专利名称：：一种雪莲细胞系的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种雪莲细胞系，本发明还涉及该细胞系的制备方法及其培养物的大规模生产方法。
背景技术：
：雪莲是高山地区的民间药用植物，用于散寒除湿、活血通经、抗炎镇痛等，民间多用于风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、闭经，胎衣不下、麻痹不透、肺寒咳嗽、阳痿、高山不适应症等症的治疗。近年来，雪莲作为民族药在抗炎镇痛、抗早孕、抗衰老及抑制癌细胞增生方面的作用倍受关注。但我国雪莲主要分布在4000m以上的高原寒带地区，如新疆、甘肃、四川、云南和西藏。这些地区气候多变，冷热无常，最高月平均气温3-l(TC，最低月平均气温则在零下十几度到几十度，生长环境十分恶劣，只有耐寒的苔草属、蒿草属以及少数高山多年生草本植物与之伴生，一般在此环境下的雪莲植物大多为多年生，生长缓慢，人工栽培困难，长期以来掠夺性釆挖已使雪莲资源严重匮乏，已使得雪莲成为濒危物种，自然资源难以满足临床日益增长的需要。因此应用细胞培养的方法进行雪莲的开发即可以满足临床对雪莲药物的需求，也可以保护自然资源，维护生态环境。申请号为00123739.X和00123740.3的中国专利分别公开了两种水母雪莲高产细胞系，黄酮含量分别占到细胞干重的6.9%和6.23%。但还没有有关进一步提高黄酮含量的报道。另外，雪莲细胞系在放大过程中不稳定，当放大培养到一定规模后有效成分的含量会降低，目前还没有解决上述问题的有效手段。
发明内容本发明的第一个目的在于提供一种高产黄酮的雪莲细胞系。本发明以新疆雪莲(其种胚、根、茎、叶，或者由种子萌发的无菌苗)作为外植体，诱导愈伤组织，并进行反复继代培养，得到四种新疆雪莲细胞系白色系、黄色系、绿色系和紫红色系；对4种细胞系分别进行继代培养，通过对其生长速度、总黄酮化合物含量的检测，确定紫红色细胞系为长势较好，总黄酮化合物含量最高的细胞系。从分离的细胞系中选择颜色鲜艳呈紫红色、结构致密、团粒状的培养物，即为本发明细胞系。本发明进一步对获得的紫红色细胞系进行继代培养和筛选，综合考察有效成分的含量以及生长特征，最终获得了可以无限传代培养的稳定高产雪莲细胞系Sau-l,该细胞系已于2008年5月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京巿朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏号为CGMMCCNo.2506，分类命名为天山雪莲(Smmwraz'wvo/wcrafe)(新疆雪莲即为天山雪莲)。该雪莲细胞系具有以下特征生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，结构致密、呈团粒状，质地均匀、略偏硬，黄酮化合物含量为培养物干重的8-12%，培养周期10-14天。具体地说，可通过如下方法制备得到上述细胞系(1)新疆雪莲无菌苗的培育取天然新疆雪莲的种子，已通过中国科学院研究所标本馆(国家植物标本馆)鉴定，先用75%酒精浸泡10-30s，然后用1%氯化汞溶液消毒8-12min,再用无菌水反复冲洗4-5次，最后放在无菌滤纸上吸干种子表面水分，用无菌镊子接种在1/2MS(配方见附表1)中添加0.5-3mg/LGA(赤霉素)、10-30g/L蔗糖、0.6g/L琼脂的固体培养基上，22-27。C光照培养，约IO天种子即可萌发长出无菌苗。(2)愈伤组织的诱导和培养取无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽做外植体，在无菌条件下，用无菌手术剪刀和无菌镊子将无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽切成2-5mm长的小段，接种在MS(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L6-BA(6-苄基嘌呤)、2mg/L-4mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖的固体培养基上，22-27。C暗培养，7-10天诱导出愈伤组织。(3)愈伤组织的继代筛选本发明通过对雪莲愈伤组织的诱导和培养得到了四种新疆雪莲细胞系白色系、黄色系、绿色系和紫红色系；对4种细胞系分别进行了继代培养，通过对其生长速度、总黄酮化合物含量的检测，确定紫红色细胞系为长势较好，总黄酮化合物含量最高的细胞系。