专利名称：一种增强单增李斯特菌溶血素o抗原性的核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程领域，具体涉及一种增强单增李斯特菌溶血素0抗原性的核苷 酸序列。
背景技术：
农产品和食品安全是一全球性问题，食源性疾病是食品安全的主要问题。近年来， 国内外食源性疾病事件频频发生，而单增李斯特菌在食源性细菌中毒中占主要地位。李斯 特菌属是最重要的人类食源性病原菌，是90年代食品中四大病原菌之一，在美国被列为7 种主要的食源性致病菌之一。单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较 高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物 很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的 携带率为0. 6-16 %，有70 %的人可短期带菌，4-8 %的水产品、5-10 %的奶及其产品、30 % 以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡 肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红 柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产 道感染胎儿或新生儿，栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能 途径，且有上升趋势。单增李斯特菌是典型的胞内寄生菌，可在巨噬细胞和许多非吞噬细胞(如上皮 细胞、内皮细胞和肝细胞)内增殖。其毒力因子包括李斯特菌溶血素(ListeriolysionO， LL0)，ActA蛋白，磷脂酶C，P60蛋白，PrfA蛋白，内化素，表面蛋白P104。其中LLO是最主 要的毒力因子，由hly基因编码的Hly蛋白，与破坏吞噬体，促进菌体进入胞液有关，是细菌 得以在胞液内增殖的先决条件，它的缺失将会导致细菌毒力的全部丧失。不产生LLO的单 增李斯特菌突变株虽可在非吞噬细胞的胞液中生存一段时间，但却不能繁殖，并且因无法 逃逸吞噬体而不能对其他细胞的感染。除此之外，LLO还参与了同单增李斯特菌致病性有 关的其它反应，研究显示一单增李斯特菌感染鼠脾脏和骨髓的树突状细胞，可导致细胞的 凋亡；不产生LLO的单增李斯特菌突变体不能诱导细胞的凋亡，而提纯的LLO则可引起这种 程序性控可引起这种程序性控制的细胞死亡。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服食品检测中现有技术的不足，采用定点突变提供一种编码单增李斯特溶血素0蛋白的核苷酸基因序列，以提高单增李斯特菌溶血素0蛋 白的抗原性，和显著的提高食品中单增李斯特菌的检测灵敏度，为开发食源性病原菌检测 方法提供有用的侯选基因资源。本发明是依据溶血素0的毒理作用在结合免疫胶体金技术来达到检测单增李斯 特菌的目的。免疫胶体金技术，是90年代新兴的一种免疫学方法，现在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。它实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。 显色程度与抗原含量成正比。本发明的单增李斯特溶血素0蛋白的核苷酸基因序列如SEQ ID No 1所示，首先 通过突变增强单增李斯特溶血素0的抗原性，制得突变用质粒模版一单增李斯特菌溶血素 0核苷酸序列；然后再对该质粒模版进行反向PCR法定点突变，后经Blunting Kination反 应、Ligation反应后即可得到本发明的核苷酸序列。本发明的核苷酸序列的具体制备路线图参见图1。本发明采用定点突变制得的单增李斯特溶血素0蛋白的核苷酸基因序列，能够提 高单增李斯特菌溶血素0蛋白的抗原性，且显著的提高了食品中单增李斯特菌的检测灵敏 度，为开发食源性病原菌检测方法提供有用的侯选基因资源。
图1为本发明的单增李斯特溶血素0核苷酸序列的制备路线图。图2为hly基因PCR扩增结果，其中泳道1_4为hly PCR产物，M为marker DL-2000。图3为hly-T重组克隆质粒PCR鉴定结果，其中1阳性对照；2、3、4重组克隆质粒； 5阴性对照；6空白对照。图4为hly-T重组克隆质粒酶切鉴定结果，其中1 hly_T重组质粒；2、3hly_T双 酶切后(sall/xhol)。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。本发明所用限制性内切酶，定点突变试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限责任 公司，引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成，DNA基因组提取试剂盒，DNA回收试剂 盒与亲和层析柱也购自该公司，其他所用化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。实施例11.PCR 扩增根据NCBI上登录的单增李斯特菌的基因序列，并根据所要连接的载体PMD18-T的 多克隆位点设计引物。在正向引物(Hly-F)加上Sal I位点，在反向引物(Hly-R)加上Xho I位点。引物序列如下正向引物Hly-F 5，-GCGTCGAC(Sail) CCAATTGCGCAACAAACTGA-3，反向引物Hly-R 5，-CCCTCGAG (Xho I) TTTTGCGGAACCACCGTAA-3，PCR反应程序如下94 "C 4min
94 "C3 Osec〕
56。C30sec I 30 Cycles
72 °CImin )72 °C IOmin
