曲霉阿拉伯呋喃糖苷酶的制作方法

专利名称：曲霉阿拉伯呋喃糖苷酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶，另外，本发明涉及编码这种酶的核苷酸序列。本发明也涉及一启动子，该启动子被用来控制编码所述酶的所述核苷酸序列的表达。
具体地说，本发明所述的酶是一种具有阿拉伯木聚糖降解活性的阿拉伯呋喃糖苷酶。
已知希望在生物体-如丝状真菌(如黑色曲霉(AspergillusNiger))或者甚至一种农作物的一些组织中指导所感兴趣的基因(“GOI”)的表达。产物蛋白质或者酶对于生物体本身可以是有用的。例如，可能希望产生有优化的氨基酸组成的作物蛋白产物，以提高作物的营养价值。例如，这种作物可以制成更有用的饲料。
或者，可能希望分离产物蛋白质或酶，然后使用这种蛋白质或酶来制备，例如，食品组合物。从这一点来看，该产物蛋白质或酶可以是食品组合物的一个成分，或者它可以被用来制备食品组合物，包括改变食品组合物的性质或外观。甚至可能希望使用生物体，如一种丝状真菌或者一种农作物，为了相同的目的来表达非植物基因。
也可能希望使用一种生物体，如一种丝状真菌或一种农作物，来表达哺乳动物基因。后者产物的例子包括干扰素，胰岛素，血因子，和血纤蛋白溶酶原激活物。也希望使用微生物，如丝状真菌，通过使用在该微生物中有活性的启动子，由GOI制备产品。
水果和蔬菜细胞壁大多由多糖组成，主要成分是果胶，纤维素和木糖葡聚糖(R.R.Selvendran和J.A.Robertson，IFR报告(IFRReport)，1989)。已经提出过多种细胞壁模型，努力加入强度和柔性基本性质(P.Albersheim，美国科学(Sci.Am.)，232，81-95，1975，P.Albersheim，植物生物化学(Plant Biochem.)第三版(Bonner和Varner)，Ac.Pross，1976；T Hayashi植物生理及植物分子生物学年度综述(Ann.Rev.Plant Physiol & Plant Mol Biol，40，139-168，1989)。
植物细胞壁的组成复杂而多样。发现多糖主要以长链纤维素(植物细胞壁的主要机构成分)，半纤维素(含有多种β-木聚糖链)和果胶物质(由半乳糖醛聚糖(galacturonan)和鼠李糖半乳糖醛聚糖(thamnogalacturonan)；阿拉伯聚糖；和半乳聚糖及阿拉伯半乳聚糖组成)的形式。从食品工业的角度出发，果胶物质，特别是阿拉伯聚糖，已变成植物细胞壁中最重要的成分(Whitaker，J.R.(1984)，酶微生物技术(Enzyme Microb.Technol.)，6，341)。
植物多糖的一种形式是阿拉伯聚糖。有关阿拉伯聚糖的叙述可以参见EP-A-0506190。根据该文献报道，阿拉伯聚糖由一条与另一条连接的α-(1→5)基团的主链组成。支链是α-(1→3)或者某些情况下是α-(1→2)与主要的α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖主链连接的。例如在苹果中，阿拉伯糖总量的三分之一存在于支链。阿拉伯聚糖的分子量一般是大约15kDa。
阿拉伯聚糖被总称为阿拉伯糖酶的酶降解。从这一点上看，阿拉伯聚糖降解活性是一种酶从阿拉伯聚糖主链或从其它半纤维素主链结构如阿拉伯半乳聚糖的含阿拉伯聚糖支链上释放阿拉伯糖残基，单体或者寡聚物的能力，或者甚至是通过裂解单萜基α-L-阿拉伯呋喃糖基葡糖苷的末端阿拉伯呋喃糖基单元和中间葡糖基单元之间的1→6键而释放阿拉伯糖单体的能力。
EP-A-0506190中阿拉伯聚糖降解酶之活性包括a)裂解(1→2)-α-L-阿拉伯糖苷键的能力；b)裂解(1→3)-α-L-阿拉伯糖苷键的能力；c)裂解(1→5)-α-阿拉伯糖苷键的能力；d)裂解单萜基α-L-阿拉伯呋喃糖基葡糖苷的末端阿拉伯呋喃糖基单元和中间葡糖基单元之间1→6键的能力。
已知阿拉伯聚糖降解酶是通过各种植物和微生物而产生的。在这些微生物中，真菌如那些曲霉属，伏革菌属，红酵母属(Kaii A.(1984)碳水化合物化学生物化学进展(Adv Carbohydr.Chem.Biochem.)，42，383)，Dichotomitus(Brillouet等，1985，碳水化合物研究(Carbohydrate Research，144，113)，Ascomycetes和Basidomycetes(Sydow，G，(1977)DDR专利申请No.124812)。
另一种植物多糖是木聚糖，其主要单糖单元是木糖。木聚糖是半纤维素的丰富的成分。在单子叶植物中主要的半纤维素是一种阿拉伯木聚糖，其阿拉伯糖支链与木糖残基主链连接。
阿拉伯木聚糖是在谷类细胞壁中发现的碳水化合物。有关阿拉伯木聚糖和其酶降解的叙述可以参见Voragen等(1992，阿拉伯木聚糖，木聚糖和木聚糖酶的特征(Characterisation of Cereal Arabinoxylans，Xylans和Xylanases)，第51-67页，J.Visser编著，Elsevier科学出版社出版)。
阿拉伯木聚糖一般含有通过β-1，4-键连接在一起的木糖主链。该木糖主链被L-阿拉伯糖残基取代，该L-阿拉伯糖残基通过α-1键与木糖残基的2或3位连接。所述木糖残基可以是单取代或双取代。除用阿拉伯糖取代外，木糖残基也可以被酰基，葡糖醛酸和各种其它碳水化合物取代。阿拉伯糖残基可以进一步被酚酸如阿魏酸和香豆酸取代。取代的程度和种类取决于具体阿拉伯木聚糖的来源。
在谷类细胞壁中发现了阿拉伯木聚糖，它们是第二层细胞壁的一部分。阿拉伯木聚糖构成小麦面粉的大约3％-其中部分是水溶性的(WSP)，部分是水不溶性的(WIP)。
尽管事实上阿拉伯木聚糖的量只是小麦的大约3％，但阿拉伯木聚糖部分的重要性却越来越大。这是因为谷类阿拉伯木聚糖起水胶体作用，因为它们与水形成类凝胶结构。例如，尽管事实上阿拉伯木聚糖只占面粉干重的3％，但面粉中的阿拉伯木聚糖最多组合揉好的面团中水的30％。当阿拉伯木聚糖组合水时，其增加磨细的谷物的粘度，粘度到了一定程度使谷物变得不容易吃。
可以用降解阿拉伯木聚糖的酶来操纵用于磨细谷物的几种体系的流变学性质。在现代面包烘房中，为了减少加工揉好的面所需的能量，也为了使面包有更大体积，减小揉好的面的粘度是有好处的。这一点通常是通过使用能降解阿拉伯木聚糖的木糖主链的酶而实现的。
为本发明目的只从阿拉伯木聚糖的木聚糖主链裂解阿拉伯糖支链的酶统称为阿拉伯木聚糖降解酶。
在以谷类为基础的饲料中，在饲料被吸收后，谷类中的阿拉伯木聚糖能提高动物肠中液体的粘度。这是一个问题，因为这引起动物的不舒适感觉，如消化不良。也降低了饲料的营养价值。通过向饲料中加入降解阿拉伯木聚糖的酶(如木聚糖酶)可以避免这些问题，以避免消化不良，并提高饲料的营养价值。但是有些降解阿拉伯木聚糖的酶(特别是一些木聚糖酶)要求存在有未取代的主链，所以它们的活性受到限制。
有关阿拉伯木聚糖的进一步的讨论可以参见《木聚糖和木聚糖酶》(Xylans and Xylanases)(1992，J.Visser编著，Elsevier科学出版社出版)。
根据Kormelink等，1991(Kormelink，F.J.M.Searle-Van LeeuwenM.J.F.，Wood.T.M.，Voragen，A.G.J.(1991)，“自泡盛曲霉纯化和表征(1，4)-β-D-阿拉伯木聚糖阿拉伯糖基呋喃糖水解酶”，《微生物、微生物技术应用)》(Appl.Microbiol.Biotechnol.25753-758)所述，一种阿拉伯木聚糖降解酶是(1，4)-β-D-阿拉伯木聚糖阿拉伯糖基呋喃糖水解酶(AXH)。但是该篇文献没有提供这种酶的序列测定数据或者编码这种酶的核苷酸序列，或者是用于这种酶的启动子的序列测定数据。
很明显，优选通过用重组DNA技术能降解阿拉伯木聚糖这一点是有用的。
本发明试图提供一种具有阿拉伯木聚糖降解活性的酶；优选其中这种酶能在一些或特定细胞或组织中制得，例如仅在一种生物体，一般为一丝状真菌，优选为曲霉属，如黑色曲霉，或者甚至是一种植物的特定细胞或组织中制得。
本发明也试图提供一种编码这种酶的GOI，这种GOI能优选在特定细胞或组织中表达，如在一种生物体，一般为丝状真菌，优选为曲霉属，如黑色曲霉，或者甚至是一种植物的一些或特定细胞或组织中表达。
此外，本发明试图提供一种能指导GOI表达的启动子，例如优选在某些特定细胞或组织，例如仅在一种生物体，一般为丝状真菌，优选为曲霉属，如黑色曲霉，或者甚至是一种植物的特定细胞或组织中编码本发明酶的核苷酸序列。优选在曲霉属中使用这种启动子，其中由GOI编码的产物从宿主生物体分泌到周围基质中。
而且，本发明试图提供包含所述GOI和/或启动子的构建，载体，质粒，细胞，组织，器官和生物体，以及优选在特定细胞或组织中的表达方法，例如仅在一种生物体，一般是丝状真菌，优选在曲霉属，或者甚至是一种植物的特定细胞或组织中表达。
根据本发明的第一方面，提供一种从曲霉属得到的酶，其中该酶具有如下特征MW是33,270D±50D；pI值大约为3.7；阿拉伯木聚糖降解活性；最适pH自大约2.5至大约7.0(更具体的是大约3.3至大约4.6，更具体的是大约为4)；最适温度为大约40℃至大约60℃(更具体的是大约45℃至大约55℃，更具体的是大约为50℃)；而且其中这种酶能将阿拉伯糖从阿拉伯木聚糖的木糖骨架上裂解下来。
根据本发明的第二方面，提供具有如SEQ.I.D.No.1所示序列的酶，或者其变体，同系物，或片段。
根据本发明的第三方面，提供由SEQ.I.D No.2所示核苷酸序列或其变体，同系物，或片段，或与其互补的序列编码的酶。
根据本发明的第四方面，提供编码本发明所述酶的核苷酸序列。
根据本发明的第五方面，提供具有SEQ.I.D.No.2所示的序列的核苷酸序列，或其变体，同系物或片段，或与其互补的序列。
根据本发明的第六方面，提供具有SEQ.I.D.No.3所示序列的启动子，或其变体，同系物或片段，或与其互补的序列。
根据本发明的第七方面，提供具有SEQ.I.D.No.13所示核苷酸序列的终止子，或其变体，同系物或片段，或与其互补的序列。
根据本发明的第八方面，提供具有SEQ.I.D.No.14所示核苷酸序列的信号序列，或其变体，同系物或片段，或与其互补的序列。
根据本发明的第九方面，提供通过使用一种启动子表达GOI的方法，其中所述启动子是本发明启动子。
根据本发明的第十方面，提供本发明酶降解阿拉伯木聚糖的应用。
根据本发明的第十一方面，提供降解阿拉伯木聚糖的酶的组合物(combination)，该组合物由本发明酶和木聚糖酶组成。
根据本发明的第十二方面，提供用于表达能降解阿拉伯木聚糖的酶，或者用于控制其表达，或用于控制另一GOI表达的质粒NCIMB40703，或可从此获得的核苷酸序列。
根据本发明的第十三方面，提供具有SEQ.I.D.No15所示序列的信号序列，或其变体，同系物或片段。
根据本发明的第十四方面，提供本发明酶在制备减缓或防止消化不良和/或提高吸收性和/或增加营养摄入的药物或食物的用途。
根据本发明的第十五方面，是提供具有阿拉伯木聚糖降解活性的阿拉伯呋喃糖苷酶(arabinofuranosidase)，其具有与抗具有SEQ.I.D.No1所示序列的纯化的阿拉伯呋喃糖苷酶抗体的免疫反应性。
根据本发明的第十六方面，提供阿拉伯呋喃糖苷酶启动子，其中该启动子是被木糖代谢的中间产物诱导的。
根据本发明的第十七方面，提供降低支化的底物粘度的方法，其中酶降解底物的支链而不降解底物的主链。
根据本发明的另一方面，提供本发明酶作为粘度调节剂的用途。
根据本发明的又一方面，提供本发明酶降低果胶粘度的用途。
本发明的其它方面包括由本发明前述方面构成的构建物，载体，质粒，细胞，组织，器官和转基因生物体。
本发明的其它方面包括表达或使表达或转化任一核苷酸序列，构建物，质粒，载体，细胞，组织，器官或生物体，以及其产物的方法。
本发明的另外方面包括使用所述启动子在培养基如肉汤或者在转基因生物体中表达GOI。
