透明质酸酶及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种透明质酸酶及其制备方法，该透明质酸酶包含对卵子进行处理的组合物、杀菌剂及指示剂。本发明的透明质酸酶各项指标达到体外培养液的标准使用安全且易于判断培养液是否变质，为辅助生殖技术提供有力保证。
【专利说明】透明质酸酶及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人工辅助生殖技术，尤其涉及一种透明质酸酶及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 透明质酸酶对分离卵丘已广泛应用于试管婴儿技术中。透明质酸酶的目的是分离 卵子周围的卵丘。透明质酸酶的用途：用于卵子显微注射之前的卵丘细胞与卵子的分离。
[0003] 目前，我国辅助生殖技术中的透明质酸酶依赖进口成品，成本高且溶液的有效性 的好坏不能很好的表现，如果在培养液变质后仍继续使用将对实验或临床操作造成不可逆 转的结果。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种各项指标达到体外培养液的标准使用安全且易于判 断培养液是否变质的透明质酸酶，为辅助生殖技术提供有力保证。
[0005] 本发明的透明质酸酶，包含对卵子进行处理培养的组合物、杀菌剂及指示剂。
[0006] 所述杀菌剂为庆大霉素，浓度9. 5-10. 5mg/L。
[0007] 所述指示剂为酚红，浓度9. 5-10. 5mg/L。
[0008] 所述组合物中包含氯化钠 92. 815-102. 585mmol/L,氯化钾 4. 465-4. 935mmol/ L，硫酸镁 0· 19-0. 21mmol/L，氯化钙 1. 9-2. 1 mmol/L，碳酸氢钠 3. 8-4. 2mmol/L，4-羟 乙基脈嚷乙横酸HEPES 19. 95-22. 05mmol/L,葡萄糖2. 66-2. 94mmol/L,丙丽酸纳 0· 314-0. 347mmol/L、乳酸钠 2. 274-2. 514g/L、丙氨酰谷氨酰胺 0· 95-1. 05mmol/L、牛磺酸 0· 095-0. 105mmol/L，非必需氨基酸 0· 95%-L 05% (v/v)磷酸二氢钾 0· 352-0. 389mmol/L, 庆大霉素9.5-10.5 11^/1，酚红9.5-10.511^/1，人血清白蛋白11.4%-12.6%&八），透明质 酸酶 247. 57-273. 63mg/L。
[0009] 所述非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨 酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸中的一种或者几种。
[0010] 透明质酸酶的溶剂采用超纯水。
[0011] 本发明的透明质酸酶的ρΗ=7· 20-7. 40,渗透压272-288m0sm/Kg。
[0012] 本发明透明质酸酶的制备方法，包括下面步骤： (1) 透明质酸酶基础液的配制 a、 先按照比例称量各组分，并分开放置； b、 先将称量好的组分（除杀菌剂、指示剂、碳酸氢钠）溶于超纯水中，溶解过程中遵循先 固体后液体，NaHC03最后加入的原则； c、 向步骤b所得溶液中加入称量好的杀菌剂、指示剂和NaHC03 ; d、 检测溶液渗透压和pH值，如果pH值不在范围内则用配制好的盐酸和氢氧化钠溶液 调节pH值，并记录最终渗透压和pH值； (2) 透明质酸酶原液的配制 a、 在基础液中加入透明质酸酶，在超净工作台下利用0. 2 μ m的滤膜过滤除菌，得到滤 液A ; b、 在滤液A中加入人血清白蛋白，震荡或搅拌混合均匀，得到透明质酸酶的原液。
[0013] (3)透明质酸酶原液的处理 在无菌环境下对过滤后的溶液进行分装封口，得到市售的透明质酸酶，将其放置冰箱 或冷库内保存。
[0014] (4)透明质酸酶进行检测 检测项目是pH值、渗透压、细胞毒性、皮内刺激、致敏、无菌、热原、细菌内毒素、体外鼠 胚试验来判断透明质酸酶是否合格。
