一种粉末状小麦芽内切-β-(1,4)-D-木聚糖酶的生产方法
【专利摘要】本发明涉及一种小麦芽内切?β?(1,4)?D?木聚糖酶的生产方法，本发明以小麦芽为主要原料，粉碎后经缓冲溶液提取得到木聚糖内切酶粗酶，分别经硫酸铵沉淀、Q?Sepharose Fast Flow阴离子色谱、Phenyl?Sepharose 6F F疏水柱、Sephacryl S?100HR凝胶柱层析后冷冻干燥获得内切?β?(1,4)?D?木聚糖酶粉，经SDS?page检测电泳条带单一，分子量为27.8KDa。本发明首次获得小麦源内切?β?(1,4)?D?木聚糖酶，且纯度高，比活高。可用于啤酒酿造业等食品加工业，具有重大的经济效益。
【专利说明】
一种粉末状小麦芽内切-β-(1，4)-D-木聚糖酶的生产方法
一、技术领域
[0001]本发明涉及一种小麦芽内切-13-(l，4)-D-木聚糖酶的生产方法，属于食品用酶生产领域。
二、【背景技术】
[0002]阿拉伯木聚糖(AXs)含有(1-4)键连接的β-D-吡喃木糖主链，主链β-D-吡喃木糖在O2和/或O3位上单取代或双取代α-L-阿拉伯呋喃糖苷，某些α-L-阿拉伯呋喃糖苷被阿魏酸在O5位上酯化。AXs中β-D-吡喃木糖主链的长度，侧链a-L-阿拉伯呋喃糖残基的数量及其在主链上的分布是影响AXs理化性质尤其是溶解性、粘度、凝胶性能等的主要因素。AXs由于AXs结构特点的不均一性，它的降解需要一系列的脱支和解聚酶的共同作用。AXs由内切-β-(1，
4)-D-木聚糖酶(EC 3.2.1.8,简称木聚糖内切酶)随机断裂木糖骨架，降低其聚合度，由外切酶β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)从非还原性末端将其分解为木糖。木聚糖内切酶作为解聚酶从内部降解AXs木糖骨架，改变阿拉伯糖残基的数量及分布，从而使AXs的理化性质发生巨大变化，是降解AXs的关键酶。
[0003]木聚糖酶是目前研究最热门的一种谷物加工用酶，在欧洲焙烤工业中被用作面包改良用酶。木聚糖酶在提高面团机械加工性能、抗发酵过头、增大面包体积及延缓老化等方面均有显著功能。许多微生物都能分泌木聚糖酶，目前的研究主要集中于微生物源木聚糖酶。
[0004]目前没有来源于植物的木聚糖内切酶成品。本发明首次从小麦芽中分离纯化得到电泳条带单一的粉末状小麦芽内切-13_(l，4)-D-木聚糖酶，该酶可作为食品加工业用酶，也可用于实验室用酶，市场前景广阔。
三、
【发明内容】
[0005]本发明以啤酒用小麦芽为主要原料，粉碎，缓冲液提取后，分别经硫酸铵沉淀、Q-Sepharose Fast Flow阴离子色谱、Phenyl-Sepharose 6F F疏水柱、SephacryI S-100HR凝胶柱层析后冷冻干燥获得内切-13_(l，4)-D-木聚糖酶粉，经SDS-page检测电泳条带单一，分子量为27.8KDa。
[0006]—种粉末状小麦芽内切-β_(1，4)-D_木聚糖酶的生产方法，包括以下步骤:
[0007]1、将小麦芽磨碎，磨筛孔径0.2mm，得到小麦芽粉；向小麦芽粉中按照质量体积比1:4加入0.05M pH7.0的磷酸盐缓冲液，冰水浴中搅拌30min，将搅拌后的混合液用0.05MpH7.0的磷酸盐缓冲液定容至所述小麦芽粉质量的5倍;5000rpm、4°C下离心15min，收集上清液为E-1，并于4 °C冰箱中贮存；
[0008]2、冰水浴并磁力搅拌条件下向所述E-1中加入40%饱和度的硫酸铵；待硫酸铵完全溶解后于4°C静置I个小时，5000rpm、4°C下离心lOmin，收集上清液为E-2，并记录E-2的体积；
[0009]3、向所述E-2中加入60%饱和度的硫酸铵，待硫酸铵完全溶解后于4°C静置I个小时，5000rpm、4°C离心1min;将离心后的沉淀用0.02M pH8.3的Tris-HCl缓冲液复溶至体积为所述小麦芽粉质量的1/5，记作E-3;E-3用0.02M pH8.3的Tris-HCl缓冲液4°C下透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次透析液，透析至用氯化钡(BaCl2)进行检验无沉淀产生。透析完毕的酶蛋白溶液为E-4，4°C保存备用。