本发明的再一方面包括用所述酶制备或处理食物，包括动物饲料。
优选所述酶由SEQ.I.D.No.2所示核苷酸序列，或其变体，同系物或片段，或者与其互补的序列编码。
优选所述核苷酸序列具有SEQ.I.D.No.2所示序列，或是其变体，同系物或其片段或与其互补的序列。
优选所述核苷酸序列与启动子操作连接。
优选所述启动子包含序列CCAAT。
优选所述启动子是具有SEQ.I.D.No.3所示序列，或是其变体，同系物或片段，或者是与其互补的序列的启动子。
优选所述启动子包含自Xma111至BamH1位点的100bps序列。
优选本发明启动子与GOI操作连接。
优选所述GOI包含本发明核苷酸序列。
优选转基因生物体是真菌。
优选转基因生物体是丝状真菌，更优选是曲霉属。
优选转基因生物体是一种植物。
优选在应用中，所述酶与木聚糖酶，优选内切木聚糖酶(endoxylanase)组合使用。
本发明各方面最为优选的实施方案不包括自然环境中的任何一种天然酶，天然启动子或天然核苷酸序列。
优选的是，在任一质粒，载体，如表达载体或转化载体，细胞，组织，器官，生物体或转基因生物体中，所述启动子与至少一种GOI组合存在。
优选所述启动子和GOI被稳定地插入到转基因生物体的基因组中。
优选转基因生物体是丝状真菌，优选曲霉属，更优选是黑色曲霉。转基因生物体甚至可以是一种植物，如单子叶或双子叶植物。
最为优选的实施方案是一种自曲霉得到的酶，其中该酶具有下述特征，MW为33,270D±50D；pI值大约为3.7；阿拉伯糖基木聚酶降解活性；最适pH自大约2.5至大约7.0(更特别的是大约3.3至大约4.6，更具体为大约4)；最适温度是大约40℃至大约60℃(更特别是大约45℃至大约55℃，更具体为大约为50℃)；其中所述酶能从阿拉伯木聚糖的木糖主链上裂解阿拉伯糖；其中所述酶具有SEQ.I.D.No.1所示序列，或是其变体，同系物或片段。
另一最为优选的实施方案是自曲霉得到的一种酶，其中该酶具有如下特征MW为33,270D±50D；pI值大约为3.7；阿拉伯糖基木聚酶降解活性；最适pH自大约2.5至大约7.0(更特别的是大约3.3至大约4.6，更具体为大约4)；最适温度是大约40℃至大约60℃(更特别是大约45℃至大约55℃，更具体为大约为50℃)；其中所述酶能从阿拉伯木聚糖的木糖主链上裂解阿拉伯糖；其中所述酶有SEQ.I.D.No.2所示核苷酸序列或其变体，同系物或片段编码，或由与其互补的序列编码。
本发明的优点在于，它提供了一种制备具有阿拉伯木聚糖降解活性的阿拉伯呋喃糖苷酶，以及编码这种酶的核苷酸序列的方法。另外，本发明提供了能控制那个或其他的核苷酸序列表达的启动子。
其它的优点是本发明酶能影响磨细的谷物，如揉好的面团的粘度，使其易于加工，如例如得到较大的面包体积。
本发明酶用于饲料也是有优点的，因为其降解阿拉伯木聚糖，从而提高了饲料的营养价值。另外，其减小了动物肠中阿拉伯木聚糖的粘度，从而减缓或防止了消化不良。
本发明酶与木聚糖酶组合使用是特别有益的，因为本发明酶和木聚糖彼此有惊奇的出人意料的协同效果。
从这点上说，本发明酶提高了木聚糖酶的降解效果，而木聚糖酶提高了本发明酶的降解效果，而木聚糖酶提高了本发明酶的降解效果。相信木聚糖酶的活性被提高了，因为本发明酶提供了具有较少取代基的多糖底物。
因此，本发明提供一种具有阿拉伯木聚糖降解活性的酶，其中该酶可以在一些或特定细胞或组织中制得，例如只在生物体的特定细胞或组织中制备，该生物体一般为丝状真菌，优选曲霉属，例如黑色曲霉该酶甚至可以在一种植物中制备。
更特别地，本发明酶能从阿拉伯木聚糖的木糖主链上特异性地裂解阿拉伯糖。
本发明阿拉伯呋喃糖苷酶不同于现有技术中的阿拉伯呋喃糖苷酶。从这点上说，现有技术描述的阿拉伯呋喃糖苷酶-例如EP-A-0506190公开的那些酶-其特征在于它们降解未支化阿拉伯聚糖的能力，而且使用对-硝基苯基阿拉伯糖苷测定。
本发明阿拉伯呋喃糖苷酶不降解未支化的阿拉伯聚糖，且对于硝基苯基阿拉伯糖苷只有极小活性。相反，本发明阿拉伯呋喃糖苷酶用于降解阿拉伯木聚糖。因此说本发明阿拉伯呋喃糖苷酶与现有技术分离的阿拉伯呋喃糖苷酶是完全不同的。
本发明也提供编码所述酶的GOI，该GOI可以优选在特定细胞或组织中表达，如在生物体的某些或特定细胞或组织中表达，该生物体一般为丝状真菌，优选为曲霉属，如黑色曲霉。该GOI甚至可以在一种植物中表达。
另外，本发明提供一种能指导GOI表达的启动子，如编码本发明酶的核苷酸序列，优选只在生物体某些特定细胞或组织中表达，一般该生物体为丝状真菌，优选曲霉属，例如黑色曲霉，或者甚至是一种植物的特定细胞或组织中表达，优选在曲霉中使用所述启动子，其中GOI编码的产物从宿主生物体分泌到周围基质中。甚至可以裁制启动子(如果需要的话)以在植物中表达GOI。
本发明也提供了包含所述GOI和/或启动子的构建物，载体，质粒，细胞，组织，器官和生物体，表达GOI的方法，优选只在生物体的特定细胞或组织中表达，例如，该生物体一般为丝状真菌，优选在曲霉属中，或者甚至是植物的特定细胞或组织中表达。
与酶有关系的术语“变体”，“同系物”，或“片段”包括一个(或多个)氨基酸对于序列的任何取代，变异，修饰，置换，缺失或添加，条件是所得氨基酸序列具有阿拉伯木聚糖降解活性，优选至少具有序列表(SEQ.I.D.No.1或12)所示酶的相同活性，具体地说，术语“同系物”包括有关结构和/或功能的同源性，条件是所得酶具有阿拉伯木聚糖降解活性。关于序列同源性，优选与序列表所示SEQ.I.D.No.1至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％同源性。更为优选的是与序列表中所示SEQ.I.D.No.1至少95％，更优选至少98％同源性。
与编码所述酶的核苷酸序列有关系的术语“变体”，“同系物”，或“片段”包括一个(或多个)核酸对于序列的任何取代，变异，修饰，置换，缺失或添加，条件是所得核苷酸序列编码具有阿拉伯木聚糖降解活性的酶，优选至少具有序列表(SEQ.I.D.No.2或12)所示酶的相同活性，具体地讲，术语“同系物”包括关于结构和/或功能的同源性，条件是所得核苷酸序列编码具有阿拉伯木聚糖降解活性的酶。有关序列的同源性，优选与序列表中所示的SEQ.I.D.No.2至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％同源性。更为优选的是与序列表中所示SEQ.I.D.No.2至少95％更优选至少98％同源性。
与启动子相关的术语“变体”，“同系物”，或“片段”包括一个(或多个)核酸对于序列的任何取代，变异，修饰，置换，缺失或添加，条件是所得核苷酸序列在表达系统-例如根据本发明转化的细胞或者转基因生物体中具有作为启动子而起作用的能力。具体地讲，术语“同系物”包括与结构和/或功能有关的同源性，条件是所得核苷酸序列具有作为启动子而起作用的能力。关于序列同源性，优选与序列表所示SEQ.I.D.No.3至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％同源性。更为优选的是与序列表所示SEQ.I.D.No.3至少95％，更优选至少98％同源性。
与终止子或信号核苷酸序列有关的术语“变体”，“同系物”或“片段”包括一个(或几个)核酸对于序列的任何取代，变异，修饰，置换，缺失或添加，条件是所得核苷酸序列，在表达系统-例如根据本发明转化的细胞或转基因生物体中分别具有作为终止子而起作用或者编码具有作为信号序列而起作用的能力的氨基酸序列的能力。具体地说，术语“同系物”包括有关结构和/或功能的同源性，条件是所得核苷酸序列具有各作为或编码终止子或信号序列的能力。关于序列同源性，优选与序列表中所示SEQ.I.D.No.13和14(分别地)至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％同源性。更优选的是与序列表中所示SEQ.I.D.No.13和14(分别地)至少95％，更优选至少98％同源性。
与信号氨基酸序列有关的术语“变体”，“同系物”，或“片段”包括一个(或多个)氨基酸对于序列的任何取代，变异，修饰，置换，缺失或添加，条件是所得序列在表达系统-例如根据本发明的转化细胞或者转基因生物体中具有作为信号序列而起作用的能力。具体地说，术语“同系物”包括有关结构和/或功能的同源性，条件是所得核苷酸序列分别具有作为或编码一个信号的能力。关于序列同源性，优选于序列表所示SEQ.I.D.No.15至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％同源性。更优选的是与序列表所示SEQ.I.D.No.15至少95％，更优选至少98％同源性。
上述术语是序列等位变异的同义词。
术语“互补”指本发明也包括能分别与编码序列或启动子序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
与本发明有关的术语“核苷酸”包括基因组DNA，cDNA，合成DNA，和RNA。优选其指DNA，更优选指用于本发明编码序列的cDNA。
术语“构建物”-其与术语如“缀合物”，“弹夹”和“杂种”是同义词-包括与启动子直接或间接相连的GOI。一个间接连接的例子是有一合适的间隔基团，例如一内含子序列，例如ShI内含子或ADH内含子，在启动子和GOI之间起中介作用。对于包括直接或间接连接的与本发明有关的术语“融合”也是一样。在每种情况下最为优选的是这些术语不包括编码酶的基因正常地与野生型基因启动子相联的，且两者都在其自然环境下的情况的天然组合。最为优选的实施方案是与一种或所述启动子操作连接所述或一种GOI。
所述构建物甚至可以包含或表达一标记物，该标记物使选择已被转移到例如丝状真菌，优选曲霉属，例如黑色曲霉，或者植物，优选谷类，例如玉米，稻，大麦等中选择所要的基因构建物成为可能。存在可以使用的多种标记物，例如那些编码甘露糖-6-磷酸异构酶的标记物(尤其是用于植物)或者提供抗生素抗性的那些标记物-例如G418抗性，潮霉素，博来霉素，卡那霉素和庆大霉素抗性。
术语“载体”包括表达载体和转化载体。
术语“表达载体”指能体内或体外表达的构建物。
术语“转化载体”指能从一个物种转移到另一个物种的构建物-例如从大肠杆菌(E.coli)质粒转移到丝状真菌，优选曲霉属。其也可以是能从E.coli质粒转移到土壤杆菌转移到一种植物的构建物。
术语“组织”包括组织本身和器官。
与本发明有关的术语“生物体”包括可能包含本发明启动子和/或编码本发明酶的核苷酸序列和/或从其中得到的产物的任何生物体，其中所述启动子能使表达GOI和/或其中本发明核苷酸序列当在生物体中存在时能被表达。
优选生物体是丝状真菌，优选曲霉属，更优选黑色曲霉。
与本发明有关的术语“转基因生物体”包括包含本发明启动子和/或编码本发明酶的核苷酸序列和/或从其中得到的产物的任何生物体，其中在生物体内所述启动子能使GOI表达和/或其中本发明核苷酸序列在能被表达。优选启动子和/或核苷酸序列被插入到生物体的基因组中。
优选的转基因生物体是丝状真菌，优选曲霉属，更优选黑色曲霉。
因此，本发明转基因生物体包括包含有任一本发明启动子，编码本发明酶的核苷酸序列，本发明构建物，本发明载体，本发明质粒，本发明细胞，本发明组织或其产物，或者包含它们的组合的一种生物体。例如，转基因生物体可以包含本发明启动子控制下的GOI，优选外源核苷酸序列。转基因生物体也可以包含启动子控制下的编码本发明酶的核苷酸序列，所述启动子可以是本发明启动子。
在高度优选的实施方案中，转基因生物体不包含本发明启动子和编码本发明酶的核苷酸序列的组合，其中所述启动子和核苷酸序列两者对于该生物体是天然的，且处于它们的天然环境。因此在高度优选的实施方案中，本发明不包括处于其也处于其天然环境下的天然启动子的控制之下时处于其天然环境的根据本发明的天然的核苷酸编码序列。另外，在高度优选的实施方案中，本发明不包括处于其天然环境和由也处于自然环境的、其处于也处于其天然环境下的天然启动子的控制下的天然核苷酸编码序列表达的据本发明的天然的酶。
