专利名称：一种透明质酸酶表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种兽疫链球菌透明质酸酶表达载体及其应用，特别是涉及一种兽疫链球菌 透明质酸酶表达载体及导入该载体的重组大肠杆菌细胞和利用该重组细胞生产兽疫链球菌透 明质酸酶的方法以及利用该透明质酸酶降解透明质酸(又称为玻璃酸，hyaluronic acid，以下 简称HA)制备HA寡糖的方法。
背景技术：
(1) HA寡糖生产研究现状
HA是一种由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖构成的双糖单位重复连接形成的酸性黏多糖， 广泛存在于动物的组织细胞间质和某些细菌的夹膜中。国内外己经对HA的分布、化学结构、 理化性质以及应用进行了广泛而深入的研究，其在医药、化妆品、食品等领域有广泛而独特 的应用价值。目前所用的HA的平均相对分子质量一般都大于106。HA寡糖(oligosaccharides of hyaluronan，简称o-HA)是相对分子质量〈10 000、单糖残基数量为2 40(—般为4 16)的HA 分子片段。o-HA属于小分子多糖，其性质与普通HA有很大不同，具有促血管生成、促进 创伤愈合、抗肿瘤及免疫调节等生物活性。
o-HA的制备方法有化学降解、酶解和生物合成法。化学降解方法中无论是酸水解、碱水 解还是氧化降解都能破坏HA分子结构，将HA降解成寡糖需要较剧烈的反应条件，如较 高的酸、碱浓度等，才能达到高的降解程度。因此不但糖链上的糖苷键断裂，而且葡糖醛酸 和N-乙酰氨基葡糖的结构也可能遭到破坏，如乙酰基被水解掉、单糖六元环断裂等。De Angelis (Deangelis PL， Oatman， Gay D F. Rapid chemoenzymatic synthesis of monedisperse hvaJuronan oligosaccharides with immobilized enzyme reactors[J]. J Biol Chem， 2003， 278(37): 35199-35203)等利用巴氏杆菌HA合成酶(pmHAS)、葡糖醛酸转移酶和N-乙酰氨基葡糖转 移酶合成2 20寡糖，此反应为生物合成反应，反应需要严格的反应条件，并且需要多种反 应酶，成本较高。目前研究o-HA常用酶解制备，与化学降解相比，酶降解反应条件温和， 降解速度快，较适于制备o-HA。目前市场上的透明质酸酶(hyaluronidase)主要是从动物组 织中提取出来的，成分较复杂，含有较多杂蛋白，易对病人产生免疫反应。用细菌表达透明 质酸酶具有分离纯化简单、成本低的优点，是制备o-HA的一种安全、简便、高效的方法。
(2) 透明质酸酶研究现状 透明质酸酶是对催化降解透明质酸的酶的通称。人们在蛇毒、蜂毒、蝎毒以及蜘蛛等的
毒液中都检测到了透明质酸酶。同时，在人体组织及体液中也广泛存在透明质酸酶。而一些 细菌、真菌以及非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物等也产生透明质酸酶。
根据作用机制的不同，透明质酸酶可以分为三类(a)内切-P-N-乙酰氨基葡糖苷酶(EC 3.2丄35)，为水解酶，作用于(3-1,4糖苷键，终产物主要为四糖，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，并有转糖苷酶活性。哺乳动物来源的以及动物毒液来源的属于此类。研究最多的是 睾丸、蜂毒以及溶酶体透明质酸酶。(b)水蛭、十二指肠虫来源的透明质酸酶，为内切-P-葡 糖苷酸酶(EC3,2丄36)，作用于卩-l,3糖苷键，也是水解酶，主要降解产物是四糖，特异性 降解HA。 (c)细菌透明质酸酶(EC 4.2.2.1)，也称为透明质酸裂解酶(hyaluronate lyase)， 作用于(3-1,4糖苷键，通过(3-消去机制得到4，5-不饱和双糖。
完整的细菌透明质酸酶包含四个结构域N末端的糖结合域，间隔域，催化反应域，最 后是C末端的调节域，两个末端结构域与相邻结构域间由一段连接多肽相连(Rigden D J, Littlejohn J E, Joshi H V, " a/. Alternate structural conformations of 5^eptococciw / we腦ow/ae hyaluronan lyase: insights into enzyme flexibility and underlying molecular mechanism of action[J]. /Mo/5/o/， 2006, 358(4): 1165-78)。稳定状态的酶由C末端的两个结构域构成，其中催化反应 域由a-螺旋结构构成， 一般称为cx-结构域，而C末端调节域由P-片层结构构成， 一般称为(3-结 构域。
