专利名称：：海藻酸钠-聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法
技术领域：
：本发明涉及一种固定腈水合酶菌株的方法。
背景技术：
：腈水合酶(Nitrilehydratase，Nhase)酶学分类号为EC4.2丄84，是一类可以催化腈类物质转化成相应酰胺类物质的酶，工业上的主要应用是催化水合丙烯腈生产丙烯酰胺。目前，腈水合酶的固定化在日本主要采用聚丙烯酰胺凝胶包埋切块法，在我国一般采用海藻酸钠包埋法。聚乙烯醇包埋法制备的固定化细胞优点是抗微生物分解性强、机械强调.高、化学性能稳定，缺点是具有自动交联凝聚倾向，成形性和可控性不好。海藻酸钠包埋法固定的微生物具有酶活损失少、机械强度较高、制备简单、对生物的毒性较小等优点，但是在含有多价阴离子以及高浓度电解质溶液中不稳定，尤其在磷酸盐体系中，钙离子容易脱落，小球极易溶解，导致反应批次少，不能进行连续生产。
发明内容本发明的目的是为了解决现有方法固定的腈水合酶菌株酶活损失大、反应批次少的问题，提供了一种海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法。本发明海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法如下一、将质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠、质量浓度为6°/。-9%的聚乙烯醇、浓度为50000cfb/ml80000cfU/ml的腈水合酶菌悬液、硅藻土和活性炭混合均匀，然后将混合溶液滴入质量浓度为3.5%-8%的CaCl2的饱和硼酸溶液中，得到直径为34mm的小球，然后在温度为4°C的条件下将小球固化24h，再滤出小球；二、将步骤一得到的小球置于质量浓度为2%以下的戊二醛溶液中交联20min，即得海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球；其中步骤一中浓度为50000cfu/ml80000cfWml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠的体积比为1:10~30,浓度为50000cfU/ml80000cfU/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为6%-9%的聚乙烯醇的体积比为1:10，浓度为50000cfo/ml80000cfWml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为lml:0.05g~0.12g，浓度为50000cfii/ml80000cfti/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.015g~0.025g。采用本发明方法得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球的相对酶活比海藻酸钠包埋法提高了24.8%，比聚乙烯醇包埋法提高了30.8%。同时，采用海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球可班行7批次连续反应，可实现工业化连续生产。图1是具体实施方式一中不同聚乙烯醇浓度下得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球酶活曲线图。图2是具体实施方式一中不同硅藻土用量得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球酶活曲线图。图3是具体实施方式一中不同活性炭用量得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球酶活曲线屈。图4是具体实施方式一中不同戊二醛浓度下得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球酶活曲线图。图5是具体实施方式二十中不同浓度的聚乙烯醇溶液得到海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球的相对酶活对比图，-令-代表腈水合酶菌悬液的添加量为lml时所得海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球的相对酶活曲线，-國-代表腈水合酶菌悬液的添加量为2ml时所得海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球的相对酶活曲线，-血-代表腈水合酶菌悬液的添加量为3ml时所得海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球的相对酶活曲线，i-代表腈水合酶菌悬液的添加量为4ml时所得海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球的相对酶活曲线，^^代表腈水合酶菌悬液的添加量为5ml时所得海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球的相对酶活曲线。具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式中海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法如下一、将质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠、质量浓度为6%-9%的聚乙烯醇、浓度为50000cfU/ml80000cfU/ml的腈水合酶菌悬液、硅藻土和活性炭混合均匀，然后将混合溶液滴入质量浓度为3.5%-8%的CaCl2的饱和硼酸溶液中，得到直径为3~4mm的小球，然后在温度为4°C的条件下将小球固化24h，再滤出小球；二、将步骤一得到的小球置于质量浓度为2%以下的戊二醛溶液中交联20min，即得海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球；其中步骤一中浓度为50000cfWml80000cfWml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠的体积比为1:1030，浓度为50000cfo/ml80000cfii/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为6%-9%的聚乙烯醇的体积比为1:10，浓度为50000cfo/ml80000cfo/ml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为lml:0.05g~0.12g,浓度为50000cfWml80000cfU/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.015g~0.025g。本实施方式中配制浓度为50000cfo/ml80000cfo/ml的腈水合酶菌悬液所用的腈水合酶菌为由哈尔滨理工大学微生物实验室分离筛选并保藏的腈水合酶产生菌株i^octococcwssp.HUST-3。本实施方式中浓度为50000cfU/ml80000cfo/ml的腈水合酶菌悬液的配制方法如下向lOOOml摇瓶中加入100ml液体培养基，接入10ml培养48h的新鲜菌液，在28"C，200r/min条件下，摇瓶培养96h。然后将发酵液在转速为6000r/min、温度为4"C的条件下离心分离20min后，弃去上清液，再用PBS磷酸缓冲液(pH为7.0)洗涤菌体，在同样的条件下重复离心分离、洗涤操作，采用平板菌落计数法，得到浓度为50000cfo/ml80000cfU/ml的均匀悬液，冰箱保存，备用。本实施方式中不同聚乙烯醇浓度下得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球酶活曲线图如图l所示，由图1可知当聚乙烯醇浓度为7%时，体系的最高相对酶活为82.3%。