术语“启动子”是本领域通常的意义，例如-Jacob-Mond基因表达理论中的RNA聚合酶组合位点。
一方面，本发明启动子能表达GOI，其可以是编码本发明酶的核苷酸序列。
另一方面，根据本发明的核苷酸序列处于使核苷酸序列表达的启动子控制之下。从这一点上来说，启动子不一定要是与本发明启动子相同的启动子。从这方面来说，启动子可以是一种细胞或组织特异性启动子。例如，如果生物体是一种植物，则启动子可以是在茎，苗，根和叶组织的一种或几种中影响核苷酸序列表达的启动子。
例如，本发明核苷酸序列的启动子可以是α-Amy 1启动子(另外也称作Amy 1启动子，Amy 637启动子或α-Amy 637启动子)，参见1994年10月21日申请的共同未决的UK专利申请No.9421292.5。所述启动子包含

图1所示的序列。
或者本发明核苷酸序列的启动子可以是α-Amy 3启动子(另外也称为Amy 3启动子，Amy 351启动子或α-Amy 351启动子)，参见1994年10月21日申请的审而未决的UK专利申请No.9421286.7。所述启动子包含图2所示序列。
优选启动子是本发明启动子。
除上述核苷酸序列外，启动子，特别是本发明启动子可以另外包括确保或增加在合适宿主中表达的性质。例如所述性质可以是保守区，如Pribnow Box或TATA匣。所述启动子也可以包含影响(例如保持，增强，提高)GOI表达水平的其它序列。例如合适的其它序列包括Sh 1-内含子或ADH内含子。其它序列包括可诱导元件-例如温度，化合物，光或应激反应可诱导元件。
也可以存在增强转录或翻译的合适的元件。后者元件的一个例子是TMV 5′信号序列，参见Sleat基因217，217-225；和Dawson植物分子生物学(Dawson Plant Mol，Biol)2397)。
另外，本发明也涉及启动子和/或编码蛋白质或酶的核苷酸序列和/或元件的组合。例如，本发明涉及与可能是根据本发明的一个核苷酸序列的GOI操作连接的根据本发明的启动子的组合，和另外一个启动子，如与相同或不同GOI操作连接的一种组织特异性启动子的组合。
本发明也涉及用启动子来表达编码根据本发明酶的核苷酸序列用途，其中启动子的一部分是失活的，但其中该启动子仍能起启动子的作用。启动子的部分失活在某些情况下是有好处的。
具体地说，对于早些时候提到的Amy 351启动子，能够失活启动子的一部分，从而部分失活的启动子以更专一的方式如只在一种特定组织类型或器官中表达GOI。
术语“失活的”指部分失活，意义在于启动子的表达模式被修饰，但其中部分失活的启动子仍起启动子作用。但是，如上所述，修饰过的启动子能在至少一种(但不是全部)原启动子的特定组织中表达GOI。一种这样的启动子是如上所述的Amy 351启动子。
部分失活的例子包括改变启动子序列的折叠模式，或者改变其与核苷酸序列部分组合，这样，核苷酸序列的一部分不被例如RNA聚合酶识别。另一优选的部分失活启动子的方法是将其截短成其片段。另一种方法是使该序列的至少一部分突变，从而RNA聚合酶不能组合这一部分或另一部分。
另一种修饰作用是突变调节蛋白质的结合位点，例如已知来自丝状真菌的施加碳分解产物的阻遏作用CreA蛋白质，从而解除天然启动子的分解代谢产物的阻遏作用。
术语“GOI”参照本发明是指所感兴趣的任何基因。GOI可以是对于所研究生物体(例如丝状真菌，优选曲霉属，或一种植物)是外来的或本身的任何核苷酸。GOI典型的例子包括修饰代谢和分解代谢过程中的蛋白质和酶的编码基因。GOI可以编码引入或提高病原抗性的一种试剂。GOI还可以是修饰相关组织中存在的天然转录本的表达的反义构建物。GOI还可以编码丝状真菌，优选曲霉属的非天然蛋白质，或者编码对动物或人有好处的一种化合物。
例如，GOI可以编码药学活性蛋白质或酶，例如，治疗化合物胰岛素，干扰素，人血清白蛋白，人生长因子和凝血因子之任何一种。从这点上来说，转化的细胞或生物体可以制备可接受量的所期化合物，而这种化合物容易自该细胞或生物体得到。GOI也可以是给予一种食品或作物营养价值的一种蛋白质。典型的例子包括能抑制抗营养因子生成的植物蛋白和具有更加期望的氨基酸组成(例如比非转基因植物有更高的赖氨酸含量)的植物蛋白。GOI还可以编码可以用于食品加工的酶，例如凝乳酶，奇异果甜蛋白和α-半乳糖苷酶。GOI可以是任何一种有害毒素的编码基因，可以是一反义转录本，如对于马铃薯蛋白(patatin)或α-淀粉酶，ADP-葡糖焦磷酸酶(例如参见EP-A-0455316)的反义转录本，一种蛋白水解酶反义或葡聚糖酶的反义转录本。
GOI可以是编码α-淀粉酶的核苷酸序列，这是我们于1994年7月4日申请的共同未决UK专利申请9413439.2的主题，序列在图3中给出。GOI可以是编码α-淀粉酶的核苷酸序列，这是我们于1994年10月21日申请的共同未决UK专利申请9421290.9的主题，序列在图4中给出。GOI可以是编码ADP-葡糖焦磷酸酶的核苷酸序列，这是我们于1994年4月7日申请的审而未决PCT专利申请PCT/EP94/01082的主题，其序列在图5和图6中给出。GOI可以是编码α-葡聚糖水解酶的任何核苷酸序列，这在我们于1994年10月15日申请的审而未决PCT专利申请PCT/EP94/03397中有说明，其序列在图7-10中给出。
在一个优选的实施方案中，GOI是编码根据本发明酶的核苷酸序列。
如上所述，一种优选的宿主生物是曲霉属，如黑色曲霉。本发明转基因曲霉可以根据下列文献的说明而制得Rambosek，J，和Leach，J.1987(丝状真菌中的重组DNA改进和探索，CRC生物技术评论综述(Recombinant DNA in filamentous FungiProgress and Bospects CRCCrit.Rev Biotechnol.)6357-393)，Davis R.W.1994(MartinelliS.D.，Kinghorn J.R.(编著)《曲霉50年工业微生物进展》(Aspergillus50 years on Progress in industrial microbiology)，vol 29，Elsevier Amsterdam 1994，第525-560，“曲霉中异源基因表达和蛋白质分泌(Heterologous gene expression and protein secretion inAspergillus))，Ballance，D.J.1991(Leong，S.A.Berka R，M.(编著)《分子工业真菌学，丝状真菌的系统和应用》(Molecular IndustrialMycology，Systems and Application for Filamentous Fungi.)Marcel DekkerInc NewYork 1991.pp1-29，“丝状真菌的转化系统和真菌基因结构的总结”(Transformation systems for Filamentous Fungi and an Overview ofFungal Gene Structure)，和Turner G.1994(Martinelli S D.，Kinghorn J.R.(编著)《曲霉50年工业微生物进展》，vol 29，Elsevier Amster-dam 1994，pp641-666，“基因操作的载体”(Vectors for genetic manipulation))，而且，下面的说明总结了产生根据本发明的转基因曲霉的那些说明。
在近乎一个世纪里，工业上已广泛使用丝状真菌来生产有机化合物和酶。传统的日本Koji和大豆发酵已使用了曲霉属几百年。在本世纪已使用黑色曲霉生产有机酸，特别是柠檬酸，和生产各种用于工业的酶。
丝状真菌被广泛用于工业有两个主要原因。首先，丝状真菌可以产生大量胞外产物，例如酶和有机化合物，例如抗生素或有机酸。其次，丝状真菌可以在便宜的底物上生长，例如谷类，糠，甜菜肉质部分等。相同原因使丝状真菌成为根据本发明的异源表达的令人感兴趣的生物体。
为了制得转基因曲霉，通过将GOI(例如一种淀粉酶或SEQ.I.D.No.2)插入到为在丝状真菌中表达而设计的构建物而制备表达构建物。
已经研究出几种类型用于异源表达的构建物。这些构建物包含根据本发明的在真菌中有活性的启动子(或者如果GOI编码根据本发明的酶而需要的另一启动子)。除本发明外的启动子的例子包括用于高度表达胞外酶的真菌启动子，例如，葡糖淀粉酶启动子或α-淀粉酶启动子。该GOI可以与指导该GOI编码的蛋白质分泌的信号序列(例如本发明信号序列或另一个合适的序列)融合。通常使用真菌源信号序列，例如本发明的信号序列。在真菌中有活性的终止子终止表达体系，例如本发明的终止子。
已经研究出另外一种类型的真菌中的表达系统，其中GOI与编码稳定蛋白质的真菌基因的较小或较大部分融合。这可以稳定GOI编码的蛋白。在这样的体系中，被特异蛋白水解酶识别的一个切割位点可以被插入到真菌蛋白和GOI编码的蛋白之间，这样，产生的融合蛋白可以在该位点被特异蛋白水解酶切割，从而释放GOI编码的蛋白质(“POI”)。作为例子，可以插入至少在一些曲霉中发现的象肽酶一样的KEX-2识别的位点。这样的融合导致体内切割，从而保护POI并产生POI，而不产生较大融合蛋白。
已经报道过在曲霉中异源表达编码细菌，真菌，脊椎动物和植物蛋白质的几种基因。如果GOI不与信号序列融合，则蛋白质可以胞内沉积。蛋白质将在细胞质中蓄集，而且通常不被糖基化，这对于一些细菌蛋白是有益的。如果GOI装配有一信号序列，则蛋白质将在胞外蓄集。
就产生稳定性和宿主菌株修饰作用而言，当一些异源蛋白分泌到真菌培养液中时，它们不是非常稳定的，大多数真菌产生降解异源蛋白的几种胞外蛋白水解酶。为了避免这一问题，已经使用了具有降低的蛋白水解酶产量的一些特殊的真菌菌株作为异源生产的宿主。
为转化丝状真菌，对于很多丝状真菌已经研究出一些转化方案(Ballance 1991，上文)。其中很多方案的基础是制备原生质体并用PEG和Ca2+离子将DNA插入到原生质体内。然后转化的原生质体再生，并用各种选择性标记物选择转化的真菌。用于转化作用的标记物是一些营养缺陷型标记物，例如argB，trpC，niaD，和pyrG，抗生素抗性标记物，如benomyl抗性，潮霉素抗性和腐草霉素抗性。一种很常用的转化标记物是构巢曲霉(A.nidulans)的amdS基因，高拷贝数的该基因用丙烯酰胺作为唯一氮源使真菌生长。
尽管EP-B-0470145和CA-A-2006454中没有公开本发明所述的酶，编码该酶的核苷酸序列和本发明的启动子，但这两篇文献对这些类型的技术提供了一些有用的背景注释，可以应用到制备本发明转基因植物。一些这样的背景说明包括在下面的注释中。
基因工程改变的植物的构建的基本原理是在植物基因组中插入遗传信息，从而获得插入物质的稳定保持。
插入遗传信息有几种技术，两个主要的原理是直接引入遗传信息和使用载体系统引入遗传信息。一般性技术的综述可以参见Potrykus(植物生理和植物分子生物学年度综述(Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol)42205-225)和Christou(农业-食品-工业(Agro-Food-Industry)Hi-Tech，三月/四月，1994，17-27)的文章。
因此，一方面，本发明涉及一种载体系统，其携有本发明启动子或核苷酸序列或构建物，而且能将该启动子或核苷酸序列或构建物插入到一生物体，例如一种植物，的基因组中。
所述载体系统可以包含一个载体，但也可以包含两个载体。在有两个载体的情况下，通常认为该载体系统是二元载体系统(binary vectorsystem)。二元载体系统进一步详细描述于Gynheung An等(1980)，二元载体，植物分子生物学手册A3，1-19(Binary Vectors，PlantMolecular Biology Manual A3，1-19)。