oi-结构域有一个带正电核的疏水性的裂口 (cleft)横贯其中，带负电荷的疏水性的底物 HA即在此裂口中被结合、降解。催化裂口只能容纳三个双糖结构进入。酶的活性中心位于 裂口中间最窄处，由Asn349、 His399以及Tyr408 (S.户"w附o刚'ae透明质酸酶氨基酸序列号) 三个残基组成。(3-结构域的作用类似一扇门，调节底物(HA/Ch/Chs)到达催化部位。完整长 度的酶在N末端还包括两个结构域，均为卩-片层结构。第一个很明显是个糖结合域，大概是 加强细菌透明质酸酶与底物间的亲和力的。第二个结构域比较小，作为间隔域将a-结构域与 N末端糖结合域隔开。
基于酶的晶体结构以及酶与HA寡糖复合体晶体结构的研究，HA结合和降解的机制称为 质子方但受(Proton acceptance and donation, PAD) (Li S, Kelly S J, Lamani E, W a/. Structural basis of hyaluronan degradation by / we麵o由e hyaluronate lyase [J] ￡>n6o /， 2000,
19(6): 1228-40)，并且表明是以(3-消去方式进行性(processive)降解HA (Jedrzejas M J, Mello L V, de Groot B L, W a/. Mechanism of hyaluronan degradation by浙印tococtm /we,簡'c e hyaluronate lyase. Structures of complexes with the substrate[J]. / S/o/ CT ew, 2002, 277(31):28287-97)。最初，透明质酸酶可能随机地与HA的某个部位结合，将其切为两段， 其中含有不饱和双键的片段(即含有原HA还原端的片段)离开酶的活性中心，而含有原HA 非还原端的片段留在催化裂口中，并移动一个双糖单位，继续进行下一轮降解。这样，每次 在还原端产生一个不饱和双糖并离开，留下的非还原端片段移动一个双糖单位再继续降解， 直到整个片段被完全降解。
进行性降解机制最初是由Pritchard通过对HA降解产物的分析提出的(Pritchard D G， Lin B, Willingham T R, a/. Characterization of the group B streptococcal hyaluronate lyase[J]. Jrc// S/oc&附Aop/z>^, 1994，315(2):431-7)，并且如上所述，得到了酶结构研究的证实。但是关于 降解方向，文献中出现了不同的结论。对酶与底物复合物结构的研究表明，降解是从HA链的还原端向非还原端进行，而Baker和Pritchard通过分析降解产物，认为降解是从非还原端 向还原端进行(Baker J R, Pritchard D G. Action pattern and substrate specificity of the hyaluronan lyase from group B streptococcic]. 2000, 348(Pt 2):465-71)。
(3)大肠杆菌表达系统研究现状
目前利用大肠杆菌表达蛋白的技术已经比较成熟。相对于真核表达系统而言，大肠杆菌
表达系统有以下优势对大肠杆菌的遗传背景和生理特性研究已相当彻底,可以根据不同的载
体而选择不同的菌种；繁殖能力强，20 30min即可繁殖一代，大规模发酵成本低，具有巨 大的生产潜力；表达水平一般较真核系统高，表达量可达总蛋白的5% 30%，且下游工艺 简单、易于控制。
发明内容
本发明的目的是提供一种兽疫链球菌透明质酸酶表达载体，这种表达载体是含有兽疫链 球菌透明质酸酶基因(&/)的大肠杆菌表达载体。
其中所述兽疫链球菌透明质酸酶基因编码具有序列表中的氨基酸残基序列；序列表中的 氨基酸残基序列由862个氨基酸残基组成。
所述兽疫链球菌透明质酸酶基因具有序列表中的核苷酸序列；或与序列表中核苷酸序列 的5'端168位至2756位碱基限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码序列表中的氨基 酸残基序列的核苷酸序列。序列表中的核苷酸序列由2771个碱基组成，自5'端168位至2756 位碱基为兽疫链球菌透明质酸酶基因序列。
所述大肠杆菌表达载体可为pBV220或pET22b，优选pBV220。将所述兽疫链球菌透明 质酸酶基因插入到pBV220的多克隆位点中构建可以得到兽疫链球菌透明质酸酶表达载体 pBV220勿l。
