAAGTACCGG丁SerGluGinAlaLeuPheThrGlyLys工leSerGlySerSerThrGly120125130GCCATTGATCAGACTGTGATTGGTGATGATACGAATATGTATCTTTTCAla工leAspGinThrVallieGlyAspAspTtirAsnMetTyrLeuPhe13S140145TTTGCCGGCGACAATGGCAAGATCTACCGATCCAGCATGTCTA"TCAATPheAlaGlyAspAsnGlyLys工leTyrArgSerSerMe仁SerlieAsn150155ISO1"GACTTCCCCGGAAGCTTCGGCAGCCAGTACGAGGAGATCCTCAGCGGCAspPheProGlySerPheGlySerGinTyrGluGlulieLeuSerGly170175180GCGACCAACGATTTGTTCGAGGCGGTCCAAGTG丁ACACCGTCGACGGCAlaThrAsnAspLeuPheGluAlaValGinValTyrThrValAspGly185190195GGCGAGGGTGACAGCAAGTACCTCATGATCGTCGlyGluGlyAspSerLysTyrLeuMetlieVal200205ACCGGACATCGTTATTTCCGCTCCTTCACGGCCThrGlyHisArgTyrPheArgSerPheThrAla215220GAGTGGACAGCCCAGGCGGCAAGTGAAGATCAAGluTrpThrMaGinMaAlaSerGluAspGin230235240GCCAACAGTGGCGCCACCTGGACCGACGACATCAlaAsiaSerGlyAlaThrTrpThrAspAsplie250255GTTCGCAACAACCCTGATCAAACCValArgAsnAsnProAspGinThrCAGCTTCTCTACCAGGGCCATGACGinLeuLeuTyrGinGlyHisAsp2S02"CTCTTGCCCTGGAAGCCAGGAGTTLeuLeuProTrpLysProGlyVal295300ATGACGGTCMetThrVal270CCCAACAGCProAsnSerCTTACCTTGlieuThrLeuATCATTTGGTTGCAGACCGGGGTTTTCTTCCCCTTCCTTGACAGCGGGATGGGGAGTGAATACTATCTTGGGCTCAATTGGTCTACATAGGCTACATGCGAATGATTTGGTTTATTCACATAGTATACACCTCTGTATTCACAGGTGATAGCCTGTCTACGAGATGACTGCACGTGATGATCACATCATCATCATCGCAGGACACACACATAGAGGCGATCGGTTCCGluAla工leGlySer210AGCAGTCTCGGCGGASerSerLieuGlyGlyCCCTTCGCGGGCAAAProPheAlaGlyLys245AGTCATGGTGACTTGSerHisGlyAspLeuGATCCTTGCAACCTCAspProCysAsnLeu275AATAGTGACTACAACAsnSerAspTyrAsnAAGCAG丁GAAAGGCT丁LysGin305AGTAGTATTGTTGGTGGAAGAGGTGGAATCC丁GTCAGACTAATAGTATTAACAGATAGTGTAGTAGTAGAGATGTGGCTCTCGCTCACGCGACAGTCTCA12121308135614041452-150015481SS2174017891843190920292083210155<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>AlaGlyPheProThrGluGly215TrpThrAsnSsrAspAsnGlyGly200HisSer170Gly155PheAsp185AspArgAlaGlyLeuPheSerTyrGinAla250LysPheAla23SThrArgAsnAsnPro2S5LeuLeu2S5AspTyrGinGlyProTrpLysProLeu280LyslieTyrArgSerGlySerGinTyrGlu175GluAlaValGinValISOTyrLeuMet工leVal205ArgSerPheThxAla220AlaSerGluAspGin240TrpThrAspAs。工le*25_5GinThrMetThrVal270HisAspProAsnSer285GlyValLeuThrLeu300SerMetSer工leGlu工leLeuTyrThrGluAla210SerSer225Val工leLeuProPheAlaSer180AspGlyGlyGlyAsn1S5GlyGlyLysGin305AspAlaGlySerThrGlyLys245Glu230AlaSerHisGlyAspLeuVal2S0AspProCysAsnLeuGin275AspTyrAsnLeu57(2)SEQIDNO:7的情况(i)序列特征(A)长度2859个碱基对(B)类型核酸(C)链:单链(D)括朴结枸:线型(ii)分子类型DNA(基因組的)(iii)假拟:无(iii)反义无(vi)最初来源(A)生物黑色曲霉塔宾变种(B)菌种DS16813(bc)特点:(A)名字/关键词CAAT—信号(ix)特点(A)名字/关键词TATA—信号(B)位置713..720(ix)特点.