[0015] 本发明的有益效果是，1、透明质酸酶中含有指示剂酚红，酚红在pH变化时颜色变 化明显，pH在7. 20-7. 40范围内酚红溶液为粉红色到橙红色，当pH值小于6. 8时为黄色，当 pH值大于8. 4时为红色，变色比较明显，透明质酸酶的pH 7. 20-7. 40在此范围内溶液为粉 红色到橙红色，当透明质酸酶颜色与此不符时，说明该透明质酸酶变质，不能用于实验或临 床，从而避免了使用变质透明质酸酶而产生的风险。2、使用抗生素来抑制细菌的生长，如庆 大霉素是一种广谱、热稳定性好的抗生素，在透明质酸酶中添加庆大霉素可以有效抑制细 菌的生长。3、本发明透明质酸酶的原料均是已经证明其安全性的物质，在制备过程中其溶 剂采用超纯水，超纯水的总有机碳（T0C)超低，避免了因杂质过多影响测定的结果。4、国内 还没有成型的用于试管婴儿技术的培养液，此配方和制备方法为国内的试管婴儿技术提供 了有力的保证，避免了国外产品因长途运输带来的不明因素，同时配制工艺操作简单合理， 检测严密，能够提供新鲜的培养液供生殖中心或科研院所使用。
【具体实施方式】
[0016] 以下通过实施例对本发明做进一步的说明。
[0017] 一、透明质酸酶配方及制备方法 表1透明质酸酶配方
【权利要求】
1. 一种透明质酸酶，其特征在于，包含对卵子进行处理培养的组合物、杀菌剂及指示 剂。
2. 根据权利要求1所述的透明质酸酶，其特征在于，所述杀菌剂为庆大霉素 9. 5-10. 5mg/L〇
3. 根据权利要求1所述的透明质酸酶，其特征在于，所述指示剂为酚红，浓度 9. 5-10. 5mg/L〇
4. 根据权利要求1所述的透明质酸酶，其特征在于，所述组合物中包含氯化 钠 92.815-102. 585mmol/L,氯化钾 4.465-4. 935mmol/L，硫酸镁 0·19-0. 21mmol/ L，氯化钙1. 9-2. 1 mmol/L，碳酸氢钠3. 8-4. 2mmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES 19. 95-22. 05mmol/L，葡萄糖 2. 66-2. 94mmol/L，丙酮酸钠 （λ 314-0. 347mmol/L、乳酸钠 2. 274-2. 514g/L、丙氨酰谷氨酰胺 0. 95-1. 05mmol/L、牛磺酸 0. 095-0. 105mmol/L，非必需 氨基酸 〇· 95%-1· 05%, v/v，磷酸二氢钾 0· 352-0. 389mmol/L,庆大霉素 9. 5-10. 5 mg/L,酚 红 9. 5-10. 5mg/L,人血清白蛋白 11. 4%-12· 6%, v/v，透明质酸酶 247. 57-273. 63mg/L。
5. 根据权利要求4所述的透明质酸酶，其特征在于，所述非必需氨基酸为L-丙氨酸、 L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸中的一种或者几 种。
6. 根据权利要求1所述的透明质酸酶，其特征在于透明质酸酶的溶剂采用超纯水。
7. 制备权利要求1-6所述的透明质酸酶的方法，其特征在于包括下面步骤： (1) 透明质酸酶基础液的配制 a、 先按照比例称量各组分，并分开放置； b、 先将除杀菌剂、指示剂、碳酸氢钠外的称量好的组分溶于超纯水中，溶解过程中遵循 先固体后液体，NaHC03最后加入的原则； c、 向步骤b所得溶液中加入称量好的杀菌剂、指示剂和NaHC03 ; d、 检测溶液渗透压和pH值，如果pH值不在范围内则用配制好的盐酸和氢氧化钠溶液 调节pH值，并记录最终渗透压和pH值； (2) 透明质酸酶原液的配制 a、 在基础液中加入透明质酸酶，在超净工作台下利用0. 2 μ m的滤膜过滤除菌，得到滤 液A ; b、 在滤液A中加入人血清白蛋白，震荡或搅拌混合均匀，得到透明质酸酶的原液； (3) 透明质酸酶原液的处理 在无菌环境下对过滤后的溶液进行分装封口，得到市售的透明质酸酶，将其放置冰箱 或冷库内保存； (4) 透明质酸酶进行检测 检测项目是pH值、渗透压、细胞毒性、皮内刺激、致敏、无菌、热原、细菌内毒素、体外鼠 胚试验来判断透明质酸酶是否合格。
【文档编号】C12N5/075GK104140952SQ201410388804
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】王维华, 吕汝举, 刘美静, 庄巍, 王英超 申请人:山东威高新生医疗器械有限公司