不同硅藻土用量得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球酶活曲线图如图2所示，不同活性炭用量得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球酶活曲线图如图3所示，由图2图3可知，多孔性物质硅藻土和活性炭的加入都能够提高海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球酶活力。当加入硅藻土的质量与腈水合酶菌悬液的体积比为0.06g:lml时，得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球相对酶活提高到87.6%。当活性炭的质量与腈水合酶菌悬液的体积比为0.02g:lml时，得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球相对酶活可达91.5%，比未加入硅藻土和活性炭得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球的相对酶活提高了9.2%。本实施方式中不同戊二醛浓度下得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球酶活曲线图如图4所示，由图4可知随着戊二醛浓度的提高，酶活小幅度提高并且硬度增强。当戊二醛浓度为1%时，得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球的最高相对酶活为93.1%。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的海藻酸钠的质量浓度为3.5%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfii/ml80000cfb/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠的体积比为1:11~28。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfb/ml80000cfb/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠的体积比为1:1525。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfb/ml80000cfb/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠的体积比为1:20。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的聚乙烯醇的质量浓度为6.8%-8.5%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的聚乙烯醇的质量浓度为6.5%-8%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式八本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的聚乙烯醇的质量浓度为7%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式九本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的饱和硼酸溶液中CaCh的质量浓度为3.8%-7.5%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的饱和硼酸溶液中CaCl2的质量浓度为4.2%-6.5%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十一本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的饱和硼酸溶液中CaCh的质量浓度为4.8%-5.5%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十二本实施方式与具体买施万式一小冋的是歩骤一干饥还的饱和硼酸溶液中CaCh的质量浓度为4%。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十三本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfu/ml80000cfWml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为lml:0.055g0.11g。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十四本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfli/ml80000cfli/ml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为lml:0.07g~0.09g。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十五本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfii/ml80000cfij/ml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为lml:0.06g。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十六本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfU/ml80000cfb/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.016g0.024g。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十七本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfo/ml80000cfWml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.018g~0.023g。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十八本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfu/ml80000cfWml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.019g0.022g。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十九本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中浓度为50000cfU/ml80000cfWml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:0.02g。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式二十采用海藻酸钠包埋法固定腈水合酶菌株的方法如下将质量浓度为3.5%的海藻酸钠溶液与浓度为50000cfii/ml80000cfli/ml的腈水合酶菌悬液按20:1体积比混合均匀，然后用医用注射器将所得混合溶液平稳滴入质量浓度为4%的CaCl2溶液中制成直径2.5~3.5mm的小球，然后在温度为4'C的条件下固化24，即得固定化的腈水合酶菌株。采用本方法所得的固定化的腈水合酶菌株的相对酶活为68.3%,可以进行3批次连续反应。