用一种给定的启动子或核苷酸序列或构建物转化植物细胞的一种被广泛应用的系统的基础是使用来自根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti质粒或来自发根病土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的Ri质粒，An等，(1986)，植物生理(Plant Physiol)81，301-305，和Butcher D.N.等，(1980)，植物病理学家的组织培养方法(Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，编著D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208)。
已经构建出适用于构建上述植物或植物细胞构建物的几种不同的Ti和Ri质粒。一个非限制性的这样的Ti质粒的例子是pGV3850。
本发明的启动子，或核苷酸序列或构建物应该优选插入到T-DNA或相邻T-DNA序列的末端序列之间的Ti质粒中，从而避免这些紧邻T-DNA边界的序列破碎，因为这些区中的至少一个显示出对于将修饰的T-DNA插入植物基因组是必需的。
从上面的解释应该理解，如果所述生物体是一种植物，则本发明载体系统优选是包含感染植物所必需的序列(例如Vir区)和T-DNA序列的边界部分之至少一个的载体系统，其中所述边界部分位于与遗传构建物同的载体上。
而且，所述载体系统优选是根癌土壤杆菌Ti-质粒或发根病土壤杆菌Ri-质粒或者其衍生物，因为这些质粒是公知的，而且广泛应用于转基因植物构建。存在很多载体系统，它们以这些质粒或其衍生物为基础。
在转基因植物构建中，本发明启动子或核苷酸序列或构建物可以首先构建在一种微生物中，在该微生物中载体可以复制，而且其容易操作，一种有用的微生物的例子是E.coli，但也可以使用具有上述性质的其它微生物。当在E.coli中构建了如上定义的载体系统中的载体后，如果需要，将其转移到合适的土壤杆菌菌株中，例如转移到根癌土壤杆菌中。因此，优选将载有本发明启动子或核苷酸序列或构建的Ti-质粒转移到合适的土壤杆菌菌株，如A.tumefaciens(根癌土壤杆菌)中，从而得到载有本发明启动子，核苷酸序列或构建的土壤杆菌细胞，其中DNA接着被转移到要修饰的植物细胞中。
在CA-A-2006454中报道了可以获得包含E.coli复制系统和使选择转化细胞成为可能的标记物的大量克隆载体。这些载体包含例如pBR 322，pUC系列，M13 mp系列，pA CYC 184等。
用这种方法，本发明核苷酸或构建或启动子可以被插入到载体中合适的限制性位点。包含的质粒用于在E.coli中转化。E.coli细胞在合适的营养培养基中培养后收获，并裂解。然后回收质粒。通常使用的分析方法是序列测定分析，限制性酶切分析，电泳，还有生物化学和分子生物学方法。每步操作后，使用的DNA序列可以限制性酶切并与下一个DNA序列连接。每一序列可以在相同或不同质粒中克隆。
在植物中本发明所期望启动子或构建物或核苷酸序列的每一插入方法之后，可能需要存在和/或插入另一些DNA序列。如果例如为了转化而使用了植物细胞中的Ti-或Ri-质粒，则该Ti-和Ri-质粒T-DNA的至少右边界，而常常是右边界和左边界(作为插入基因的侧翼区)可以被连接。为转化植物细胞而使用T-DNA已经被深入研究，而且在EP-A-120516中有描述；Hoekema，于The Binary Plant VectorSystem offset drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第V章；Fraley等，植物科学评论(Crit Rev，Plant Sci.)，41-46；和An等，EMBOJ(1985)4277-284。
用土壤杆菌直接感染植物组织是一项简单的技术，已经被广泛应用，且在Butcher D.N.等(1980)的《植物病理学家的组织培养方法》，编著D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中有描述。该技术的进一步说明参见Potrykus(植物生理植物分子生物学年度综述)(Annu RevPlant Mol Biol)42205-225)和Christou(农业-食品-工业，Hi-Tech，三月/四月，1994，17-27)。用这项技术，可以在植物的某些部分或组织，即在植物的叶，根，茎，或其它部位的一部分上感染植物。
一般对于用携有所述启动子和/或所述GOI的土壤杆菌直接感染植物组织，要将要被感染的植物切出刀口，例如用剃刀切割植物，或者用针将植物刺孔，或者用砂纸磨擦植物。然后用土壤杆菌接种伤口，之后，接种后的植物或植物部分在合适的培养基上生长，使其生长成成熟植物。
当植物细胞被构建后，这些细胞可以根据公知的组织培养方法生长和保持，例如在补加有必需生长因素例如氨基酸，植物激素，维生素等之合适的培养基质中培养细胞。
转化的细胞再生成基因工程修饰的植物可以用植物自细胞或组织培养物再生的公知方法进行，例如通过用抗生素选择转化的枝，和通过在含有合适营养成分，植物激素等的培养基上传代培养枝而进行。
对于植物转化的进一步说明参见EP-A-0449375。
总之，本发明提供了具有阿拉伯木聚糖降解活性的阿拉伯呋喃糖苷酶和编码这种酶的核苷酸序列。另外，提供了能控制那个，或另一个核苷酸序列表达的启动子。另外其包括对于相同核苷酸序列表达的终止子和信号序列。
下面的样品根据布达佩斯条约保藏在认可的保藏单位The NationalCollections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)，大不列颠和北爱尔兰联合王国，苏格兰，Aberdeen，Machar Drive 23号，AB21RY，1995年1月16日包含质粒pB53.1的E.coli{即E.coli DH 5α-pB53.1}保藏号是NCIMB 40703。
现在通过实施例的方式说明本发明。
下面的实施例参考附图进行，其中；图1-10是早期专利申请的启动子和GOI序列，对于本发明的各方面是有用的。
图11是保藏物NCIMB 40703的主体，质粒pB53.1的质粒图；图12是对本发明启动子进行缺失的纲要图解；图13是pXP-AMY质粒图；图14是pXP-XssAMY质粒图；图15是图解；图16是HP-TLC曲线；图17是HP-TLC曲线；图18是HPLC图谱；图19是粘度图示；图20是活性图示；图21是活性图示；图22是活性图示；下面的叙述讨论特别是重组DNA技术的应用。重组DNA技术的一般性说明可以参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.Maniatis T(编著)《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning A laboratory manual.)第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press New York 1989。
在这些实施例中，本发明酶有时称作AbfC，另外，本发明启动子有时称作AbfC启动子。阿拉伯呋喃糖苷酶的纯化黑色曲霉3M43在含有麦糠和甜菜肉质部分的培养基中生长。发酵肉汤从肉汤经过滤的固体部分制备，浓缩的发酵肉汤装载到用20mM Tris，HCl pH7.5平衡过的25×100mm Q-SEPHAROSE(Pharmacia)高效柱上，线性梯度是O′-500Mm NaCl，收集洗脱液级分。阿拉伯呋喃糖苷酶在130-150Mm NaCl处洗脱出来。
合并含有阿拉伯呋喃糖苷酶的级分，用50×200mm G-25 SEPHAROSE Superfine(Pharmacia)脱盐。用蒸馏水洗脱柱子。
脱盐后用High-Trap旋转柱浓缩酶，接着将浓缩的脱盐的级分在50×600mm SUPERPEX 50柱上进行凝胶过滤。装载样品，用0.2M磷酸盐缓冲pH7.0加0.2M NaCl洗脱柱子，收集洗脱液级分。
合并含有阿拉伯呋喃糖苷酶的级分并脱盐，并且如上所述浓缩。合并的级分装载到用50mM含有1.5M(NH4)2SO4的磷酸盐缓冲液pH6.0平衡过的16×100mm Phenylsepharose高效柱(Pharmacia)上。使用(NH4)2SO4浓度自1.5-0M变化的浓度，并分级分收集洗脱液。合并含有阿拉伯呋喃糖苷酶的级分。使用phast系统凝胶(Pharmacia)通过SDS-PAGE评价阿拉伯呋喃糖苷酶的纯度。表征通过使用激光解吸技术的质谱测定纯化的阿拉伯呋喃糖苷酶的分子量，发现阿拉伯呋喃糖苷酶的MW是33,270D±50D。
使用广谱pI试剂盒(Pharmacia)测定pI值。阿拉伯呋喃糖苷酶的pI值大约为3.7。
SDS-PAGE分析后，处理PAS试剂显示出阿拉伯呋喃糖苷酶是糖基化的。根据I.Van Seuningen和M.Davril(1992)《电泳》(Electrophoresis)13，pp97-99的方法进行PAS染色。
测定AbfC活性对于水溶性戊聚糖(WSP)浓度(mg/ml)的函数。结果在图21中给出。结果表明在底物浓度为8mg/ml WSP时，AbfC活性达到最大。pH活性研究用来自小麦的水溶性戊聚糖10mg/ml作为50mM柠檬酸磷酸钠缓冲液中的底物研究pH对本发明阿拉伯呋喃糖苷酶活性的影响。温育时间为15分钟。发现本发明阿拉伯呋喃糖苷酶有自大约2.5至大约7.0的宽pH最佳范围(参见图20)，更特别的是自大约3.3至大约4.6，更特别的是大约4。温度活性研究用来自小麦的水溶性戊聚糖10mg/ml作为pH5.0之50mM乙酸钠中的底物研究温度对本发明阿拉伯呋喃糖苷酶活性的影响。温育时间为15分钟。发现本发明阿拉伯呋喃糖苷酶在大约40℃至大约60℃，更优选在大约45℃至大约55℃，更优选大约50℃的温度时有最佳活性(图22)。该酶在大约10℃仍有活性，并在70℃和80℃显示出残留活性。阿拉伯呋喃糖苷酶的氨基酸序列分析用Stone & Williams 1993说明的方法的改良方法，用购自BoehringerMannheim的Lys-C序列测定级内切蛋白酶消化所述的酶(Stone，K.L.和Williams，K.R.(1993)“蛋白质的酶消化和HPLC肽分离”，Matsudaira P.(编著)，《用于微量测序的蛋白质和肽纯化的实验指南》，第二版，科学出版社，San Diego，1993，pp.45-73(Enzymaticdigestion of Protein and HPLC Peptide Isolation、InMatsudaira P.(Editor).A Practical Guide to Protein and Peptide Purification forMicrosequencing.)。