[00?0] 4、所述E-4用Q-Sepharose Fast Flow阴离子色谱交换柱进一步分离，平衡缓冲液选用20mmol/L、pH 8.3的Tris-HCl，流速为4.0mL/mind倍柱体积平衡离子交换层析柱后，将E-4上样，用I个柱体积的平衡缓冲液洗脱，采用平衡缓冲液继续洗脱，收集280nm处有紫外吸收的洗脱液为E-5』-5在50mmo 1/L,pH 7.0磷酸缓冲溶液中4°C透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次透析液，透析4次，记录透析完成后E-5的体积，并在透析完成后的E-5中加入硫酸铵固体，至透析后E-5中硫酸铵浓度达到0.6mol/L，得到样液为E_6。
[0011 ] 5、用Phenyl-Sepharose 6Fast Flow疏水柱对所述E-6进行分离，平衡缓冲液选用50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液(含0.6M硫酸铵)，流速为3.0mL/min。疏水层析柱3倍柱体积平衡后，将E-6上样，用l个柱体积的平衡缓冲液洗脱，分别用含有0.5mOl/L、0.4mOl/L、0.3mol/L硫酸铵的50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液进行梯度洗脱，上述每个浓度的磷酸缓冲溶液分别用I个柱体积洗脱，流速为3.0mL/min。然后继续用含0.2mol/L硫酸铵的50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液洗脱，并开始收集280nm处有紫外吸收的洗脱液，并用去离子水在4°C下透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次透析液，透析4次，得到E-7;冷冻干燥，并在-20 °C保存备用。
[0012]6、用Sephacryl S-100HR凝胶柱对所述E-7进行分离纯化，用含0.15mol/L NaCl的50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液作为平衡缓冲液，3倍柱体积平衡后将E_7上样，继续用所述磷酸缓冲溶液洗脱，流速为1.0mL/min，收集280nm处有紫外吸收的洗脱液，用去离子水4°C下透析(透析袋截留分子量3500Da)，冷冻干燥得到小麦芽内切-13-(l，4)-D-木聚糖酶。
[0013]本发明的有益效果是:
[0014]本发明以小麦芽为主要原料，粉碎后经缓冲溶液提取得到木聚糖内切酶粗酶，粗酶液经硫酸铵沉淀、离子、疏水、凝胶柱层析后冷冻干燥获得经SDS-page检测电泳条带单一，分子量27.8kDa内切-13-(l，4)-D-木聚糖酶粉。本发明首次获得小麦源内切-13-(l，4)-D-木聚糖酶，且纯度高，比活高。可用于啤酒酿造业等食品加工业，具有重大的经济效益。
四、【具体实施方式】
[0015]本实施例中小麦芽使用市售啤酒用小麦芽。
[0016]本发明中所用到的相关测定方法:
[0017]1、内切-β-( I，4)-D-木聚糖酶活力测定方法:
[0018](I)样品管:取3mL粗酶液，1.5mL底物溶液[底物为4-0-Methyl-D-xylan dyedwith Remazol Brilliant Blue R，RBB用pH7.0磷酸缓冲溶液溶解至lg/L]溶液至比色管中，40° C反应3h后，用3mL无水乙醇终止反应(4°C静置30min)。
[0019]对照管:取3mL粗酶液加入3mL无水乙醇来钝化酶的活性(4°C静置1min)，40 V反应3h后，加入1.5mL底物溶液。
[0020]将样品管和对照管于5000r/min离心lOmin，上清液在590nm测定吸光值。
[0021](2)计算与结果表达
[0022]木聚糖内切酶酶活单位表示为:每g绝干原料每h在590nm下样品吸光值与对照吸光值差0.01为一个酶活力单位(U)。
[0023]2、蛋白质含量测定方法:双缩脲比色法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。