选取紫红色细胞系为原始细胞系，用目测法从固体培养基中挑选颜色较深、色彩鲜亮的紫红色愈伤组织在在MS(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L6-BA(6-节基喋呤)、2mg/L-4mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖的固体培养基上继续继代培养。为更好的优化种子、纯化细胞系，继代时接种块大小控制在3mm以下。如此反复，对所选择细胞系逐步驯化，本发明经过近IOO代筛选获得了可以无限传代培养的稳定高产雪莲细胞系Sau-l。本发明的第二个目的在于提供上述雪莲细胞系的继代培养方法，其所用培养基为MS培养基(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L6-BA(6-节基喋呤)、2mg/L-4mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖，pH值5.2-5.8,接种块为4-6mm,培养条件温度22-27。C,光照10-12小时，培养时间1520天。继代时选择生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，结构致密、呈团粒状，质地均匀、略偏硬为特征的培养物继代。此外还对培养物的黄酮、绿原酸、异绿原酸以及紫丁香皂甙含量进行考察，选择综合性状好的培养物继代。本发明的第三个目的在于提供一种大规模生产上述细胞系培养物的方法。本发明方法将液体摇床培养与固体培养相结合，包括如下步骤l)采用液体摇床培养的方法制种；2)将步骤1)得到的种子用于固体培养；3)选择步骤2)培养物中生长旺盛、颜色鲜艳、紫红色特征的培养物留种，用于步骤l)的摇床培养，其余收获，得培养物。具体地说，可采用如下方法进行大规模生产用高产雪莲细胞系Sau-l做种子，于装有150mL液体培养基的500mL培养瓶中悬浮培养，液体培养基为MS培养基(配方见附表1)添加0.2mg/L-0.5mg/L6-BA(6-节基喋呤)、2mg/L-4mg/LNAA(萘乙酸)及30g/L蔗糖，pH值5.2-5.8,接种量3-6%(W/V,g.fW/ml)，培养条件温度为22-27"C，摇床转速100-120rpm，培养时间8-10天，光照10-12小时、20001ax。从液体培养基中挑选生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，分散性好、颗粒均匀、无污染的细胞团作生产用种，将其转移到固体培养基上培养，注意剔出颜色发暗、发白的细胞团，接种的细胞团大小为4-6mm，固体培养基为MS培养基(配方见附表1)添加0.2mg/L-0.5mg/L6-BA(6-节基P票呤)、2mg/L-4mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖，pH值5.2-5.8;培养条件温度22画27。C，光照10-12小时、20001ax,培养时间15-20天。在利用生产用种进行大规模生产的同时，根据生产量大小，可以从中选择生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，结构致密、呈团粒状，质地均勻、略偏硬为特征的愈伤组织留种，再进行液体摇床培养制种，选种量一般不超过总生产量的15%,其余收集并低温真空干燥即得雪莲细胞培养物干品，如此反复。此外上述方法中液体培养和固体培养可同期进行，这样可以将生产周期缩短为15~20天。在生产过程中还可以对培养物的黄酮、绿原酸、异绿原酸以及紫丁香皂甙的含量进行考察，选择综合性状好的培养物留种。本发明细胞系具有高含量的有效成分，可用于制备食品、保健食品以及药品。本发明细胞系可用于雪莲细胞培养物的大规模生产，不仅满足了临床需求，而且保护了国家珍稀植物野生雪莲。本发明的优点主要体现(1)本发明提供的细胞系黄酮含量高，雪莲总黄酮含量占培养物干重的8-12%，高效液相指紋图谱显示，培养物中所含成分与野生雪莲基本相同。(2)生长旺盛，培养周期短，15-20天。(3)稳定性高，可无限传代。(4)通过本发明方法可进行大规模生产，与野生型相比生产周期大大缩短，并且所生产的培养物质量稳定产量高。(5)本发明方法不占耕地，不破坏雪莲野生资源，保护了生态环境，解决了新疆雪莲资源短缺的问题。图1本发明细胞质谱分析HPLC谱图。