冷冻干燥的β-阿拉伯呋喃糖苷酶(0.4mg)溶解于50μl之8M尿素，0.4M NH4HCO3，pH8.4中。上面充满N2后加入5μl 45MmDTT，蛋白质在50℃ N2下变性并还原15分钟。冷却至RT后，加入5μl100Mm碘代乙酰胺以使半胱氨酸衍生物化15分钟，条件是RT，黑暗，N2。接着加入90μl水和5μg内切蛋白酶Lys-C的50μl 50Mm Tricine和10mM EDTA，pH8.0的溶液，消化作用在37℃ N2下进行24小时。所得肽在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The SeparationsGroup；California)上用反相HPLC分离，使用溶剂A0.1％TFA水溶液，溶剂B0.1％TFA乙腈溶液。在使用脉冲液体快循环于AppliedBiosystems 476A测序仪上测定序列之前，用相同的溶剂体系将选择的肽再在Develosil C18柱(0.46×10cm；3μm)上进行色谱。发现下面的肽序列SEQ I.D.No.4SEQ I.D.No.5SEQ I.D.No.6SEQ I.D.No.7SEQ I.D.No.8基因片段PCR克隆的分离用Applied Biosystem DNA合成仪392型合成PCR引物。在这一方面，从发现的肽序列之一，即SEQ.I.D.No.5合成PCR引物。该引物是来自EMTAQA的一个引物(反向)SEQ ID NO.9GCY TGN GCN GTC ATY TC17mer64mix来自MIVEAIG的一个引物SEQ ID NO.10 ATG ATH GTN GAR GCN ATH GG20mer288mixPCR扩增用100pmol这些引物中的每一种在使用Amplitaq聚合酶的100μl反应液(PERKIN ELMER)进行。接下来的程序是步骤温度时间1 94℃2min2 94℃1min3 55℃2min4 72℃2min5 72℃5min6 5℃ SOAK步骤2-4重复40个循环。PCR反应在PERKIN ELMER DNA Thermal循环仪上进行。
根据厂商说明(Novagen)，将100bp扩增的片段分离并克隆到pT7-Blue T一载体上。分离黑色曲霉(A.niger)基因组DNA1g冷冻的A.niger菌丝体在研钵中在液氮中研磨。氮气蒸发后，研磨的菌丝体用含有1ml 20％十二烷基硫酸钠的提取缓冲液(100mM TrisHCl，pH8.0，0.50mM EDTA，500mM NaCl，10mM β-巯基乙醇)15ml提取。在65℃保温10分钟后加入5ml 5M KAc，pH5.0，混合后将混合物接着在冰上保温20分钟。提取后，将混合物离心20分钟，上清液与0.6体积异丙醇混合以沉淀出提取的DNA。进一步离心15分钟后，将DNA沉淀溶解于0.7ml TE(10mM Tris，HCl，pH8.0，1mMEDTA)，并用75μl 3M NaAc，pH8.0，和500μl异丙醇沉淀。
离心后，沉积物用70％ETOH冲洗并真空下干燥。DNA溶解于200μl TE并在-20℃下贮存。库的构建用Tsp 509 I部分消化20μg基因组DNA，给出与EcoRI末端相容的末端。消化的DNA在1％琼脂糖凝胶上分离并纯化4-10kb片段。使用λZAPII EcoRI/CIAP试剂盒(购自Stratagene)根据厂商说明构建库。2μl接头(总计5μl)与来自Stratagene的Gigapack Gold II填充提取物一起装柱。该库包含650,000个独立的克隆。库的筛选在NZY平板上平板接种2×50000pfu，并在Hybond N薄膜(Sheet)(Amersham)上进行噬斑吸取(plaquelift)。一式两份进行噬斑吸取。薄膜用购自pharmacia的Ready-to-go标记盒与用32PdCTP(Amersham)标记的PCR克隆杂交。只有当在两薄膜上都检测到杂交时才被看做正克隆。对基因进行序列测定，发现的序列表明所有进行测序的肽都被所发现的序列编码。序列信息SEQ.I.D.No.12代表启动子序列，酶编码序列，终止子序列和信号序列，和本发明酶的氨基酸序列。阿拉伯呋喃糖苷酶分析来自小麦粉的两个不同的阿拉伯木聚糖制品，小麦不溶性戊聚糖(WIP)和小麦可溶性戊聚糖(WSP)用本发明阿拉伯呋喃糖苷酶单独降解，或者组合自A.niger纯化的内切木聚糖酶降解。检测用50Mm 50Mm乙酸钠缓冲液pH5.0中的1％底物进行。反应在30℃进行32.5小时。反应通过加入3体积乙醇而终止，乙醇沉淀高分子量物质。样品离心并收集上清液，真空下干燥，并再悬浮于0.5Ml蒸馏水中。样品以1∶1在水中稀释，在Chromopack Carbohydrate pb柱(300×7.8mm，cat29010)上分析，应用Shimadzu C-R4A Chromatopac HPLC系统，使用Shimadzu RI D-6A折射率检测器，根据厂商说明进行。
柱子用由0.48mg/ml木三糖，0.48mg/ml木二糖，0.60mg/ml木糖和0.58mg/ml L-阿拉伯糖组成的标准样校准。用设备提供的软件鉴定和定量各峰值。结果-从小麦不溶性戊聚糖释放的糖底物是50Mm乙酸钠缓冲液pH5.0中的1％WIP。
AbfC指本发明酶；xyl指上文所述的木聚糖酶。结果-从小麦可溶性戊聚糖释放的糖底物是50Mm乙酸钠缓冲液pH5.0中的1％WIP。数值以mg/ml表示。
AbfC指本发明酶；xyC指上文所述的木聚糖酶。
图17给出AbfC酶与木聚糖酶A协同作用的HP-TLC曲线。在该图中使用了下面的缩写水溶性戊聚糖(WSP)；水不溶性戊聚糖(WIP)；燕麦木聚糖为底物。标准样是x-木糖；x2-木二糖；x3-木三糖；A-阿拉伯糖。
图18给出用1％燕麦斯佩耳特小麦木聚糖为底物的水解产物的HPLC分析。图18(a)和图18(b)显示出当分别单独使用AbfC酶和木聚糖酶时的产物。图18(c)显示出当AbfC酶和木聚糖酶组合使用时的产物。
这些实验结果提供了两个重要发现。
第一，本发明酶从阿拉伯木聚糖释放阿拉伯糖，特别是L-阿拉伯糖。
第二，本发明酶与内切木聚糖酶组合作用明显高于其各自作用的加合。因此，这两种酶以协同方式互相影响酶活性。诱导AbfC基因鉴定诱导物用包含AbfC启动子与E.coli的β-葡糖醛酸酶编码基因(uid A)的融合体研究黑色曲霉AbfC编码基因转录的调节。
GUS产生的转化产物在不同碳源上生长，并定性定量测定对水解对一硝基苯酚葡糖醛的能力。结果如下碳源 诱导24小时后的GUS活性(1％) (单位/mg)木糖 12.37木糖醇 1.49阿拉伯糖 6.66阿拉伯糖醇 5.30葡萄糖 0.70纤维素二糖 0.95木糖-寡聚物7017.26吡喃葡萄糖苷 0.40甲基-吡喃木糖苷 24.2木葡聚糖(xyloglucan) 1.00果胶 0.27阿拉伯半乳聚糖 2.60阿拉伯糖醇+葡萄糖2.20结果表明AbfC启动子当在木糖，木糖-寡聚物70，甲基-吡喃木糖苷，阿拉伯糖和阿拉伯糖醇存在下培养24小时后接通。这些研究也表明甲基-木糖吡喃糖苷是所述启动子的天然的和最强的诱导子。
AbfC启动子强烈地被葡萄糖阻抑，因此处碳分解代谢物阻抑作用下。但是与所公开的由阿拉伯糖和阿拉伯糖醇诱导的呋喃阿拉伯糖苷酶的启动子不一样，本发明AbfC启动子由木糖代谢中的中间体强烈调节。因此，本发明也涉及一种呋喃阿拉伯糖苷酶启动子，其中所述启动子是木糖代谢中间体可诱导的。不同启动子缺失对AbfC基因表达之调节的影响为了研究分子水平调节作用，进行实验来检测AbfC基因表达所需要的可能的上游调节序列。构建在该基因5′上游区有缺失的一系列质粒(参见图12)。E coli uid A基因被用作报道基因，并进行定性GUS分析。
结果表明截短的590bp AbfC启动子包含AbfC基因的可诱导性和其调节作用所需的足够的信息。启动子的100bps序列BamH1位点缺失从Xma111使得减小了该启动子的活性。因此该100bps区对于基因表达良好的水平是重要的。ATG之前的290bps缺失鉴定了该区对于取消该启动子的活性是重要的但不充分。包含该启动子构建的分析的所有转化产物在试验时显现非常浅的蓝色(+GUS)。这个区是-170 TCATCCAATAT如所见到的，该区包含CCAAT元件，而且是推定的常见转录激活子的靶物。该序列与在两种淀粉可诱导启动子中发现的核蛋白组合位点相似，所述两种淀粉可诱导启动子是黑色曲霉葡糖淀粉酶基因和米曲霉(Aspergillus oryzae)淀粉酶基因，以及构巢曲霉(Aspergillusnidulans)amdS基因。使用用AbfC启动子和AbfC信号序列转化的黑色曲霉生产异源蛋白黑色曲霉的转化黑色曲霉(A.niger)的转化方案以下述文献的公开为基础Buxton，F.P.，Gwynne D.I.，Davis，R.W.1985(“用构巢曲霉的argB基因转化黑色曲霉”(Transformation of Aspergillus niger using the arg Bgene of Aspergillus nidulans)，《基因》(Gene)，37207-214)，Daboussi，M.J.，Djeballi，A.，Gerlinger，C.，Blaiseau，P.L.，Cassan，M.，Lebrun，M.H.，Parisot，D.，Brygoo，Y.1989(“使用构巢曲霉的硝酸盐还原酶基因转化几种有丝真菌”(Transformation ofseven species of filamentous fungi nsing the nitrate Neductose gene ofAspergillus nidulans)，Curr.Genet.15453-456)和Punt，P.J.，van den Hondel，C.A.M.J.J.1992(“以潮霉素B和腐草霉素抗性标记物为基础转化有丝真菌”(Transformation of filamentous fungi based onhygromycin B and Phlemycin resistance markers)，《酶学方法》(Meth、Enzym.)216447-457)。
关于原生质体的纯化，在5-10ml水中从孢子新形成的N400(CBS 120.49，Centraalbureau voor Schimmelcultures，Baarn)(生长了7天)的-PDA(马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar)-fromDifco Lab.Detroit)板上冲洗下孢子。用该孢子悬浮液接种盛有200mlPDC(马铃薯葡萄糖肉汤，Difco 0549-17-9，Difco Lab、Detroit)的震荡瓶，并在30℃下震荡(250rpm)16-20小时。
使用Miracloth纸收获菌丝体，并将3-4g湿的菌丝体转移到盛有含75Mg裂解酶(Sigma L-2265)和4500个单位溶细胞酶(Sigma L-8012)的10ml STC(1.2M山梨糖醇，10mM Tris HCl pH7.5，50Mm CaCl2)的无菌陪替氏皿中。
用酶培养菌丝体直至菌丝体降解并释放出原生质体。然后通过一无菌60μm目过滤器过滤降解的菌丝体。在一甩平式转头中以2000rpm的速度离心10分钟收获原生质体。弃去上清液，并将沉积物溶解于8ml1.5M MgSO4中后，以3000rpm离心10分钟。
用移液管将含有原生质体的上层条带转移到另一试管中，并加入2ml0.6M KCl。在顶部小心加入5ml 30％蔗糖，试管以3000rpm离心15分钟。
处于界面带的原生质体转移到新的试管中并用1vol.STC稀释。溶液以3000rpm离心10分钟。沉积物用STC冲洗两次，最后溶解于1ml STC中。计数原生质体，并在转化前还要浓缩。
关于转化，将100μl原生质体溶液(106-107原生质体)与含有5-10μg DNA的10μl DNA溶液混合，并在室温下温育25分钟。然后以200μl，200μl和800μl分批小心加入60％PEG-4000。该混合物在室温下温育20分钟。向混合物中加入3ml STC，并小心混合。该混合物以3000rpm离心10分钟。
去除上清液，并将原生质体增溶于残留的上清液中，加入3-5ml顶层琼脂糖，并将原生质体快速涂布于选择板上。AbfC启动子和异源基因表达表达载体pXP-Amy(图13)包含克隆在AbfC启动子(2.1kb)下游和木聚糖酶A终止子上游的来自Thermomyces lanuginosus的2.1kbα-淀粉酶编码基因。该载体与潮霉素基因一起作为选择标记用于共转化实验，试验AbfC启动子的功能性。