[0024]3、比活力(u/mg):总酶活力/总蛋白质含量
[0025]4、SDS-PAGE 测定方法:
[0026](I)样品预处理:蛋白质提取液与5 X上样缓冲液按4:1 (v/v)混合，100°C保温lOmin，12000r/min 离心 2min。
[0027](2)制胶:分离胶浓度为15% ;浓缩胶浓度为6%。
[0028](3)上样:样品上样量20yL，蛋白标准品(Marker)上样量5yL。
[0029](4)电泳:恒压100V，待溴酚蓝指示剂迀移至离下端Icm处，停止电泳，约需2?3h。
[0030](5)固定:30min;染色:Ih;脱色:直至蛋白区带清晰为止。
[0031]本实施例中所用到的相关设备:
[0032](I)紫外检测器:8823B-紫外检测仪，北京宾达英创科技有限公司
[0033](2)层析图谱采集分析仪:HD_4A层析图谱采集分析仪，北京宾达英创科技有限公司
[0034](3)冷冻干燥:TF_FD_18冷冻干燥机，上海田楓实业有限公司
[0035]实施例1
[0036]1、成品麦芽磨碎，磨筛孔0.2_1。取40(^麦芽粉，加入16001^ 0.05M ρΗ7.0的磷酸盐缓冲液，在冰浴中搅拌30min，定容至2000mL。溶液转入250mL离心杯中，5000rpm、4°C下离心15min，收集上清液为E-1，于4 V冰箱中贮存。
[0037]2、取1300mL E-1，冰浴并磁力搅拌条件下加入40 %饱和度的硫酸铵(先加少量硫酸铵，等溶解后再加少量，防止局部硫酸铵浓度过高)。硫酸铵完全溶解后4°C静置I个小时，后5000rpm、4°C下离心15min，收集上清液得E-2，体积为1410mL。
[0038]3、E_2中分次缓慢加入60%饱和度的硫酸铵。硫酸铵完全溶解后4°C静置I个小时，后5000rpm、4°C下离心15min，取沉淀，用0.02M pH8.3的Tris-HCl缓冲液复溶至80mL得E_3，E-3用0.02M pH8.3的Tris-HCl缓冲液4°C下透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次透析液，至用BaCl2进行检验无沉淀产生。透析后的溶液E-4在4 °C保存备用。
[0039]4、用Q-Sepharose Fast Flow阴离子色谱交换柱(5.5 X 20cm)对E-4进行分离，平衡缓冲液选用20mmol/L、pH 8.3Tris_HCl，流速为4.0mL/minj倍柱体积平衡离子交换层析柱后，将E-4上样，平衡缓冲液洗脱至完全吸附(I个柱体积)，采用平衡缓冲液继续洗脱，收集280nm处有紫外吸收的洗脱液得到E-5，E-5的体积为25(Μ^Ε-5在50mmol/L、pH 7.0磷酸缓冲溶液中4°C下透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次透析液，透析4次。向透析完毕的E-5酶蛋白溶液中加入硫酸铵固体，使E-5酶蛋白溶液中硫酸铵浓度达到0.6mol/L，得到样液E-6。
[0040]5、用Phenyl-Sepharose 6Fast Flow疏水层析(3.5 X 30cm)分离E_6，平衡缓冲液选用含0.6mol/L硫酸铵的0.05M pH 7.0磷酸缓冲溶液，流速为3.0mL/min。疏水层析柱3倍柱体积平衡后，将E-6上样，用I个柱体积的平衡缓冲液洗脱，分别用含有0.5mol/L、0.4mol/L、0.3mol/L硫酸铵的50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液进行梯度洗脱，上述每个浓度的磷酸缓冲溶液分别用I个柱体积洗脱，流速为3.0mL/min。然后继续用含0.2moI/L硫酸铵的50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液洗脱，并开始收集28011111处有紫外吸收的洗脱液(约1001^)，并用去离子水在4°C下透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次透析液，透析4次，得到E-7;冷冻干燥，并在-20°C保存备用。