PCR反应扩增体系如下ddH2037 μ 1IOXBuffer 5μ 1dNTP (IOmM)5μ 1模板DNA (lOOng/ μ 1)1 μ 1引物(10pm/ μ 1) (20pm/ μ 1) 各 1 μ 1Taq 酶(5υ/μ1)1 μ 1_总体积50 μ 12. PCR产物的电泳和回收用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，电泳结束，将凝胶置于紫外分析仪内，切取 含PCR产物的胶块，用DNA凝胶回收试剂盒回收。3. DNA连接反应在无菌Eppendorf管中加入4 μ 1回收PCR产物，1 μ 1 pMD18_T载体，5 μ 1 Solution 1，总体积为10 μ 1。将各组分混勻，16°C连接过夜。4.大肠杆菌感受态细胞E. coli DH5a的制备挑取大肠杆菌DH5 α单菌落到含有50ml LB培养基的三角瓶中，于37°C振荡培养 过夜；取10 μ 1到含有50ml LB培养基的三角瓶中，37°C振荡培养到0D600值为0. 4-0. 6 ； 将培养好的的菌液转移到50ml的离心管中，冰浴IOmin ；在4°C，5000rpm条件下离心5min， 去上清，收集细胞；用20ml冰预冷的0. IM CaCl2轻轻悬浮沉淀，在冰上放置IOmin ；在4°C， 5000rpm条件下离心lOmin，用2ml 0. IM CaCl2悬浮沉淀，按每管200 μ 1分装细胞悬浮液 于无菌的Eppenforf管中，用液氮快速冷冻，储存于_70°C。5.大肠杆菌的转化在200 μ 1大肠杆菌感受态细胞中加入10 μ 1 DNA连接产物，手指轻弹管壁，混 勻混合物，置于冰上30min ；42°C水浴热激处理90sec，迅速放回冰上，冰浴2-3min ；加入 800 μ 1 LB培养液，混勻，37°C振荡培养Ih ；将混合液涂布在Amp固体LB培养基上，37°C过 夜培养。6.碱法小量制备质粒DNA从培养基平板上挑取含目的质粒的单菌落，接种于3ml含相应抗生素的LB液体培 养基中，振荡培养过夜(37°C，200rpm)。在1. 5ml离心管中，倒入1. 5ml菌液，离心(4°C， 13000rpm, lmin)；去上清，收集菌体，加入100 μ 1预冷的溶液I (50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L Tris-CKpH 8. 0), 10mmol/L EDTA (pH 8. 0))，剧烈振荡，悬浮菌体；加入 200 μ 1 新鲜的 溶液II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS，现配现用)，盖紧管盖并迅速颠倒4_5次至溶液呈透明粘 稠状；加入150 μ 1溶液III (5mol/L KAc 60mL，冰醋酸11. 5mL，H20 28. 5mL)，颠倒数次至白 色絮状沉淀呈均勻分散状，冰浴3-5min ；离心(4°C，13000rpm，15min)，将上清转移到新的 离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混勻并离心(4°C，13000rpm，5min)；将上清液 转入一新离心管中，加入2倍体积无水乙醇混勻，常温放置IOmin后离心(4°C，13000rpm， 2min)；倒去上清，将离心管倒扣在纸巾上，室温放置数分钟，等管壁上的残余乙醇液滴挥发 完全，用 30 μ 1 TE (pH 8.0，含 20yg/ml Dnase-free Rnase Α)溶解 DNA 沉淀，37°C保温30min, DNA保存于_20°C备用。经PCR验证，酶切验证(宝生物工程(大连)有限责任公司)，测序验证后，做为突 变用质粒模板。实施例2单增李斯特菌溶血素0核苷酸序列的定点突变I) PCR 反应1.以抽提大肠杆菌质粒PMD18-T-hly为模板，用突变引物(52-F/52-R)，对其进行 反向PCR扩增，引物序列如下52-F 5' -CAAGGATTCGACTACAATAAAAACA-3，52-R 5' -TATATACTTATCGATTTCATCCGCGT-3，2.配制下列组成的PCR反应液，全量50 μ 1。Pyrobest DNA Polymerase(5U/μ 1) 0.25 μ 1IOXPyrobest Buffer II5μ 1dNTP Mixture (各 2. 5mM)4 μ 1Primer 1 (20 μ Μ)1 μ 1Primer 2 (20 μ Μ)1 μ 1Template0. 01 Ing灭菌蒸馏水up to 50 μ 13.按下列反应条件进行PCR反应。
94"C 30 sec. 55°C30 sec I 30 Cycles
72 °C5 min ‘4.对PCR反应液进行1 % Agarose凝胶电泳。5.切胶回收目的 DNA 片段(DNA Fragment)。II)Blunting KinationJxjS1.在微量离心管中配制下列反应液。DNA Fragment约 IpmolIOXBlunting Kination Buffer 2μ 1Blunting Kination Enzyme Mix 1 μ 1ddH20up to 20 μ 12. 37 °C 反应 10 分钟。3. 70°C反应 10 分钟。III)Ligation 反应1.取约0. 25pmol (5 μ 1)上述的溶液于新的微量离心管中。2.加入 5 μ 1 的 Ligation Solution I,均勻混合。3.16°C 反应 1 小时。4.反应液全量转化至100 μ 1的E. coli DH5 α感受态细胞中。挑取阳性克隆经北京六合华大基因(上海)采用Sanger方法进行测序验证后，获.得增强单增李斯特菌溶血素O抗原性的核苷酸序列的突变基因序列，记为PMD18-T-L52F。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围中。