将上述兽疫链球菌透明质酸酶表达载体导入大肠杆菌细胞得到的重组细胞也属于本发明 的保护范围。
所述大肠杆菌细胞可为大肠杆菌DH5a、 JM109或BL21 。
可用电转法或42°C热激法将上述兽疫链球菌透明质酸酶表达载体导入所述大肠杆菌细胞。
本发明的另一个目的是提供一种表达兽疫链球菌透明质酸酶的方法以及该透明质酸酶在 降解HA、制备HA寡糖中的应用
本发明表达兽疫链球菌透明质酸酶的方法，包括培养上述重组大肠杆菌细胞，温控或IPTG 诱导表达兽疫链球菌透明质酸酶的歩骤。
上述表达兽疫链球菌透明质酸酶的方法中，还包括包含体分离，蛋白质变性，凝胶层析 纯化，柱中复性或透析复性的歩骤。所述凝胶层析可为葡聚糖G25凝胶柱层析。
本发明表达兽疫链球菌透明质酸酶的具体方法如下(1) 菌种培养将单个新鲜大肠杆菌菌落接种于LB/Ampicillin培养液中，30°C振摇，培 养过夜。次日接种于较大体积培养液。继续培养至OD600约为0.5-0.6;
(2) 温度诱导将温度迅速调至42。C，继续振摇培养4小时；
(3) 表达产物纯化，离心收集细胞，超声波破碎细胞，包含体分离，蛋白质变性，凝胶层 析纯化，柱中复性或透析复性。
本发明所得到的透明质酸酶可用于降解透明质酸生产或制备透明质酸寡糖。 本发明的兽疫链球菌透明质酸酶基因表达载体构建容易，表达方法简单，只需调整培养 温度或添加少量IPTG即可实现大量稳定的表达。表达蛋白的分离纯化过程简单，制备的透 明质酸酶可以迅速的将大分子量的透明质酸降解成透明质酸寡糖，使生产成本大大降低，本 发明具有重要的实际应用价值。
图1:兽疫链球菌透明质酸酶大肠杆菌表达载体pBV220-hyl构建过程示意图。 图2:本发明表达纯化的兽疫链球菌透明质酸酶HYL的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。 图3:透明质酸酶HYL降解HA的所得HA寡糖的HPLC分析图。 图4:透明质酸酶HYL降解HA的所得HA寡糖的质谱分析图
具体实施例方式
实施例仅是为了更好的说明本发明，而绝不是限制本发明。
实施例中所用方法若无特别说明均为常规方法，所用酶试剂均为TaKaRa公司产品。 实施例一重组透明质酸酶HYL的制备 1、编码兽疫链球菌透明质酸酶HYL基因的克隆
A. 引物设计与合成
根据5^eptococc^ aga/""/ae禾口 5^eptococc^ joyogew^ HA裂解酶的氨基酸序歹U以及 5^印tococc^ ^w/基因组，设计并合成两个引物，其序列如下 HYL1-F [5'-CGGGATCCATTTAGAGGCTGTGTGCACC-3'] HYU-R [5'-ATACTGCAG AATGTGCTTGAATGGCTATG -3']
B. PCR反应
94。C变性5min; 94°C变性lmin， 58°C退火lmin， 72°C延伸5min， 30个循环；72°C 延伸10min， 4。C保温。
C. 测序
将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到了长度约为2700bp的DNA扩增片 段，经测序，表明该DNA扩增片段具有序列表中的核苷酸序列。其中包括-10和-35序列， 以及核糖体结合位点(RBS)。2、 兽疫链球菌透明质酸酶HYL大肠杆菌表达载体的构建
A. 引物设计与合成
HYL2-F 「5 ，-ATAGAATTCTTGTGGCTTCGATGGCAA-3 ，1 HYL2陽R [5，- TAAGGATCCGCTTGAATGGCTTGATAAG-3 ，1 上引含有￡COR I酶切位点，下引含有5cwzHI酶切位点
B. PCR反应 反应条件同l.B。
C. 表达载体的构建
将PCR扩增的DNA片段用￡coR I和5awHI酶切后，与经相同酶切的质粒载体pBV220 用T4DNA连接酶连接，将连接产物用电转法或42°C热激法转化大肠杆菌DH5a，用含有 100ug/L氨苄青霉素的抗性LB培养基进行筛选，将阳性克隆接种于LB培养基中37°C培养 12-24小时，提取质粒，得到重组表达载体pBV220-hyl。
3、 兽疫链球菌透明质酸酶HYL的表达与纯化
A、 菌种培养与温度诱导
将单个新鲜菌落接种于含200ug/ml Ampicillin (氨苄青霉素)的LB培养液中，30°C振 摇，培养过夜。次日以2%接种量接种于较大体积培养液。30°C继续培养至OD600约为 0.5~0.6，将温度迅速调至42。C，继续振摇培养4小时，离心收集细胞。
B、 透明质酸酶HYL的分离纯化