[0041 ] 6、用Sephacryl S-100HR凝胶柱分离E-7(I.6 X 80cm)，用含0.15mol/LNaCl的pH
7.0磷酸缓冲溶液(50mmol/L)作为平衡缓冲液，3倍柱体积平衡后将E-7上样，将继续用0.15mol/LNaCl的pH 7.0磷酸缓冲溶液洗脱，流速为1.0mL/min，收集280nm处有紫外吸收的洗脱峰，用去离子水4 °C下透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次透析液，透析4次、冷冻干燥后得到目标酶小麦芽内切-β_( I，4)-D-木聚糖酶。
[0042]经测定，利用本发明制备得到的小麦芽内切-β-(I，4)-D_木聚糖酶的比活力为4.47,进行SDS-PAGE鉴定条带单一，分子量为27.8kDa。
[0043]实施例2
[0044]1、成品麦芽磨碎，磨筛孔0.2111111。取400(^麦芽粉(0.18)，加入1600011^ 0.05MPH7.0的磷酸盐缓冲液，在冰浴中搅拌30min，定容至20000mL。溶液转入250mL离心杯中，5000rpm、4 °C下离心15min，收集上清液为E_1，于4 °C冰箱中IC存。
[0045]2、取13000mL E_1，冰浴并磁力搅拌条件下加入40%饱和度的硫酸铵(先加少量硫酸铵，等溶解后再加少量，防止局部硫酸铵浓度过高)。硫酸铵完全溶解后4°C静置I个小时，后5000rpm、4°C下离心15min，收集上清液得E-2，体积为14000mL。
[0046]3、E-2中分次缓慢加入60 %饱和度的硫酸铵。硫酸铵完全溶解后4 °C静置I个小时，后5000rpm、4°C下离心15min，取沉淀，用0.02M pH8.3的Tris-HCl缓冲液复溶至800mL记作E-3，用0.02M pH8.3的Tris-HCl缓冲液4°C下透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次透析液，至用BaCl2进行检验无沉淀产生。透析后的溶液E-4在4 °C保存备用。
[0047]4、用Q-Sepharose Fast Flow阴离子色谱交换柱(5.5X 100cm)对E-4进行分离，平衡缓冲液选用20mmol/L、pH 8.3Tris_HCl，流速为4.0mL/minj倍柱体积平衡离子交换层析柱后，将E-4上样，平衡缓冲液洗脱至完全吸附(I个柱体积)，采用平衡缓冲液继续洗脱，收集280nm处有紫外吸收的洗脱液约为E-5(E-5的体积约25001^)<^-5在50mmol/L、pH 7.0磷酸缓冲溶液中4°C下透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次透析液，透析4次。向透析完毕的E-5酶蛋白溶液中加入硫酸铵固体，使E-5酶蛋白溶液中硫酸铵的浓度达到
0.6mol/L，得到样液E-6。
[0048]5、用Pheny 1-Sepharose 6Fast Flow疏水层析(3.5X 100cm)分离E-6，平衡缓冲液选用含0.6mol/L硫酸铵的0.05M pH 7.0磷酸缓冲溶液，流速为3.0mL/min。疏水层析柱3倍柱体积平衡后，将E-6上样，用I个柱体积的平衡缓冲液洗脱，分别用含有0.5mol/L、0.4mol/L、0.3mol/L硫酸铵的50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液进行梯度洗脱，上述每个浓度的磷酸缓冲溶液分别用I个柱体积洗脱，流速为3.0mL/min。然后继续用含0.2moI/L硫酸铵的5 O m m ο I / L P H 7.0磷酸缓冲溶液洗脱，并开始收集2 8 O n m处有紫外吸收的洗脱液(约100mL)，并用去离子水在4°C下透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次透析液，透析4次，得到E-7;冷冻干燥，并在-20 °C保存备用。
[0049]6、用Sephacryl S-100HR凝胶柱分离E_7( 1.6 X 100cm)，用含0.15mol/LNaCl的pH
7.0磷酸缓冲溶液(50mmol/L)作为平衡缓冲液，3倍柱体积平衡后将E-7上样，将继续用