(A)名字/关键词CDS(B)位置823..1818(D)其他信息/产物="阿拉伯木聚糖降解酶"/基因-"axdA"/标准名称="阿拉伯木聚糖降解酶"Gx)特点(A)名字/关键词Sig—肽(B)位置:823..901(ix)特点(A)名字/关键词mat—肽(B)位置:901..1818(xi)序列描述:SEQIDNO:7CATACTGGG丁GTGGTACTGTAGGGA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Gly215220225TrpThrAlaGinA工aAlaSerGluAspGinProPheAlaGly235240Cys275AsnSer.GlyAlaThrTrpThrGluAsplieSerH丄sGly250255ArgAsnAsnProAspGinThrMetThrValAspPro2S5*"270LeuLeuTyrGinGlyHisAspProAsnSerSerGlyAsp280285230LeuProTrpLysProGlyValLeuThrLeuLysGin2S5_300305AspGlyGlySerThrGlyGluLysAla245LeuValLeuGinTyrAsnLeu权利要求1.基本纯的多肽，其具有阿拉伯木聚糖降解活性，所述多肽包含a)SEQIDNO6中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；b)SEQIDNO8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；c)氨基酸序列，其是SEQIDNO6或SEQIDNO8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列的部分，并且所述部分保持阿拉伯木聚糖降解活性；d)SEQIDNO5或SEQIDNO7的等位变体编码的氨基酸序列；或e)氨基酸序列，其由下述核苷酸序列编码，所述核苷酸序列在下述杂交条件下与SEQIDNO5中核苷酸784-1779或SEQIDNO7中核苷酸823-1818所代表的DNA片段或其互补片段杂交，所述杂交条件包括在5xSSC/0.1％SDS中于65℃第一次洗30分钟，接着在2xSSC/0.1％SDS中于65℃第二次洗30分钟，接着在0.1xSSC/0.1％SDS中于65℃第三次洗30分钟，接着在0.1xSSC中于65℃第四次洗30分钟。2.根据权利要求l的多肽，其包含a)SEQIDNO:6中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；b)SEQIDNO:8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；c)氨基酸序列，其是SEQIDNO:6或SEQIDNO:8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列的部分，并且所述部分保持阿拉伯木聚糖降解活性；或d)SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的等位变体编码的氨基酸序列。3.根据权利要求2的多肽，其包含a)SEQIDNO:6中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；b)SEQIDNO:8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；或c)氨基酸序列，其是SEQIDNO:6或SEQIDNO:8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列的部分，并且所述部分保持阿拉伯木聚糖降解活性。4.根据权利要求3的多肽，其包含a)SEQIDNO:6中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；或b)SEQIDNO:8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列。5.包含根据权利要求1的多肽的食品。6.包含根据权利要求1的多肽的饲料组合物。7.包含根据权利要求1的多肽的饮饲料组合物。8.包含根据权利要求1的多肽的纸浆加工组合物。9.被固定的根据权利要求1的多肽。全文摘要本发明提供了在选择的微生物宿主细胞中克隆和过量表达真菌来源的阿拉伯木聚糖降解酶的方法和表达构建物。该酶对从玉米中获得的水不溶固体物表现出降解活性。该酶可以用于动物饲料组分、人类食物制备和工业加工中。文档编号C12N1/00GK101525605SQ200810134919公开日2009年9月9日申请日期1995年8月28日优先权日1994年8月26日发明者A·J·J·万奥詹,J·威瑟尔,L·H·德格拉夫,M·J·A·万德伍,M·M·C·吉尔肯斯申请人:吉斯特-布罗卡迪斯股份有限公司