一种基于海藻酸钠寡糖的抗逆保护剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及工业微生物胁迫耐受性领域和海洋多糖/寡糖生物利用领域，具体涉及一种酿酒酵母抗逆保护剂。
【背景技术】
[0002]酿酒酵母因其卓越的产酒性能和良好的生物安全性，在生物能源和食品医药领域(酿酒、发面食品、生物医药等)获得了广泛的应用。特别是近年来，燃料乙醇作为可再生的清洁能源，其生产和使用受到普遍关注，其中以非粮纤维素替代粮食为原料生产燃料乙醇可以有效的解决或缓解粮食危机，缓解石油资源短缺的矛盾，同时也有利于对环境的改善降低空气污染。
[0003]但是，在不同工艺(批次、单级/多级连续、重复批次等)的发酵过程中均存在包括产物抑制和底物抑制在内的环境胁迫，使细胞活性受到不同程度的抑制，从而降低乙醇得率和发酵效率。在利用淀粉质原料超高浓度(Very High Gravity，VHG)乙醇发酵过程中，随着终产物乙醇浓度的提高，乙醇在一众环境胁迫因子中成为最主要的胁迫因素，酵母细胞活性被高浓度乙醇严重抑制甚至出现生长停滞和死亡的现象；同步糖化发酵技术的实现需要酵母耐受高温；以纤维素为原料的乙醇发酵与淀粉或糖质乙醇发酵不同，利用现有技术发酵过程中很难达到对微生物(酵母或细菌)产生抑制作用的乙醇浓度，但木质纤维素预处理环节却成为抑制物主要来源，如弱酸类物质(乙酸)、呋喃醛类等，同时酵母菌会出现氧化胁迫特征。因此，提高酿酒酵母的抗逆性，进而提高细胞活性，获得高乙醇得率和发酵效率具有重要意义。
[0004]海藻酸钠(SodiumAlginate)是海带等褐藻类植物细胞壁的主要组成成分，来源广泛，由古洛糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)相邻或交替排列，被广泛应用于纺织、食品、印染等行业，还被用作固定化载体、增稠剂、稳定剂等。而其降解产物海藻酸钠寡糖(AlginateOligosaccharides, AOS)具有相对于海藻酸钠本身分子量低、易吸收等优点。
[0005]近年来，海藻酸钠寡糖的生物活性广泛受到国内外学者的关注，研究表明海藻酸钠寡糖具有多种生物活性，如促进植物生长和诱导抗逆性的作用、抗氧化活性、抑菌活性、诱导动物细胞因子的产生等，但其应用于酿酒酵母发酵与逆境环境保护还没有报道。
【发明内容】
[0006]为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于海藻酸钠的抗逆保护剂及其制备方法和应用。
[0007]本发明涉及一种基于海藻酸钠寡糖的抗逆保护剂，包括海藻酸钠寡糖和溶剂，所述海藻酸钠寡糖的质量浓度为lyg/mL-10mg/mL。所述的海藻酸钠寡糖由甘露糖酸醛、古罗糖醛酸或二者杂合组成，平均聚合度为5-8，平均分子量在2000-3000之间。
[0008]进一步的，所述溶剂为本领域的任意常规的溶剂，如水或缓冲液，缓冲液比如柠檬酸盐缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液，水优选去离子水。
[0009]所述的抗逆保护剂的制备方法如下:(1)将海藻酸钠溶解于溶剂中作为海藻酸钠底物，海藻酸钠浓度为1-2% (w/v)，向其中加入浓度为0.3%(v/v)的盐酸，在降解温度为90°〇的条件下，降解时间24-36小时；(2)降解完成后离心保留上清液并中和至中性。
[0010]为避免盐分影响抗逆保护剂发挥作用，比如盐分存在会增加酵母的高渗/高盐胁迫条件，故还可先将盐分除去，再将除去盐分的上清液冷冻干燥或喷雾干燥获得海藻酸钠寡糖粉末，得到抗逆保护剂。优选的，海藻酸钠的浓度为1.5%(w/v)，降解时间24小时。
[0011]发明人将抗逆保护剂应用在酿酒酵母抗逆保护中，起到了良好的技术效果，所述的抗逆保护应用包括但不限于在酿酒酵母保藏、发酵及抗胁迫条件下的应用，抗胁迫条件包括高浓度乙醇、高渗、高盐、高温、氧化胁迫、冻融胁迫等所有抑制细胞活性的不利条件。
[0012]进一步的，所述抗逆保护中的应用，其应用方式可以为将抗逆保护剂添加至含酿酒酵母的培养基或缓冲液中，再离心除去抗逆保护剂。更好的，将抗逆保护剂添加至含酿酒酵母的培养基或缓冲液中与酿酒酵母共培养0.5-3小时后，再离心除去抗逆保护剂。
[0013]进一步的，所述抗逆保护中的应用，其应用方式还可以为将所述的抗逆保护剂添加至含酿酒酵母的培养基中，直至发酵终点。
[0014]所述的抗逆保护剂的使用量可根据不同实际需要进行调整，比较适宜的浓度范围为lyg/mL-lOmg/mLo
[0015]本发明的有益效果如下:
[0016](I)本发明提供的抗逆保护剂提高了酿酒酵母应对多种胁迫环境的存活率和细胞活性；
[0017](2)本发明提供的抗逆保护剂缩短了高糖发酵的发酵时间，提高了发酵强度；
[0018](3)本发明提供的抗逆保护剂扩展了海洋来源多糖和寡糖的应用领域。
【附图说明】
[0019]图1为残糖含量变化示意图；
[0020]图2为乙醇含量变化示意图；
[0021 ]图3为保护剂促进酿酒酵母乙醇胁迫下致死率的示意图；
[0022]图4保护剂促进酿酒酵母高温胁迫下致死率的示意图；
[0023]图5保护剂促进酿酒酵母乙酸胁迫下细胞活性的示意图；
[0024]图6保护剂促进酿酒酵母过氧化氢胁迫下细胞活性的示意图；
[0025]图7保护剂促进酿酒酵母冻融的示意图。
[0026]其中:Control为对照组;AOS为抗逆保护剂组。
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。
[0028]酿酒酵母菌在发酵过程中普遍存在产物抑制和底物抑制，使细胞活性受到不同程度的抑制，从而降低乙醇得率和发酵效率的现象，本发明的抗逆保护剂对任意酿酒酵母存在的上述现象均有抗逆保护作用，影响抗逆保护效果的因素主要是抗逆保护剂的使用量、添加时机等因素，本发明实施例使用大连大学实验室酿酒酵母菌Sc4126，对抗逆保护剂的的保护效果进行试验。
[0029]实施例1
[0030]抗逆保护剂的制备
[0031](I)将海藻酸钠溶解于缓冲液中作为反应底物，海藻酸钠浓度为1.5% (w/v)，向其中加入浓度为0