0.15mol/LNaCl的pH 7.0磷酸缓冲溶液洗脱，流速为1.0mL/min，收集280nm处有紫外吸收的洗脱液，用去离子水4 °C下透析(透析袋截留分子量3500Da)，每隔4h换一次透析液，透析4次，冷冻干燥即为目标酶小麦芽内切-13_(l，4)-D-木聚糖酶。-20°C保存。
[0050]经测定，利用本发明制备得到的小麦芽内切-β-( I，4)-D_木聚糖酶的比活力为4.55，进行SDS-PAGE鉴定条带单一，分子量为27.8kDa。
【主权项】
1.一种粉末状小麦芽内切-β-( I，4)-D-木聚糖酶的生产方法，其特征在于步骤如下: 1)将小麦芽磨碎，磨筛孔径0.2mm，得到小麦芽粉；向小麦芽粉中按照质量体积比1:4加入0.05M pH7.0的磷酸盐缓冲液，冰水浴中搅拌30min，将搅拌后的混合液用0.05M pH7.0的磷酸盐缓冲液定容至所述小麦芽粉质量的5倍;5000rpm、4°C下离心15min，收集上清液为E-.1; 2)冰水浴并磁力搅拌条件下向所述E-1中加入40%饱和度的硫酸铵;待硫酸铵完全溶解后于4°C静置I个小时，5000rpm、4°C下离心lOmin，收集上清液为E-2，并记录E-2的体积； 3)向所述E-2中加入60%饱和度的硫酸铵，待硫酸铵完全溶解后于4°C静置I个小时，.5000rpm、4°C离心10111；[11;将离心后的沉淀用0.021 pH8.3的Tris-HCl缓冲液复溶至体积为所述小麦芽粉质量的1/5，记作E-3 ；E-3用0.02M pH8.3的Tris-HCl缓冲液4°C下透析，透析袋截留分子量3500Da，每隔4h换一次透析液，透析至用氯化钡(BaCl2)进行检验无沉淀产生;透析完毕的酶蛋白溶液为E-4; 4)所述E-4用Q-SepharoseFast Flow阴离子色谱交换柱进一步分离，平衡缓冲液选用.20mmol/L、pH 8.3的Tris-HCl，流速为4.0mL/min; 3倍柱体积平衡离子交换层析柱后，将E-4上样，用I个柱体积的平衡缓冲液洗脱，采用平衡缓冲液继续洗脱，收集280nm处有紫外吸收的洗脱液为E-5;E-5在50mmol/L、pH 7.0磷酸缓冲溶液中4°C透析，透析袋截留分子量.3500Da，每隔4h换一次透析液，透析4次，记录透析完成后E-5的体积，并在透析完成后的E-5中加入硫酸钱固体，至透析后E-5中硫酸钱浓度达到0.6mol/L，得到样液为E_6 ； 5)用Phenyl-Sepharose6Fast Flow疏水柱对所述E-6进行分离，平衡缓冲液选用含.0.6M硫酸铵的50mmo 1/L pH 7.0磷酸缓冲溶液，流速为3.0mL/min;疏水层析柱3倍柱体积平衡后，将E-6上样，用I个柱体积的平衡缓冲液洗脱，分别用含有0.5mol/L、0.4mol/L、.0.3mol/L硫酸铵的50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液进行梯度洗脱，上述每个浓度的磷酸缓冲溶液分别用I个柱体积洗脱，流速为3.0mL/min;然后继续用含0.2mol/L硫酸铵的50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液洗脱，并开始收集280nm处有紫外吸收的洗脱液，并用去离子水在4°C下透析，透析袋截留分子量3500Da，每隔4h换一次透析液，透析4次，得到E-7; 6)用SephacrylS-100HR凝胶柱对所述E-7进行分离纯化，用含0.15mol/L NaCl的.50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液作为平衡缓冲液，3倍柱体积平衡后将E_7上样，继续用所述磷酸缓冲溶液洗脱，流速为1.0mL/min，收集280nm处有紫外吸收的洗脱液，用去离子水4°C下透析，透析袋截留分子量3500Da，冷冻干燥得到小麦芽内切-13-(l，4)-D-木聚糖酶。
【文档编号】C12N9/42GK105861473SQ201610406915
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】金玉红, 郭宵, 杜金华
【申请人】山东农业大学