将42°C诱导后的菌液离心收集菌体，用0.2M的乙酸缓冲液(pH 6.0)洗涤两次，再重 悬于该缓冲液中，超声波破碎菌体，离心收集上清，即得到粗酶液。沉淀即为包含体，溶于 缓冲液A (8 M urea, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 0.5%--mercaptoethanol)，离心收集上 清，将上清上样于G 25凝胶柱，流速9 cm/h，柱子用缓冲液B平衡(2M urea, 50mM NaCl, and 50mM Tris-HCl, pH 8.0)并洗脱。收集的组分用缓冲液C(2Murea, 50mMNaCl， 50mM Tris-HCl, pH 8.0, and ImM glutathione (O.lmM glutathione oxidized and 0.9mM glutathione reduced))复性。
所得的透明质酸酶的聚丙烯酰胺电泳图见图2 (泳道1为含有pBV220的大肠杆菌表达蛋 白样品，泳道2是含有pBV220-hyl的大肠杆菌表达蛋白样品，泳道3是纯化后的蛋白样品， 泳道M是蛋白Maker)。由图2可以看出，经纯化后得到了高纯度的透明质酸酶。
实施例二 HA寡糖的制备
将实施例一所得透明质酸酶的酶液与HA溶液混合，于37°C反应2小时。煮沸20min， 过滤。将滤液用旋转蒸发仪浓縮，取2ml上样于Bio gel-P6柱(95 cmxl.5 cm)，以NH4HC03 (0.5mol/L)为流动相，流速12ml/h。每管收集2ral。将含糖的组分用旋转蒸发仪浓縮，再冷冻 干燥，即得HA寡糖。所的HA寡糖的成分分析图(HPLC和质谱图)见图3和图4。由图3 和图4可以看出得到了高纯度的HA二糖，该糖分子量为379，含有一个不饱和双键。通过 控制降解时间，可以得到不同二糖单位的HA寡糖。
7序列表
3 att tag agg ctg tgt gca cca aac cgt tgc cat caa tec aga caa 47
48 gca gta ttt get gac ctt tga cat tga gac aaa gga taa aac agg 92
-35
93 tea ggc ttt tgc gcg tat cat tga aga aat aaa gca agg ttc tgg 137
-IO
138 tgc tgc aaa aga gca acg ctt gtg get teg atg gca aca gga act 182
RBS Met Ala Thr Gly Thr 59
183 gag aaa aaa cac caa gaa aag ctt tat ate cct aag eta aag gtt 227
60 Glu Lys Lys His Gin Glu Lys Leu Tyr lie Pro Lys Leu l>ys Val 74
228 aat c犯ate aag eta gag etc ttt tat gag gcc ggt cat gga cag 272
75 Asn G〗n lie Lys Leu Glu Leu Phe Tyr Glu Ala Gly His Gly Gin 89
273 gtg gtc ttt gat aac ctt tct ttg aga gag get ggt gat aag cca 317
90 Val Val Phe Asp Asn Leu Ser Leu Arg Glu Ala Gly Asp Lys Pro 104
318 agt gat gac ate aag att get tea cat tac tta gag gag caa ate 362
105 Ser Asp Asp lie Lys lie Ala Scr His Tyr Leu Glu Glu Gin lie 119
363 gtc ctg cct tta aat aag cac tac etc atg gaa atg get gac tat 407
120 Val Leu Pro Leu Asn Lys His Tyr Leu Met Glu Met Ala Asp Tyr 134
408 cat tat cag att gca gcg gag tec age aac att gtg cgc gtg明a 452
135 His Tyr Gin Tie Ala Ala Glu Ser Ser Asn lie Val Arg Val Glu 149
453 犯t ggt ctt tta att cct ttg gcg cag ggg aaa acg ctt tta gag 497
150 Asn Gly Leu Leu lie Pro Leu Ala Gin Gly Lys Thr Leu Leu Glu 164
498 gtg ttg gat caa gag ggg caa aga gta gca acg gta cca gtt gag 542