附本发明所涉及的DNA核苷酸序列和蛋白质的氨基酸序列表如下〈110〉上海市农业科学院〈120〉一种增强单增李斯特菌溶血素0抗原性的核苷酸序列<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>SEQ ID No 1〈211>1590<212>DNA〈213> |±曾$其jf牛寺胃(Listeria monocytogenes)〈400〉atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa60caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaaa attcaatttc atccatggca120ccaccagcat ctccgcctgc aagtcctaag acgccaatcg aaaagaaaca cgcggatgaa180atcgataagt atatacaagg attcgattac aataaaaaca atgtattagt ataccacgga240gatgcagtga caaatgtgcc gccaagaaaa ggttacaaag atggaaatga atatattgtt300gtggagaaaa agaagaaatc catcaatcaa aataatgcag acattcaagt tgtgaatgca360atttcgagcc taacctatcc aggtgctctc gtaaaagcga attcggaatt agtagaaaat420caaccagatg ttctccctgt aaaacgtgat tcattaacac tcagcattga tttgccaggt480atgactaatc aagacaataa aatcgttgta aaaaatgcca ctaaatcaaa cgttaacaac540gcagtaaata cattagtgga aagatggaat gaaaaatatg ctcaagctta tccaaatgta600agtgcaaaaa ttgattatga tgacgaaatg gcttacagtg aatcacaatt aattgcgaaa660tttggtacag catttaaagc tgtaaataat agcttgaatg taaacttcgg cgcaatcagt720gaagggaaaa tgcaagaaga agtcattagt tttaaacaaa tttactataa cgtgaatgtt780aatgaaccta caagaccttc cagatttttc ggcaaagctg ttactaaaga gcagttgcaa840gcgcttggag tgaatgcaga aaatcctcct gcatatatct caagtgtggc gtatggccgt900caagtttatt tgaaattatc aactaattcc catagtacta aagtaaaagc tgcttttgat960gctgccgtaa gcggaaaatc tgtctcaggt gatgtagaac taacaaatat catcaaaaat1020tcttccttca aagccgtaat ttacggaggt tccgcaaaag atgaagttca aatcatcgac1080ggcaacctcg gagacttacg cgatattttg aaaaaaggcg ctacttttaa tcgagaaaca1140ccaggagttc ccattgctta tacaacaaat ttcctaaaag acaatgaatt agctgttatt1200aaaaacaact cagaatatat tgaaacaact tcaaaagctt atacagatgg aaaaattaac1260atcgatcact ctggaggata cgttgctcaa ttcaacattt cttgggatga agtaaattat1320gatcctgaag gtaacgaaat tgttcaacat aaaaactgga gcgaaaacaa taaaagcaag1380ctagctcatt tcacatcgtc catctatttg ccaggtaacg caagaaatat taatgtttac1440
gccaaagaat gcactggttt agcttgggaa tggtggagaa cggtaattga tgaccggaac 1500ctaccacttg taaaaaatag aaatatctcc atctggggca ctacgcttta tccgaaatat 1560agtaatagtg tagataatcc aatcgaataa1590<210>SEQ ID No 2<211>529<212>PRT<213> Jll.il^Sjf^g' (Listeria monocytogenes)<400>Met Lys Lys lie Met Leu Val Phe lie Thr Leu lie Leu Val Ser Leu Pro lie151015Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu ASh Ser lie20253035Ser Ser MET Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr Pro lie Glu404550Lys Lys His Ala Asp Glu lie Asp Lys Tyr lie Gln Gly Phe Asp Tyr Asn Lys55606570Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys75808590Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr lie Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser lie95100105Asn Gln Asn Asn Ala Asp lie Gln Val Val Asn Ala lie Ser Ser Leu Thr Tyr110115120125Pro