采用聚乙烯醇包埋法固定腈水合酶菌株的方法如下将浓度为50000cfii/ml80000cfii/ml的腈水合酶菌悬液与不同浓度的聚乙烯醇溶液按1:10的体积比混合均匀后，用医用注射器将混合均匀后的溶液平稳滴入饱和硼酸溶液中，再用NaOH溶液调节pH为7.0，然后在温度为4。C的条件下固化24h，即得聚乙烯醇海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球，采用不同浓度的聚乙烯醇溶液得到海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球的相对酶活对比图如图5所示，由图5看出随着菌悬液加入量的增大，相对酶活逐渐升高，当加入4ml菌液时达到最高值，而继续增加菌液浓度，酶活力反而有所下降，同时可以从图5中看出，聚乙烯醇浓度为10%时，相对酶活具有最高值，为62.3%。采用海藻酸钠包埋法、聚乙烯醇包埋法和海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球的反应批次如表1:表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表1可以看出，海藻酸钠包埋法得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球只能进行3批次反应酶活即下降到50%以下，聚乙烯醇包埋法得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球能进行4批次反应，而海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球在经过7批次反应后，活力下降50%左右。这表明在三种海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球中，海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球比其他两种海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球具有更好的操作稳定性、连续性。由图l-4可知采用海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球的相对酶活比海藻酸钠包埋法提高了24.8%,比聚乙烯醇包埋法提高了30.8%。同时，采用海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法得到的海藻酸钠一聚乙烯醇固定化小球可进行7批次连续反应，可实现工业化连续生产。权利要求1、一种海藻酸钠-聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于海藻酸钠-聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法如下一、将质量浓度为3.0％-4％的海藻酸钠、质量浓度为6％-9％的聚乙烯醇、浓度为50000cfu/ml～80000cfu/ml的腈水合酶菌悬液、硅藻土和活性炭混合均匀，然后将混合溶液滴入质量浓度为3.5％-8％的CaCl2的饱和硼酸溶液中，得到直径为3～4mm的小球，然后在温度为4℃的条件下将小球固化24h，再滤出小球；二、将步骤一得到的小球置于质量浓度为2％以下的戊二醛溶液中交联20min，即得海藻酸钠-聚乙烯醇固定化小球；其中步骤一中浓度为50000cfu/ml～80000cfu/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0％-4％的海藻酸钠的体积比为1∶10～30，浓度为50000cfu/ml～80000cfu/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为6％-9％的聚乙烯醇的体积比为1∶10，浓度为50000cfu/ml～80000cfu/ml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为1ml∶0.05g～0.12g，浓度为50000cfu/ml～80000cfu/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为1ml∶0.015g～0.025g。2、根据权利要求1所述的海藻酸钠-聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中所述的海藻酸钠的质量浓度为3.5％。2、根据权利要求1所述的海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中浓度为50000cfii/ml80000cfb/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠的体积比为1:15~25。3、根据权利要求1所述的海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法,其特征在于步骤一中浓度为50000cfti/ml80000cfii/ml的腈水合酶菌悬液与质量浓度为3.0%-4%的海藻酸钠的体积比为1:20。4、根据权利要求1所述的海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中所述的聚乙烯醇的质量浓度为6.5%-8%。5、根据权利要求1所述的海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中所述的聚乙烯醇的质量浓度为7%。6、根据权利要求1所述的海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中所述的饱和硼酸溶液中CaCl2的质量浓度为7、根据权利要求1所述的海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中浓度为50000cfU/ml80000cfb/ml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为lml:0.07g~0.09g。8、根据权利要求1所述的海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中浓度为50000cfU/ml80000cfU/ml的腈水合酶菌悬液的体积与硅藻土的质量比为lml:0.06g。9、根据权利要求1所述的海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中浓度为50000cfti/ml80000cfii/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lml:O.Ol8g~0.023g。10、根据权利要求1所述的海藻酸钠一聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法，其特征在于步骤一中浓度为50000cfii/ml80000cfU/ml的腈水合酶菌悬液的体积与活性炭的质量比为lmH).02g。全文摘要海藻酸钠—聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法，它涉及一种固定腈水合酶菌株的方法。本发明解决了现有方法固定的腈水合酶菌株酶活损失大、反应批次少的问题。本发明方法如下将海藻酸钠、聚乙烯醇、腈水合酶菌悬液、硅藻土和活性炭混合均匀后滴入含CaCl<sub>2</sub>的饱和硼酸溶液中，得到的小球在温度为4℃的条件下固化24h，再滤出小球，然后将滤出的小球放入戊二醛溶液中交联20min。本发明方法得到的海藻酸钠—聚乙烯醇固定化小球的相对酶活比海藻酸钠包埋法提高了24.8％，比聚乙烯醇包埋法提高了30.8％。同时，采用海藻酸钠—聚乙烯醇固定腈水合酶菌株的方法得到的固定化腈水合酶可进行7批次连续反应，可实现工业化连续生产。文档编号C12N11/00GK101358185SQ20081013714公开日2009年2月4日申请日期2008年9月19日优先权日2008年9月19日发明者孙晓君,蕾张,智秦申请人:哈尔滨理工大学