丄65 Val Leu Asp Gin Glu Gly Gin Arg Val Ala Thr Val Pro Val Glu 179
543 att tta gca gca gaa gcc cct caa aca acc tec ttg ate aca aag 587
180 lie Leu Ala Ala Glu Ala Pro Gin Thr Thr Ser Leu lie Thr Lys 194
588 tgg tgt gag gtg att ttg gga gca gaa aac ttt gsc cga tea sgt 632
195 Trp Cys Glu Val lie Leu Gly Ala Glu Asn Phe Asp Arg Ser Ser 209
633 cca gcc atg gtg gca tta aac caa aaa ctg gac gac age gtg acc 677
210 Pro Ala Met Val Ala Leu Asn Gin Lys Leu Asp Asp Ser Val Thr 224678 aag aat cta get gat ctg acc aag gat cag a犯age aca tac ctt 722
225 Lys Asn Leu Ala Asp Leu Thr Lys Asp Gin Lys Ser Thr Tyr Leu 239
723 tgg agt gat ttg gcg gat ctt cat caa teg tct cat atg aca get 767
240 Trp Ser Asp Leu Ala Asp Leu His Gin Ser Ser His Met Thr Ala 254
768 acc tgt agg cgt tta gag gaa atg gcc aag cag gtg agt age eta 812
255 Thr Cys Arg Arg Leu Glu Glu Met Ala Lys Gin Val Ser Ser Leu 269
813 gcc tct agg tat tat cag gat aag gag ctg ata aga ctg ate aag 857
270 Ala Ser Arg Tyr Tyr Gin Asp Lys Glu Leu lie Arg Leu lie Lys 284
858 gat aaa tta gcc tgg ctg aca ctt aat tac tat cat ccg caa aag 902
285 Asp Lys Leu Ala Trp Leu Thr Leu Asn Tyr Tyr His Pro Gin Lys 299
903 gat att gaa ggc a^g get aat tgg tgg gat ttt gaa att ggt acc 947
300 Asp lie Glu Gly Lys Ala Asn Trp Trp Asp Phe Glu lie Gly Thr 314
948 cca aga get att gtc aat acc eta gcc ttc att tac cct tat gtc 992
315 Pro Arg Ala lie Val Asn Thr Leu Ala Phe lie Tyr Pro Tyr Val 329
993 act caa gag gag ate aag cgc tat act aaa gga att tct cac ttt 1037
330 Thr Gin Glu Glu lie Lys Arg Tyr Thr Lys Gly lie Ser His Phe 344
1038 gtt cct aat cct aga caa ttt cgc tta acc ctt gtg aat cct ttt 1082
345 Val Pro Asn Pro Arg Gin Phe Arg Leu Thr Leu Val Asn Pro Phe 359
1083 aag gcc att ggg ggt aac ctt gtt gat atg gga cga gtg aag att 1127
360 Lys Ala lie Gly Gly Asn Leu Val Asp Met Gly Arg Val Lys lie 374
1128 att gaa get ctg tta aag cat gat aag aaa gcg ctt caa gac agt 1172
375 lie Glu Ala Leu Leu Lys His Asp Lys Lys Ala Leu Gin Asp Ser 389
1173 ata gca gcc eta gat acc tta ttt get ttt cag cca犯g gga tea 1217