具体实施例方式下面结合实施例进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例l新疆雪莲紫红色细胞系的获得取天然新疆雪莲的种子，先用75%酒精浸泡10-30s，然后用1%氯化汞溶液消毒8-12min，再用无菌水反复冲洗4-5次，最后放在无菌滤纸上吸干种子表面水分，用无菌镊子接种在1/2MS(配方见附表l)中添加2.5mg/LGA(赤霉素)、30g/L蔗糖、0.6g/L琼脂的固体培养基上，25。C光照培养，约IO天种子即可萌发长出无菌苗。取无菌苗胚芽做外植体，在无菌条件下，用无菌手术剪刀和无菌镊子将无菌苗胚芽切成2-5mm长的小段，接种在MS(配方见附表1)中添加0.4mg/L6-BA(6-节基喋呤)、3mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖的固体培养基上，25。C暗培养，8天诱导出愈伤组织。本发明通过对雪莲愈伤组织的诱导和培养得到了四种新疆雪莲细胞系白色系、黄色系、绿色系和紫红色系；对4种细胞系分别进行了继代培养，通过对其生长速度、总黄酮化合物含量的检测，确定紫红色细胞系为长势较好，总黄酮化合物含量最高的细胞系。用无菌苗的根、茎、叶以及子叶也均能获得上述紫红色细胞系，优选釆用茎。选取紫红色细胞系为原始细胞系，用目测法从固体培养基中挑选颜色较深、色彩鲜亮的紫红色愈伤组织在MS(配方见附表1)中添加0.5mg/L6-BA(6-节基嘌呤)、4mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖的固体培养基上继续继代培养。培养条件为25°C,光照10-12小时、20001ax。为更好的优化种子、纯化细胞系，继代时接种块大小控制在3mm以下。如此反复，对所选择细胞系逐步驯化，本发明经过近IOO代筛选获得了可以无限传代培养的稳定高产雪莲细胞系Sau-l,该细胞系生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，结构致密、呈团粒状，质地均一、容易分离；其高效液相指紋图谱(图1，鉴定结果见表l)与野生雪莲基本吻合，并且绿原酸、异绿原酸的含量均高于野生雪莲；雪莲总黄酮含量为细胞干重的8-12%。表HPLC鉴定结果表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2液固交替生产方法1、液体摇床培养制种1.1选种选取培养10-14天，长势较好，颜色鲜艳，呈紫红色，颗粒均匀，质地均一，容易分离的本发明细胞系Sau-l培养物作种子。1.2培养基配制采用500ml培养瓶，每瓶装120-150ml培养液，培养液成分为MS(配方见附表l)中添加0.4mg/L6-BA(6-节基嘌呤)、3mg/LNAA(萘乙酸)及30g/L蔗糖，pH值为5.5;高温灭菌121°C,20min。1.3接种无菌条件下，将培养物用镊子夹碎后接种到装有120-150ml培养液的500ml培养瓶中，接种量5。/。(W/V,g.fW/ml)。1.4摇床培养培养条件培养温度为25。C，摇床转速110rpm，培养时间9d,光照llh、20001ax。培养过程中，多观察，发现染菌立即挑出。2、固体培养2.1液态种子的选取用显微镜观察检测，选取颜色鲜艳、呈紫红色、长势较好、分散性好、颗粒均匀无污染的培养物作生产用种。2.2培养基MS(配方见附表l)中添加0.3mg/L6-BA(6-苄基嘌呤)、3mg/LNAA(萘乙酸)、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖的固体培养基。2.3接种无菌条件下，将培养瓶中的培养液滤除，将培养物转移到垫有无菌滤纸的无菌培养皿中，挑取生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，分散性好、颗粒均匀、无污染的细胞团转接至固态培养基上，接种块大小为4國6mm。2.4固体培养培养温度25°C，光照llh、20001ax;培养周期15天。3培养物的收集及循环生产3.1留种大规模生产的同时，可以从中选择生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，结构致密、呈团粒状，质地均勻、略偏硬为特征的愈伤组织留种，用于步骤l的液体摇床培养，选种量以不超过总生产量的15%为宜。3.2培养物的收集收集剩余培养物，低温真空干燥，即可。根据需要，可以将干燥的培养物磨成粗粉或细粉，或者用来提取黄酮及其他活性成分。