最好的转化产物聚集在以培养基中至少1克/升α-淀粉酶的震荡烧瓶中。然后在48小时内检测淀粉降解活性，并在于糖甜菜肉质部分和小麦糠上生长4天时发现酶活性峰(图15)。蛋白质分泌中的AbfC信号序列功能制备包含与来自T.lanuginosus的成熟α-淀粉酶翻译融合的AbfC基因信号肽的表达构建物，并发现该构建物在生产菌株中表达。关于这一点，翻译融合构建物pXPXss-Amy(图14)置于AbfC启动子和木聚糖酶A终止信号的转录控制下。内源信号肽的插入导致表达淀粉酶的潮霉素抗性标记两者的共转化物之提高的可检测性。该内源信号肽指导细胞外淀粉酶分泌。AbfC蛋白的底物特异性用包含阿拉伯糖的半纤维素测定纯化的AbfC的底物特异性来自小麦，燕麦和落叶松的阿拉伯木聚糖，支化的和脱支的阿拉伯糖，阿拉伯半乳聚糖，糖甜菜果胶，和木葡聚糖。
HPLC和HP-TLC结果见图16，其中使用了下面的缩写WSP-水溶性戊聚糖，WIP-水不溶性戊聚糖，AG-阿拉伯半乳聚糖，脱B-A-脱支阿拉伯聚糖(de B-A-debranched arabinan)。使用的标准物是A-阿拉伯糖，X-木糖。
结果表明阿拉伯糖是阿拉伯糖基木聚糖的水解产物。没有水解产物从阿拉伯半乳聚糖，脱支的阿拉伯聚糖或木葡聚糖上释放出来。阿拉伯糖作为支化阿拉伯聚糖的水解产物而释放。因此AbfC是一种1，2/1，2脱支酶，而且其对在脱支阿拉伯聚糖和阿拉伯糖基半乳聚糖中发现的线性1，5α-键连的L-阿拉伯糖基呋喃糖残基没有活性。该酶在果胶用作底物时也释放一种产物，相信该产物是包含阿魏酸或阿拉伯二糖的阿拉伯糖。通过AbfC减小粘度关于底物特异性的研究结果也表明本发明酶可以用来减小饲料的粘度。关于这一点，该酶可以通过去除支化部分而不去除底物的主链而减小支化底物的粘度。这与已知的降解底物主链的粘度调节剂相反。
因此，本发明涉及一种减小支化底物粘度的方法，其中酶降解底物的支化部分但不降解底物的主链。
特别是，本发明涉及用本发明酶作为粘度调节剂。
关于这一点，进行实验研究通过呋喃阿拉伯糖苷酶减小来自小麦粉的水溶性戊聚糖成分的粘度。在该实验中，6ml水溶性戊聚糖与100μlAbfC一起在20℃，pH5.5条件下温育20小时。
结果表明(参见图19)，本发明酶可以用来减小果胶的粘度，特别是在饮料中-例如在果汁中使用的果胶的粘度。
因此，本发明涉及使用本发明酶来减小果胶粘度。产生抗体通过给兔注射纯化的酶，并根据N Harboe和A Ingild(“免疫，分离免疫球蛋白，估算抗体滴度”(Immunization，Isolation ofImmunoglobulins，Estimation of Antibody Titre)，《定量免疫电泳，方法和应用手册》(A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Methods and Applications)，NH Axelsen等编著，Universitetsforlaget，Oslo，1973)和TG Cooper(“生物化学工具”(The Tools ofBiochemistry)，John Wiley & Sons，New York，1977)描述的方法从抗血清中分离免疫球蛋白来产生抗本发明酶的抗体。总结尽管已知黑色曲霉产生呋喃阿拉伯糖苷酶，但本发明提供了一种新的有创造性的呋喃阿拉伯糖苷酶，以及编码该酶的序列，和该序列的启动子。本发明一个重要的优点在于这种酶能高量生产。
另外，本发明启动子和调节序列(例如信号序列和终止子)可以用来表达或者可以用于生物体中GOI的表达，例如在黑色曲霉中表达。
本发明阿拉伯呋喃糖苷酶不同于先前已知的呋喃阿拉伯糖苷酶。关于这一点，先前描述的呋喃阿拉伯糖苷酶-例如EP-A-0506190中的那些酶-其特征在于它们能降解阿拉伯聚糖，并用对硝基苯基阿拉伯糖苷分析测定。
本发明呋喃阿拉伯糖苷酶不降解阿拉伯聚糖，而且在对硝基苯基阿拉伯糖苷上只可见到极小活性。
相反，本发明阿拉伯呋喃糖苷酶用于降解阿拉伯木聚糖。因此，本发明呋喃阿拉伯糖苷酶与现有分离的呋喃阿拉伯糖苷酶相当不同。
更具体的是，本发明酶能从阿拉伯木聚糖的木糖主链上特异性地裂解阿拉伯糖。
本发明酶是有用的，因为其能改进制备食品和饲料的方法以及改良食品和饲料本身。例如，可以将本发明酶加到富含阿拉伯木聚糖的动物饲料中。当加入到单胃动物(例如家禽或猪)的含有谷物例如大麦，小麦，玉米，黑麦或燕麦或谷物副产物例如小麦糠或玉米糠的饲料(包括青贮饲料)时，这种酶能明显提高植物细胞壁的破碎，使动物更好地利用植物养分。结果提高了生长速率和/或饲料转化。而且，阿拉伯木聚糖降解酶可以用来减小含阿拉伯聚糖的饲料的粘度。如果优选预先浸泡或湿的食物，则可以在处理饲料或青贮饲料之前加入本发明阿拉伯木聚糖降解酶。
特别的优点在于本发明酶能组合木聚糖酶，尤其是内切木聚糖酶使用。
本发明酶另一个可能的应用在于纸浆和造纸工业。经常报道使用木聚糖酶在从半纤维素主链的纤维素和半纤维素残基上去除木质素和萜类是有好处的，这是造纸中加工木料，木浆或木料衍生产物的一个基本步骤。向木聚糖酶处理步骤中加入根据本发明生产的阿拉伯木聚糖降解酶会有助于含阿拉伯聚糖半纤维素主链的降解，因此有利于改进并更有效地去除木质素和萜类两者。应用阿拉伯木聚糖降解酶在其中半纤维素主链中包含葡糖醛酸的软木加工中特别有好处。
本发明酶也是有用的，因为其以与内切木聚糖酶的协同方式作用(见上述结果)。
本发明的其它改变在不超出本发明范围情况下对本领域技术人员来说是显而易见的。序列表SEQ ID NO1酶序列(i)序列特征(A)长度296个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Cys Ser Leu Pro Ser1 5Ser Tyr Ser Trp Ser Ser Thr Asp Ala Leu Ala Thr Pro Lys Ser Gly10 15 20Trp Thr Ala Leu Lys Asp Phe Thr Asp Val Val Ser Asp Gly Lys His25 30 35Ile Val Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Glu Ala Gly Asn Tyr Gly Ser Met40 45 50Thr Phe Gly Ala Phe Ser Glu Trp Ser Asn Met Ala Ser Ala Ser Lys55 60 65 70Thr Ala Thr Pro Tyr Asn Ala Val Ala Pro Thr Leu Phe Tyr Phe Lys75 80 85Pro Lys Ser Ile Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Ser Ser Thr Phe90 95 100Thr Tyr Arg Thr Ser Gln Asp Pro Thr Asn Val Asn Gly Trp Ser Ser105 110 115Glu Lys Ala Leu Phe Thr Gly Lys Leu Ser Asp Ser Ser Thr Gly Ala120 125 130Ile Asp Gln Thr Val Ile Gly Asp Asp Thr Asn Met Tyr Leu Phe Phe135 140 145 150Ala Gly Asp Asn Gly Lys Ile Tyr Arg Ser Ser Met Ser Ile Asp Glu155 160 165Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Gln Tyr Glu Glu Ile Leu Ser Gly Ala170 175 180Thr Asn Asp Leu Phe Glu Ala Val Gln Val Tyr Thr Val Asp Gly Gly185 190 195Glu Gly Asn Ser Lys Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser Thr200 205 210Gly His Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala Ser Ser Leu Gly Gly Glu215 220 225 230Trp Thr Ala Gln Ala Ala Ser Glu Asp Lys Pro Phe Ala Ala Lys Pro235 240 245Thr Val Ala Pro Pro Gly Pro Lys Thr Leu Ala Met Val Thr Trp Phe250 255 260Ala Thr Thr Leu Ile Lys Pro *265 270SEQ ID NO2核苷酸编码序列AAA TGC TCT CTT CCA TCG TCC TAT AGT TGG AGT TCA ACC GAT GCT CTCGCA ACT CCT AAG TCA GGA TGG ACC GCA CTG AAG GAC TTT ACT GAT GTTGTC TCT GAC GGC AAA CAT ATC GTC TAT GCG TCC ACT ACT GAT GAA GCGGGA AAC TAT GGC TCG ATG ACC TTT GGC GCT TTC TCA GAG TGG TCG AACATG GCA TCT GCT AGC AAG ACA GCC ACC CCC TAC AAT GCC GTG GCT CCTACC CTG TTC TAC TTC AAG CCG AAA AGC ATC TGG GTT CTG GCC TAC CAATGG GGC TCC AGC ACA TTC ACC TAC CGC ACC TCC CAA GAT CCC ACC AATGTC AAC GGC TGG TCG TCG GAG AAG GCG CTT TTC ACC GGA AAA CTC AGCGAC TCA AGC ACC GGT GCC ATT GAC CAG ACG GTG ATT GGC GAC GAT ACGAAT ATG TAT CTC TTC TTT GCT GGC GAC AAC GGC AAG ATC TAC CGA TCCAGC ATG TCC ATC GAT GAA TTT CCC GGA AGC TTC GGC AGC CAG TAC GAGGAA ATT CTG AGT GGT GCC ACC AAC GAC CTA TTC GAG GCG GTC CAA GTGTAC ACG GTT GAC GGC GGC GAG GGC AAC AGC AAG TAC CTC ATG ATC GTTGAG GCG ATC GGG TCC ACT GGA CAT CGT TAT TTC CGC TCC TTC ACG GCCAGC AGT CTC GGT GGA GAG TGG ACA GCC CAG GCG GCA AGT GAG GAT AAACCC TTC GCA GCA AAG CCA ACA GTG GCG CCA CCT GGA CCG AAG ACA TTAGCC ATG GTG ACT TGG TTC GCA ACA ACC CTG ATC AAA CCA TGASEQ ID NO3启动子序列CTGCAGAAGA TGGCAGTCGC CACAGCCGAT CACCCGATCC ATACTGGATG TTGTAACTTG 60GAGACAGCCT GCAGATGCTC TGATGAAGGT CTGCAAATAG TTCCTGGACC TCGATAGTGA 120AGTATACCGA TTCGTCAATG TTGTATATCC AGCCACTTTG AAAGTACCAA CTTTTAGTTC 180GATTGATCAG AATACTTTTG GTGTGTAACA TTGACAAGCC AAATTATCAA TCTCTTCTAC 240CGGTAAGGTG