390 lie Ala Ala Leu Asp Thr Leu Phe Ala Phe Gin Pro Lys Gly Ser 404
1218 agg ggt gag ggc ttt tat gaa gat ggc tct tat att gac cat acc 1262
405 Arg Gly Glu Gly Phe Tyr Glu Asp Gly Ser Tyr lie Asp His Thr 419
1263 aat gtc gcc tac act gga gcc tat ggc aat gtc ctt att gat ggc 1307
420 Asn Val Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Gly Asn Val Leu lie Asp Gly 434
1308 ttg tct cag ctg gta cca tta ctt cag eta tta get act age eta 1352
435 Leu Ser Gin Leu Val Pro Leu Leu Gin Leu Leu Ala Thr Ser Leu 449
91353 gac cag caa aag cta gag gtc atg act cat tgg a_tt gag caa gcc 1397
450 Asp Gin Gin Lys Leu Glu Val Met Thr His Trp lie Glu Gin Ala 464
1398 ttc ttg ccc ttg atg gtt cat ggg gag etc atg gat atg agt cgt 1442
465 Phe Leu Pro Leu Met Val His Gly Glu Leu Met Asp Met Ser Arg 479
1443 ggg cgc tec ate agt cgt gaa aat gcc tec tea agg cag gca gcc 1487
480 Gly Arg Ser lie Ser Arg Glu Asn Ala Ser Ser Arg Gin Ala Ala 494
1488 tta gaa gca eta aga gga atg eta aga ctg get gag gca ttg cca 1532
495 Leu Glu Ala Leu Arg Gly Met Leu Arg Leu Ala Glu Ala Uu Pro 509
1533 gag caa get aaa ate agg ate aag ggt aag ate aag get gtt ttg 1577
510 Glu Gin Ala Lys lie Arg lie Lys Gly Lys lie Lys Ala Val Leu 524
1578 gcc ttc cat aat cag gag act att tta gag age eta tea age tac 1622
525 Ala Phe His Asn Gin Glu Thr lie Leu Glu Ser Leu Ser Ser Tyr 539
1623 tat gac atg aag eta ttc aaa gag etc ttg gag gat acc aca ate 1667
540 Tyr Asp Met Lys Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Asp Thr Thr lie 554
1668 caa gcc agt cca gtt aag age tac eta tct ctt ttt aac cag atg 1712
555 Gin Ala Ser Pro Val Lys Ser Tyr Leu Ser Leu Phe Asn Gin Met 569
1713 gat aaa ttg gcc tac tac aat gcg gaa aag gat ttt gcc ttt get 1757
570 Asp Lys Leu Ala Tyr Tyr Asn Ala Glu Lys Asp Phe Ala Phe Ala 584
1758 tta tec atg cat tec aac aaa act ctg aat ttt gaa gcc atg aac 1802
585 Leu Ser Met His Ser Asn Lys Thr Leu Asn Phe Glu Ala Met Asn 599
1803 gat gaa aat aca cgt ggt tgg tat aca gga gat ggc atg ttt tac 1847
600 Asp Glu Asn Thr Arg Gly Trp Tyr Thr Gly Asp Gly Met Phe Tyr 614