经测定，用此方法进行的大规模生产成本较低，培养物生长速率快，产量可达20-25g干重/月/升培养基；干品培养物中总黄酮含量高，达培养物干重的8-12%,并且培养物质量稳定。以上给出了本发明较佳的实施方式，本领域技术人员很容易想到釆用类似的方法对本发明的条件进行替换，例如将继代培养所用的激素替换成类似功能的激素，将所用的培养基替换成类似功能的培养基，将培养条件作修改，然而，这些改动没有改变本发明的实质,因而均属于本发明的范围之内。_附表1培养基配方_成分名称分子式分子量~~MS(mg/L)1/2MS(mg/L)KN0310U11900950NH4N0380.041650825KH2P04136.0917085MgS04.7H20246.47370185CaCl2.2H20147.02440220KI166.010.830.83H3B0361.836.26.2MnS04.4H20223.0122.322.3ZnS04.7H20287.548.68.6氢钾铵二镁钩钾锰锌酸酸酸酸化化酸酸酸硝硝磷硫氯砩硼硫硫<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1、一种新疆雪莲紫红色细胞系，其通过如下方法制备获得采用新疆雪莲的种胚或由种子萌发的无菌苗为外植体，经诱导愈伤组织并进行反复继代培养，从分离的细胞系中选择颜色鲜艳呈紫红色、结构致密、团粒状的培养物，即得。2、如权利要求1所述的细胞系，其为天山雪莲(5"aMMwefl/"vo/wcrafe)Sau-l保藏号为CGMCCNo.2506。3、由权利要求l或2所述细胞系获得的培养物。4、权利要求1或2所述细胞系的继代培养方法，其特征在于，所用培养基为含有0.1-0.5mg/L6-BA和l-5mg/LNAA的MS培养基，培养温度为2227°C,1520天继代一次。5、如权利要求4所述的继代培养方法，其特征在于，继代时选择生长旺盛、颜色鲜艳呈紫红色、结构致密、团粒状结构明显的培养物继代。6、如权利要求5所述的继代培养方法，其特征在于，继代时还包括对培养物中黄酮、绿原酸、异绿原酸以及紫丁香皂甙含量进行考察，选择综合性状好的培养物继代。7、权利要求3所述培养物的大规模生产方法，其步骤包括1)将权利要求1或2所述细胞系釆用液体摇床培养的方法制种；2)将步骤l)得到的种子用于固体培养；3)选择步骤2)培养物中生长旺盛、颜色鲜艳、紫红色特征的培养物留种，用于步骤l)的摇床培养，其余收获，得培养物。8、如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤l)液体摇床培养所用培养基为添加0.1-0.5mg/L6-BA和l-5mg/LNAA的MS液体培养基，接种量3-6%，培养条件pH值为5.2-5.8，培养温度为22-27°C，摇床转速100画120rpm，培养8-10天，光照每天10-12小时、20001ax。9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2)固体培养选择颜色鲜艳、呈紫红色、长势良好、分散性好、颗粒均勻、无污染的培养物作种子进行固态培养生产，接种到含0.1-0.5mg/L6-BA和l-5mg/LNAA的MS固体培养基上，，接种块为4-6mm,培养条件温度22-27。C，光照每天10-12小时，培养15~20天。10、如权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，还包括对培养物的黄酮、绿原酸、异绿原酸以及紫丁香皂甙含量进行考察，选择综合性状好的培养物留种。11、权利要求1或2所述细胞系在制备食品、保健食品、保健品和药品中的应用。12、权利要求3所述培养物在制备食品、保健食品、保健品和药品中的应用。全文摘要本发明提供了一种稳定、高产黄酮的新疆雪莲紫细胞系Sau-1CGMCCNo.2506，黄酮化合物含量可达培养物干重的8-12％，是野生天然雪莲的7-10倍。本发明还提供了一种该细胞系的培养技术及大规模快速生产该细胞系培养物的方法，该方法采用液-固培养相结合，通过液体培养制种，固体培养得到培养物，从中选择综合性状好的留种用于液体培养，如此反复。该方法可用于大规模生产，与野生型相比生产周期大大缩短，并且质量稳定，产量高。此外，该方法不占耕地，不破坏雪莲野生资源，保护了生态环境，解决了新疆雪莲资源短缺的问题。文档编号C12N5/04GK101338298SQ20081013423公开日2009年1月7日申请日期2008年7月23日优先权日2008年6月10日发明者刘汉石申请人:大连普瑞康生物技术有限公司