TCAACTACCC GGCCGAAAGT ACCGGAAGGT CGTGGTGTTT TAAGGTGAAA 300CAACTATCAG GGCGGCAATG TGTCAAAGTA GAACCAGTTT GCTTAGCGCC ATTAGGATCC 360ACGCCTAGAC CCTTGATGCC CGGGAGTTAT CCGTCCTGTC ACAGCAATTA TTTCCCCGAG 420TCTACTGCCG AAGAACAGCC ATTGTGGCGT ACTCACGGAA TTACCCACTG TGTAGGGTAG 480TCTTGAACGC CGTTCTAGAC ACGGCAACGC TCCGGTGGAC GATCGTTTCT GGCTAATGTA 540CTCCGTAGTT TAGGCAGCAT GCTGATCATC TTCCCCCTAG GGAAAGGCCC CTGAATAGTG 600CGCCAAAATG AGCTTGAGCA AAGGAATGTT CTTTCTAAGC CAAAGTGAGG GAAATAACCA 660AGCAGCCCAC TTTTATCCGA AACGTTTCTG GTGTCATCCA ATATGGATAA ATCCCGATTG 720TTCTTCTGCA CATATCTCTA TTGTCATAAG TGCAACTACA TATATTTGAA CATGGTTTGG 780TCCTCTTTCC AAGTTATTCG TTCTCCGTGA CCAGCGATTT CAGCCATTGA TTCTTTTGTT 840TCTTTCCCCG CGGATAAACT CATACGAAGSEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度20氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(v)片段类型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO4Lys Cys Ser Leu Pro Ser Ser Tyr Ser Trp Ser Ser Thr Asp Ala Leu1 5 10 15Ala Thr Pro Lys20SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度41氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(v)片段类型分子内(xi)序列描述SEQ ID NO5Tyr Leu Met Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser Thr Gly His Arg Tyr Phe1 5 10 15Arg Ser Phe Thr Ala Ser Ser Leu Gly Gly Glu Met Thr Ala Gln Ala20 25 30Ala Ser Glu Asp Lys Pro Phe Xaa Gly35 40SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(v)片段类型分子内(xi)序列描述SEQ ID NO6Ser Ile Trp Val Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Ser Ser Thr Phe Thr Tyr1 5 10 15Arg Thr Ser Gln Asp Pro Thr Asn Val20 25SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度30个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(v)片段类型分子内(xi)序列描述SEQ ID NO7Asp Ile Val Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Glu Ala Gly Asn Tyr Gly Ser1 5 10 15Met Thr Phe Gly Ala Phe Ser Glu Xaa Ser Asn Met Ala Ser20 25 30SEQ ID NO8的信息(i)序列特征
(A)长度41个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(v)片段类型分子内(xi)序列描述SEQ ID NO8Ile Iyr Arg Ser Ser Met Ser Ile Asp Glu Phe Pro Gly Ser Phe Gly1 5 10 15Ser Gln Tyr Glu Glu Ile Leu Ser Gly Ala Thr Asn Asp Leu Phe Glu20 25 30Ala Val Gln Val Tyr Thr Val Asp Gly35 40SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“OLIGONUCLEOTIDE”(xi)序列描述SEQ ID NO6GCYTGNGCNG TCATYTC17SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“OLIGONUCLEOTIDE”(xi)序列描述SEQ ID NO10ATG ATH GTN GAR GCN ATH GG 20SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度89个碱基对(B)类型核酸(C)链双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“PCR fragment”(xi)序列描述SEQ ID NO11ATGATTGTGG AGGCGATCGG GTCCACTGGA CATCGTTATT TCCGCTCCTT CACGGCCAGC60AGTCTCGGTG GAGAGATGAC CGCACAGGC 89SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度2555个碱基对(B)类型核酸(C)链双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)来源(A)生物体黑色曲霉(B)菌株3M43(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置870..1757(ix)特征
(A)名称/关键词sig_peptide(B)位置870..947(ix)特征(A)名称/关键词mat_peptide(B)位置948..1754(xi)序列描述SEQ ID NO12CGGTAAGGTG TCAACTACCC GGCCGAAAGT ACCGGAAGGT CGTGGTGTTT TAAGGTGAAA300CAACTATCAG GGCGGCAATG TGTCAAAGTA GAACCAGTTT GCTTAGCGCC ATTAGGATCC360ACGCCTAGAC CCTTGATGCC CGGGAGTTAT CCGTCCTGTC ACAGCAATTA TTTCCCCGAG420TCTACTGCCG AAGAACAGCC ATTGTGGCGT ACTCACGGAA TTACCCACTG TGTAGGGTAG480TCTTGAACGC CGTTCTAGAC ACGGCAACGC TCCGGTGGAC GATCGTTTCT GGCTAATGTA540CTCCGTAGTT TAGGCAGCAT GCTGATCATC TTCCCCCTAG GGAAAGGCCC CTGAATAGTG600CGCCAAAATG AGCTTGAGCA AAGGAATGTT CTTTCTAAGC CAAAGTGAGG GAAATAACCA660AGCAGCCCAC TTTTATCCGA AACGTTTCTG GTGTCATCCA ATATGGATAA ATCCCGATTG720TTCTTCTGCA CATATCTCTA TTGTCATAAG TGCAACTACA TATATTTGAA CATGGTTTGG780TCCTCTTTCC AAGTTATTCG TTCTCCGTGA CCAGCGATTT CAGCCATTGA TTCTTTTGTT840TCTTTCCCCG CGGATAAACT CATACGAAG ATG AAG TTC TTC AAT GCC AAA GGC 893Met Lys Phe Phe Asn Ala Lys Gly-26 -25 -20AGC TTG CTG TCA TCA GGA ATC TAC CTC ATT GCA TTA ACC CCC TTT GTT 941Ser Leu Leu Ser Ser Gly Ile Tyr Leu Ile Ala Leu Thr Pro Phe Val-15 -10 -5AAC GCC AAA TGC TCT CTT CCA TCG TCC TAT AGT TGG AGT TCA ACC GAT 989Asn Ala Lys Cys Ser Leu Pro Ser Ser Tyr Ser Trp Ser Ser Thr Asp1 5 10GCT CTC GCA ACT CCT AAG TCA GGA TGG ACC GCA CTG AAG GAC TTT ACT 1037Ala Leu Ala Thr Pro Lys Ser Gly Trp Thr Ala Leu Lys Asp Phe Thr15 20 25 30GAT GTT GTC TCT GAC GGC AAA CAT ATC GTC TAT GCG TCC ACT ACT GAT 1085Asp Val Val Ser Asp Gly Lys His Ile Val Tyr Ala Ser Thr Thr Asp35 40 45GAA GCG GGA AAC TAT GGC TCG ATG ACC TTT GGC GCT TTC TCA GAG TGG 1133Glu Ala Gly Asn Tyr Gly Ser Met Thr Phe Gly Ala Phe Ser Glu Trp50 55 60TCG AAC ATG GCA TCT GCT AGC AAG ACA GCC ACC CCC TAC AAT GCC GTG 1181Ser Asn Met Ala Ser Ala Ser Lys Thr Ala Thr Pro Tyr Asn Ala Val65 70 75GCT CCT ACC CTG TTC TAC TTC AAG CCG AAA AGC ATC TGG GTT CTG GCC 1229Ala Pro Thr Leu Phe Tyr Phe Lys Pro Lys Ser Ile Trp Val Leu Ala80 85 90TAC CAA TGG GGC TCC AGC ACA TTC ACC TAC CGC ACC TCC CAA GAT CCC 1277Tyr Gln Trp Gly Ser Ser Thr Phe Thr Tyr Arg Thr Ser Gln Asp Pro95 100 105 110ACC AAT GTC AAC GGC TGG TCG TCG GAG AAG GCG CTT TTC ACC GGA AAA 1325Thr Asn Val Asn Gly Trp Ser Ser Glu Lys Ala Leu Phe Thr Gly Lys115 120 125CTC AGC GAC TCA AGC ACC GGT GCC ATT GAC CAG ACG GTG ATT GGC GAC 1373Leu Ser Asp Ser Ser Thr Gly