专利名称：利用海藻酸钠－壳聚糖－海藻酸钠微囊包埋细胞或组织的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用微囊包埋细胞或组织的方法，特别是涉及一种利用海藻酸钠—壳聚糖—海藻酸钠微囊包埋细胞或组织的方法。
在微囊技术中，包埋不同的细胞或组织需要采用不同孔径的微囊，以满足不同分子量的物质通过的需要。因此，微囊孔径的大小是非常重要的指标。现有技术中的APA微囊的主要原料是海藻酸钠和聚赖氨酸，在海藻酸钠的分子量确定的条件下，APA微囊的孔径主要决定于聚赖氨酸的分子量。但是，由于聚赖氨酸的分子量不易控制，所以很难制备出不同孔径的APA微囊。而且APA微囊的表面结构呈条索状，造成APA微囊的孔径分布不均匀，影响其通透性。此外，聚赖氨酸的制备工艺相当复杂，特别是在制备大量微囊细胞或组织时，其价格昂贵，难以在临床大量推广应用。
壳聚糖(chitosan)是一种天然高分子直链多糖，它不但具有良好的生物相容性，而且其分子量容易控制。如用壳聚糖取代聚赖氨酸，可望制备出不同孔径的海藻酸钠—壳聚糖—海藻酸钠(ACA)微囊。而且ACA微囊的表面结构为网状，其孔径分布均匀，通透性能良好。此外，壳聚糖的来源丰富，将虾壳、蟹壳等经脱钙、脱蛋白质、脱乙酰基处理后即可制备大量不同分子量的壳聚糖。
为了实现上述目的，本发明利用海藻酸钠—壳聚糖—海藻酸钠微囊包埋细胞或组织的方法，包括混合、成球、包覆壳聚糖、包覆海藻酸钠和洗出游离海藻酸钠五个步骤，即首先将细胞或组织与适当浓度的海藻酸钠溶液混合，然后用氮气切割法或静电液滴法将上述混合液在等渗的氯化钙溶液中形成海藻酸钙微球，然后将海藻酸钙微球投入适当浓度和分子量的壳聚糖溶液中，以包覆壳聚糖，然后再将包覆有壳聚糖的海藻酸钙微球投入适当浓度的海藻酸钠溶液中包覆海藻酸钠，最后将包覆有壳聚糖和海藻酸钠的海藻酸钙微球投入等渗的柠檬酸钠溶液中洗出游离的海藻酸钠并经生理盐水洗涤即获得ACA微囊细胞或组织。
利用本发明可获得不同孔径的ACA微囊细胞或组织，且其孔径分布均匀，通透性能良好。
以下结合利用ACA微囊包埋肝细胞的具体实施例对本发明的技术特征作进一步的详细说明。
a、混合将肝细胞与浓度为1.5～1.8％的海藻酸钠溶液混合，肝细胞与海藻酸钠溶液的体积比为1∶10；b、成球用静电液滴法将上述混合液滴入浓度为1.1％的等渗氯化钙溶液中，以形成海藻酸钙微球，静置后除去上清液并用生理盐水洗涤；C、包覆壳聚糖将上述海藻酸钙微球投入浓度为0.05～0.1％，分子量为1.98×104～6.02×104的壳聚糖溶液中振摇5分钟，静置后除去上清液并用生理盐水洗涤；d.包覆海藻酸钠将上述包覆有壳聚糖的海藻酸钠微球投入浓度为0.15～0.2％的海藻酸钠溶液中振摇5分钟，静置后除去上清液并用生理盐水洗涤；e、洗出游离海藻酸钠将上述包覆有壳聚糖和海藻酸钙微球投入浓度为1.615％的等渗柠檬酸钠溶液中振摇5分钟，以洗出游离的海藻酸钠，静置后除去上清液并用生理盐水洗涤即可获得ACA微囊肝细胞。
利用本发明获得的ACA微囊肝细胞可在培养液中短期保存，也可在液氮中长期保存。
经扫描电镜观察，利用本发明获得的ACA微囊肝细胞的孔径随壳聚糖分子量的增加而递增，其表面结构呈网状。实验证实，ACA微囊包埋红细胞，其红血蛋白释放趋势与APA微囊红细胞相似。ACA微囊肝细胞培养17天内，能稳定释放尿素并能测出GPT，GPT活性第一天出现高峰，之后趋于平稳。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定经真空干燥浓缩后的ACA微囊肝细胞培养液的蛋白质表明，ACA微囊肝细胞在17天内能合成并释放低分子量蛋白质，蛋白质分子量均在7×104以下。ACA微囊肝细胞动物实验表明，与不包囊肝细胞和空囊相比，ACA微囊肝细胞能提高由氨基半乳糖诱发的急性肝功能衰竭大鼠的存活率，延长其存活时间并改善其肝功能。
权利要求
1.一种利用海藻酸钠—壳聚糖—海藻酸钠微囊包埋细胞或组织的方法，其特征在于包括混合、成球、包覆壳聚糖、包覆海藻酸钠和洗出游离海藻酸钠五个步骤，即首先将细胞或组织与适当浓度的海藻酸钠溶液混合，然后用氮气切割法或静电液滴法将混合液在等渗的氯化钙溶液中形成海藻酸钙微球，然后将微球投入适当浓度和分子量的壳聚糖溶液中包覆壳聚糖，然后再将包覆壳聚糖的微球投入适当浓度的海藻酸钠溶液中包覆海藻酸钠，最后将包覆有壳聚糖和海藻酸钠的微球投入等渗的柠檬酸钠溶液中洗出游离的海藻酸钠而获得海藻酸钠—壳聚糖—海藻酸钠微囊细胞或组织。
2.根据权利要求1所述的利用海藻酸钠—壳聚糖—海藻酸钠微囊包埋细胞或组织的方法，其特征在于所述包覆壳聚糖步骤中壳聚糖的分子量为1.98×104～6.02×104。
全文摘要
利用海藻酸钠—壳聚糖—海藻酸钠微囊包埋细胞或组织的方法，包括混合、成球、包覆壳聚糖、包覆海藻酸钠和洗出游离海藻酸钠五个步骤，即首先将细胞或组织与适当浓度的海藻酸钠溶液混合，然后用氮气切割法或静电液滴法将混合液在等渗的氯化钙溶液中形成海藻酸钙微球，然后再将微球先后投入适当浓度的壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液中包覆壳聚糖和海藻酸钠，最后将包覆有壳聚糖和海藻酸钠的微球投入等渗的柠檬酸钠溶液中洗出游离海藻酸钠，即获得不同孔径的ACA微囊细胞或组织。ACA微囊孔径容易控制且分布均匀，通透性能好，故可广泛用于包埋肝、肾上腺、甲状腺、甲状旁腺、性腺等细胞或胰岛等组织。
文档编号C12N11/10GK1454995SQ0211698
公开日2003年11月12日 申请日期2002年4月29日 优先权日2002年4月29日
发明者李涛 申请人:天津市肝胆疾病研究所