1848 ctt tat aac agt gat ttg ggt cat tac tea gac cac ttt tgg ccg 1892
615 Leu Tyr Asn Ser Asp Leu Gly His Tyr Ser Asp His Phe Trp Pro 629
1893 act gtt aat cct tta aag atg get gga aca acg gaa gca gag gtc 1937
630 Thr Val Asn Pro Leu Lys Met Ala Gly Thr Thr Glu Ala Glu Val 644
1938 agg cga gag gac gtg aca gta gcc tat tta aaa aag eta acc aat 1982
645 Arg Arg Glu Asp Val Thr Val Ala Tyr Leu Lys Lys Leu Thr Asn 659
1983 gat tat aaa gaa aag gcc aaa gaa a肪gca ggc atg tct acc ctg 2027
660 Asp Tyr Lys Glu Lys Ala Lys Glu Lys Ala Gly Met Ser Thr Leu 674
2028 cca tcg tec ttt gtt gga gcg ate aag gcg gga gac aaa aca get 2072675 Pro Ser Ser Phe Val Gly Ala lie Lys Ala Gly Asp Lys Thr Ala 689
2073 tta get gtt atg gat ttt caa aat tgg gat agg aca gtg agt gcc 2117
690 Leu Ala Val Met Asp Phe Gin Asn Trp Asp Arg Thr Val Ser Ala 704
2118 aag aag tct tgg acg ate tta gat gac caa att gtt ttt ctt ggc 2162
705 Lys Lys Ser Trp Thr lie Leu Asp Asp Gin lie Val Phe Leu Gly 719
2163 acc gcc ate act agt cag aca cat cag gca gtg act act acc att 2207
720 Thr Ala lie Thr Ser Gin Thr His Gin Ala Val Thr Thr Thr lie 734
2208 gat caa cgc aaa gaa aac cca gac aac age tac act ctt ttt ate 2252
735 Asp Gin Arg Lys Glu Asn Pro Asp Asn Ser Tyr Thr Leu Phe lie 749
2253 aat ggg cag gag aca gcg eta aca gag gag ate ctg tat cga gat 2297
750 Asn Gly Gin Glu Thr Ala Leu Thr Glu Glu lie Leu Tyr Arg Asp 764
2298 gat gtg acc agt ctt tta eta ctt tct aaa gac ggt caa get aat 2342
765 Asp Val Thr Ser Leu Leu Leu Leu Ser Lys Asp Gly Gin Ala Asn 779
2343 att ggt tac ctt ttt gcc aag cca acc gca tta gcg eta tcg cga 2387
780 lie Gly Tyr Leu Phe Ala Lys Pro Thr Ala Leu Ala Leu Ser Arg 794
2388 aag gtg cag tea ggc tgt tgg tct gag att aat aca aat agt aac 2432
795 Lys Val Gin Ser Gly Cys Trp Ser Glu lie Asn Thr Asn Ser Asn 809
2433 aat aaa gac etc ate tec caa age ttt ate aca ate agt caa act 2477
810 Asn Lys Asp Leu lie Ser Gin Ser Phe lie Thr lie Ser Gin Thr 824
2478 cat tct cag get agt gat age tat gcc tac acc eta ctt cca aat 2522