Ala Ile Asp Gln Thr Val Ile Gly Asp130 135 140GAT ACG AAT ATG TAT CTC TTC TTT GCT GGC GAC AAC GGC AAG ATC TAC 1421Asp Thr Asn Met Tyr Leu Phe Phe Ala Gly Asp Asn Gly Lys Ile Tyr145 150 155CGA TCC AGC ATG TCC ATC GAT GAA TTT CCC GGA AGC TTC GGC AGC CAG 1469Arg Ser Ser Met Ser Ile Asp Glu Phe Pro Gly Ser Phe Gly Ser Gln160 165 170TAC GAG GAA ATT CTG AGT GGT GCC ACC AAC GAC CTA TTC GAG GCG GTC 1517Tyr Glu Glu Ile Leu Ser Gly Ala Thr Asn Asp Leu Phe Glu Ala Val175 180 185 190CAA GTG TAC ACG GTT GAC GGC GGC GAG GGC AAC AGC AAG TAC CTC ATG 1565Gln Val Tyr Thr Val Asp Gly Gly Glu Gly Asn Ser Lys Tyr Leu Met195 200 205ATC GTT GAG GCG ATC GGG TCC ACT GGA CAT CGT TAT TTC CGC TCC TTC 1613Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser Thr Gly His Arg Tyr Phe Arg Ser Phe210 215 220ACG GCC AGC AGT CTC GGT GGA GAG TGG ACA GCC CAG GCG GCA AGT GAG 1661Thr Ala Ser Ser Leu Gly Gly Glu Trp Thr Ala Gln Ala Ala Ser Glu225 230 235GAT AAA CCC TTC GCA GCA AAG CCA ACA GTG GCG CCA CCT GGA CCG AAG 1709Asp Lys Pro Phe Ala Ala Lys Pro Thr Val Ala Pro Pro Gly Pro Lys240 245 250ACA TTA GCC ATG GTG ACT TGG TTC GCA ACA ACC CTG ATC AAA CCA TGA 1757Thr Leu Ala Met Val Thr Trp Phe Ala Thr Thr Leu Ile Lys Pro *255 260 265 270CTGTCGATCC TTGCAACCTC CAGTTGCTCT ATCAGGGCCA TGACCCCCAA CAGCAGTGGC 1817GACTACAACC TCTTGCCATG GAAGCCGGGC GTCCTTACCT TGAAGCAGTG ACGAGCTTAT 1877CTTTAGTTGC AGATCGTGTT TCTCCTTTCT TCTTCAAGTA GTTTTAGTGG TGGAAGACAG 1937CAGAAGGTGG TCATCATCTT AGGCTCAGTT GGGGTGGGCT CCTGCCACGT TTTGTCCATA 1997GGCTAGTAAT TTGCACGGAA TTCAGTTCAT TGGCAAGGAG TGCGGTACGA ATACCTGTTT 2057TCACAATAGC AATTAGGCCC AGTAGTTATA CTACGTACTG GAATTGAGTA CTCGTAGTAG 2117CAAGATTGTT TGCCTCAGAG GGAATGGCCG ACACGTGAGC AAGTCACCTT CATCAGCTAG 2177TCGCGTTCCA CATAGACAAT GGTCCAGCTC CAGAGTGGAA TTTGGGCTAC TTTGAACGAT 2237GGCCGATTGA ATCGCGCGTC TCCTCAATTG TATTTAACCA CAATAGGCCA GGTATTGGCA 2297TTCACTCTCC GCCTTTGCGG GTGCCGGCAC GAGATGTCTC CTGAAGAAAC TAGGCAACGA 2357GCAGACTGTG GATATGGGAG ATGGTTGACG ATGTGCTTCT TGGTAAATTT GAAGCCTCCA 2417GGGCCTCTAG AAAGGCGGGA ATTTAAATCT CAAGTGCCCT AACGTGTCCG ACCACGGTGT 2477TGATCATCAT TCATTGAATC GGATAACAGT CTTGGTTCGG AAACTGAACA GGCGGCTCTT 2537GAATGACACT CTGGATCC 2555SEQ ID NO13的信息终止子序列CTGTCGATCC TTGCAACCTC CAGTTGCTCT ATCAGGGCCA TGACCCCCAA CAGCAGTGGC 60GACTACAACC TCTTGCCATG GAAGCCGGGC GTCCTTACCT TGAAGCAGTG ACGAGCTTAT120CTTTAGTTGC AGATCGTGTT TCTCCTTTCT TCTTCAAGTA GTTTTAGTGG TGGAAGACAG180CAGAAGGTGG TCATCATCTT AGGCTCAGTT GGGGTGGGCT CCTGCCACGT TTTGTCCATA240GGCTAGTAAT TTGCACGGAA TTCAGTTCAT TGGCAAGGAG TGCGGTACGA ATACCTGTTT300TCACAATAGC AATTAGGCCC AGTAGTTATA CTACGTACTG GAATTGAGTA CTCGTAGTAG360CAAGATTGTT TGCCTCAGAG GGAATGGCCG ACACGTGAGC AAGTCACCTT CATCAGCTAG420TCGCGTTCCA CATAGACAAT GGTCCAGCTC CAGAGTGGAA TTTGGGCTAC TTTGAACGAT480GGCCGATTGA ATCGCGCGTC TCCTCAATTG TATTTAACCA CAATAGGCCA GGTATTGGCA540TTCACTCTCC GCCTTTGCGG GTGCCGGCAC GAGATGTCTC CTGAAGAAAC TAGGCAACGA600GCAGACTGTG GATATGGGAG ATGGTTGACG ATGTGCTTCT TGGTAAATTT GAAGCCTCCA660GGGCCTCTAG AAAGGCGGGA ATTTAAATCT CAAGTGCCCT AACGTGTCCG ACCACGGTGT720TGATCATCAT TCATTGAATC GGATAACAGT CTTGGTTCGG AAACTGAACA GGCGGCTCTT780GAATGACACT CTGGATCC 798SEQ ID NO14的信息信号序列ATG AAG TTC TTC AAT GCC AAA GGC AGC TTG CTG TCA TCA GGA ATC TAC 48CTC ATT GCA TTA ACC CCC TTT GTT AAC GCC 78SEQ ID NO15信号序列(i)序列特征(A)长度26个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO15Met Lys Phe Phe Asn Ala Lys Gly Ser Leu 10Leu Ser Ser Gly Ile Tyr Leu Ile Ala Leu 20Thr Pro Phe Val Asn Ala 2权利要求
1.一种从曲霉属获得的酶，其中该酶具有下面的特征a.MW是33,270D±50Db.pI值大约是3.7c.阿拉伯木聚糖降解活性d.最适pH为从大约2.5至大约7.0(更优选从大约3.3至大约4.6，更优选大约4)e.最适温度为从大约40℃至大约60℃(更优选自大约45℃至大约55℃，更优选大约50℃)；其中这种酶能从阿拉伯木聚糖的木糖主链上裂解阿拉伯糖。
2.一种具有SEQ.I.D.No.1所示序列，其变体，同系物或片段的酶。
3.一种由SEQ.I.D.No.2所示核苷酸序列或其变体，同系物或片段，或者与其互补的序列编码的酶。
4.编码权利要求1的酶的核苷酸序列。
5.编码权利要求2的酶的核苷酸序列。
6.具有SEQ.I.D.No.2所示序列，其变体，同系物或片段，或者其互补序列的核苷酸序列。
7.与一启动子操作连接的任一权利要求4至6的核苷酸序列。
8.权利要求7的核苷酸序列，其中启动子是具有如SEQ.I.D.No.3所示序列或其变体，同系物或片段，或者其互补序列的启动子。
9.具有SEQ.I.D.No.3所示序列或其变体，同系物或片段，或者其互补序列的启动子。
10.与GOI操作连接的权利要求9的启动子。
11.权利要求10的启动子，其中启动子GOI操作连接，其中GOI包含任一项权利要求4-6的核苷酸序列。
12.具有SEQ.I.D.No.13所示核苷酸序列，或其变体，同系物或片段，或者其互补序列的终止子。
13.具有SEQ.I.D.No.14所示核苷酸序列，或其变体，同系物或片段，或者其互补序列的信号序列。
14.包含或表达权利要求1至13之任一的本发明的构建物。
15.包含或表达权利要求1至14之任一的本发明的载体。
16.包含或表达权利要求1至15之任一的本发明的质粒。
17.包含或表达权利要求1至16之任一的本发明的转基因生物体。
18.权利要求17的转基因生物体，其中生物体是一种真菌。
19.权利要求18的转基因生物体，其中生物体是一种丝状真菌，优选曲霉属。
20.权利要求17的转基因生物体，其中生物体是一种植物。
21.制备项权利要求1至3之任一的酶的方法，包括表达权利要求4至8之任一的核苷酸序列。
22.权利要求21的方法，其中所述酶具有SEQ.I.D.No.1所示序列，或者是其变体，同系物或片段，所述核苷酸序列具有SEQ.I.D.No.2所示序列，或者是其变体，同系物或片段，或者是其互补序列。
23.权利要求21或22的方法，其中通过用权利要求9的启动子控制(部分或全部)表达。
24.一种通过使用一启动子表达GOI的方法，其中启动子是权利要求9的启动子。
25.权利要求1至3之任一的酶或通过权利要求21至24之任一的方法制备的酶降解阿拉伯木聚糖的用途。
26.权利要求24的用途，其中酶与木聚糖酶，优选内切木聚糖酶(endoxylanase)组合使用。
27.降解阿拉伯木聚糖的酶的组合物，该组合物包括权利要求1至3之任一的酶或通过权利要求21至24之任一的方法制备的酶；和木聚糖酶。
28.质粒NCIMB 40703，或从中获得的核苷酸序列，所述序列用来表达能降解阿拉伯木聚糖的酶，或控制其表达，或控制另一GOI的表达。
29.具有SEQ.I.D.No.15所示序列或其变体，同系物或其片段的信号序列。
30.权利要求1至3之任一的酶或权利要求21至24之任一的方法制备的酶在制药或食物生产中防止消化不良和/或提高营养吸收的用途。
31.一种具有阿拉伯木聚糖降解活性的呋喃阿拉伯糖苷酶，其与抗纯化的具有SEQ.I.D.No.1所示序列的呋喃阿拉伯糖苷酶抗体起免疫反应。
全文摘要
本发明公开了一种能降解阿拉伯木聚糖的酶。另外公开了编码这种酶的核苷酸序列和控制这种酶表达的启动子。
文档编号C12N15/00GK1198778SQ96193916
公开日1998年11月11日 申请日期1996年3月11日 优先权日1995年3月17日
发明者S·M·马德里, P·拉斯慕森, A·巴鲁赫 申请人:丹尼斯科有限公司