Gly Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val130135140Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser lie Asp Leu Pro Gly MET Thr145150155160Asn Gln Asp Asn Lys lie Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn Asn165170175180Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro185190195Asn Val Ser Ala Lys lie Asp Tyr Asp Asp Glu MET Ala Tyr Ser Glu Ser Gln200205210215Leu lie Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val220225230Asn Phe Gly Ala lie Ser Glu Gly Lys MET Gln Glu Glu Val lie Ser Phe Lys235240245250Gln lie Tyr Tyr Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe255260265 270Gly Lys Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275280285Pro Pro Ala Tyr lie Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu
290295300305Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Val Ser310315320Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn lie lie Lys Asn Ser Ser325330335340Phe Lys Ala Val lie Tyr Gly Gly Ser Ala Lys Asp Glu Val Gln lie lie Asp345350355360Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp lie Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg365370375Glu Thr Pro Gly Val Pro lie Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu380385390395Leu Ala Val lie Lys Asn Asn Ser Glu Tyr lie Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr400405410Thr Asp Gly Lys lie Asn lie Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn415420425430lie Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu lie Val Gln His435440445450Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe Thr Ser Ser lie455460465Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn lie Asn Val Tyr Ala Lys Glu Cys Thr Gly470475480485Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val lie Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu490495500Val Lys Asn Arg Asn lie Ser lie Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr505510515520Ser Asn Ser Val Asp Asn Pro lie Glu ~k ~k ~k525529
权利要求
一种增强单增李斯特菌溶血素O抗原性的核苷酸序列，其特征在于，(1)与现有的单增李斯特菌溶血素O基因相比，在202至205间存在3个碱基突变，序列为SEQ ID NO 1；(2)其编码蛋白序列由529个氨基酸组成，序列为SEQ ID NO 2；(3)其编码蛋白序列第68位氨基酸残基为Phe，序列为SEQ ID NO2。
2.权利要求1所述的增强单增李斯特菌溶血素0抗原性的核苷酸序列在食源性病原菌 检测方法中的应用。
3.权利要求1所述的增强单增李斯特菌溶血素0抗原性的核苷酸序列在提高单增李斯 特菌溶血素0蛋白的抗原性中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种编码单增李斯特溶血素O蛋白的核苷酸基因序列。通过突变增强单增李斯特溶血素O的抗原性，制得突变用质粒模版—单增李斯特菌溶血素O核苷酸序列；然后再对该质粒模版进行定点突变，即制得本发明的核苷酸基因序列。本发明的核苷酸基因序列不但可以提高单增李斯特菌溶血素O蛋白的抗原性，而且还能显著提高乐食品中单增李斯特菌的检测灵敏度，为开发食源性病原菌检测方法提供了有用的候选基因资源。
文档编号C12Q1/04GK101812466SQ20091020107
公开日2010年8月25日 申请日期2009年12月14日 优先权日2009年12月14日
发明者吴潇, 唐雪明, 孙晓飞, 朱宏, 王金斌, 蒋玲曦, 谭芙蓉, 赵凯, 陶世如 申请人:上海市农业科学院