825 His Ser Gin Ala Ser Asp Ser Tyr Ala Tyr Thr Leu Leu Pro Asn 839
2523 ate age aaa gca gac ttt gac aag gtg tgc age gaa gca cgt att 2567
840 lie Ser Lys Ala Asp Phe Asp Lys Val Cys Ser Glu Ala Arg lie 854
2568 gag gtg ctt cga aat gac agt aag ctt cag ctg ate cat gat aag 2612
855 Glu Val Leu Arg Asn Asp Ser Lys Leu Gin Leu lie His Asp Lys 869
2613 aaa caa ggc ctg ttg gcg gtg gtc aaa tac aat cag get aag gag 2657
870 Lys Gin Gly Leu Leu Ala Val Val Lys Tyr Asn Gin Ala Lys Glu 884
2658 gtg gtt aat ggt c犯ttg agt ctt g犯aaa tea ggc tta tac etc 2702
885 Val Val Asn Gly Gin Leu Ser Leu Glu Lys Ser Gly Leu Tyr Leu 899
2703 tat caa aag gtg gga aat gac ttt aag cag eta tct ttt aag gcc 27472748 tta tea tag cca ttc aag cac att 2771 915Leu Ser End
权利要求
1、一种兽疫链球菌透明质酸酶表达载体，其特征在于该表达载体是含有兽疫链球菌透明质酸酶基因的大肠杆菌表达载体。
2、 权利要求1所述的兽疫链球菌透明质酸酶表达载体，其特征在于所述的兽疫链球菌透 明质酸酶基因编码具有序列表中的氨基酸残基序列。
3、 权利要求2所述的兽疫链球菌透明质酸酶表达载体，其特征在于所述的兽疫链球菌透 明质酸酶基因具有序列表中的核苷酸序列；或与序列表中核苷酸序列的自5'端168位至 2756位碱基限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码序列表中的氨基酸残基序列的 核苷酸序列。
4、 权利要求3所述的兽疫链球菌透明质酸酶表达载体，其特征在于所述大肠杆菌表达载 体为pBV220、 pET22b，优选为pBV220。
5、 权利要求4所述的兽疫链球菌透明质酸酶表达载体，其特征在于该表达载体为 pBV220-hyl。
6、 权利要求1-5中任一所述的兽疫链球菌透明质酸酶表达载体导入大肠杆菌细胞得到的重 组细胞。
7、 权利要求6所述的重组细胞，其特征在于所述大肠杆菌细胞为大肠杆菌DH5ou JM109 或BL21 。
8、 一种表达兽疫链球菌透明质酸酶的方法，其特征在于该方法包括培养权利要求6或7所述的重组细胞，温控或IPTG诱导表达兽疫链球菌透明质酸酶的步骤；具体步骤如下① 菌种培养将单个新鲜大肠杆菌菌落接种于LB/Ampicillin培养液中，30°C振摇，培 养过夜。次日接种于较大体积培养液。继续培养至OD600约为0.5~0.6;② 温度诱导将温度迅速调至42。C，继续振摇培养4小时；③ 表达产物纯化，离心收集细胞，超声波破碎细胞，包含体分离，蛋白质变性，凝胶层 析纯化，柱中复性或透析复性。
9、 权利要求8所述的方法得到的透明质酸酶在降解透明质酸中的应用。
10、 权利要求8所述的方法得到的透明质酸酶在制备或生产透明质酸寡糖中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种含有兽疫链球菌透明质酸酶基因的表达质粒及其应用，其目的是提供一种兽疫链球菌透明质酸酶表达载体及导入该载体的重组大肠杆菌细胞和利用该细胞生产透明质酸酶并利用该透明质酸酶制备透明质酸寡糖的方法。本发明采用PCR方法，构建了含有兽疫链球菌透明质酸酶的编码基因的表达质粒，通过该表达质粒转化得到重组大肠杆菌株，并利用此工程菌表达生产得到透明质酸酶。该透明质酸酶表达载体是含有兽疫链球菌透明质酸酶基因的大肠杆菌表达载体。表达兽疫链球菌透明质酸酶的方法，包括培养重组大肠杆菌细胞，温控或IPTG诱导表达透明质酸酶及利用该透明质酸酶制备HA寡糖的步骤。该生产透明质酸酶的方法具有表达水平高、易扩大生产和成本低的特点。由本发明得到的透明质酸酶可用于降解透明质酸。
文档编号C12N15/70GK101633931SQ20081013451
公开日2010年1月27日 申请日期2008年7月25日 优先权日2008年7月25日
发明者凌沛学, 菲 刘, 朱希强, 生举正, 郭学平 申请人:山东省生物药物研究院