一种区分dna与相应rna的核酸扩增检测方法和检测试剂盒的制作方法

专利名称：一种区分dna与相应rna的核酸扩增检测方法和检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种区分DNA与相应RNA的核酸扩增检 测方法和检测试剂盒。
背景技术：
结核病是严重影响人类健康的慢性消耗性传染病。由于移民、吸毒、人类免疫缺陷 病毒(HIV)与结核杆菌伴发感染、结核杆菌耐多药性及人畜共患传染病等因素，全球每1秒 钟就有1个新感染者出现，每年新发结核病人达850-1000万，300万人死于结核病，且新的 发病率有逐年增加的趋势。目前，全球约有10-20亿人感染结核菌。这给全球结核病防治工 作提出了新的挑战。结核病的严峻形势促使全球基金机构和科学家探讨新的方法来诊断、 预防和治疗结核病。结核病不仅已成为21世纪严重危害人类健康的公共卫生问题，而且也 已成为严重的经济、社会、政治问题。WHO将结核病作为重点控制的传染病，1993年，WHO宣 布“全球结核病处于紧急状态”；1998年，WHO再次指出“遏制结核病行动刻不容缓” ；2000 年3月，WHO与WB在荷兰阿姆斯特丹召开“结核病控制与可持续发展部长会议”。全球80% 结核病人在22个高负担国家，中国是22个结核病高负担国家之一，中国的结核病人仅次于 印度居于第二位，结核病死亡占全球结核病死亡的1/4。我国目前有上亿人感染有结核分枝 杆菌，结核病患者约600万人，每年因治疗不及时造成死亡的人数约25. 6万余人。如果不 尽快改进结核病的控制措施，将有2亿多人发展成活动性肺结核。结核病是病原学清楚、治疗用药方案基本确定的一种疾病。结核分枝杆菌复合群 (MTC)是结核病的元凶，分类学上归属分枝杆菌属(该属分为结核分枝杆菌、非结核分枝杆 菌、麻风分枝杆菌三类150种以上)，该复合群包括人型结核分枝杆菌(M. Tuberculosis)、 非洲结核分枝杆菌(MAfricanum 1、11，主要流行于非洲)、牛型结核分枝杆菌(M. Bovis)、 卡介苗(M. Bovis BCG，为牛型结核分枝杆菌的减毒株，是活菌疫苗，接种量不当可致病)、田 鼠分枝杆菌(M. Microti)、卡氏分枝杆菌(MCanetti)等，均对抗结核药物敏感。非结核分 枝杆菌(NTM)原称非典型分枝杆菌，也是广泛分布的环境分枝杆菌，为条件致病菌(对绝大 多数正常人为非致病菌)，对常用的抗结核药物不敏感。常用的结核病诊断方法为细菌学检查(1)痰涂片镜检法最普遍、最基本的细菌 学检查方法，优点是简单、快速、廉价，当天出结果；缺点是无法辨别死菌活菌，敏感性低，通 常需5000 10000条菌/ml才能够得到阳性结果，特异性差，抗酸杆菌均可着色，阳性只能 说明“分枝杆菌属阳性”，需要进一步试验才可确定。有关镜检法的研究和评价很多，但由于 显微形态学检测原理与方法学的限制，不可能出现突破性的进展。(2)痰常规培养法(罗氏 培养基)是鉴定死菌活菌的可靠方法，被誉为“金标准”。缺点是时间长，需8周才能报出 结果，操作难于标准化，不同实验室报道阳性率差异较为显著；敏感性中等，一般认为大于 100 1000条菌/ml才能够得到阳性结果；特异性中等，各种分枝杆菌均可生长，需结合药 物敏感性试验和分枝杆菌菌种鉴定，才可确定是否为结核菌。(3)药物敏感性试验用于鉴定结核菌对抗菌素药物的敏感性水平。这项试验通常是在痰结核菌培养的基础上进行的， 故需时更长。(4)分枝杆菌菌种鉴定是根据不同分枝杆菌的理化特性，以生物化学的方法 为主。可以精确地鉴定分枝杆菌的不同菌种，但操作复杂，且个别试验使用的药品，有一定 的危险性。(5)痰结核菌快培系统(仪器快速培养BD公司的BACTECTB 460 system及 BACTEC MGIT 960 system) :20世纪70年代发展的一种新的结核病细菌学检查方法-痰 结核菌快速培养、药敏系统。该方法将阳性检出时间较L-J法明显缩短，从常规培养的8周 缩短到3-14d，且具有操作简便、自动化强、灵敏度高等优点，可以检测出大于100 1000条 菌/ml，在结核病的细菌学诊断中起到了重要作用，促进了结核病细菌学诊断的发展。主要 问题是仪器与试剂价格昂贵，检测时间仍然较长，结果可靠性与传统培养法相比仍存有争 议等，还难以用作快速检测。(6)噬菌体生物扩增法灵敏度较高，可达100条菌/ml，但与 细菌培养相比，试验条件更为苛刻，检出率低，因此目前评价不高。上述常规检测方法均因灵敏度低、特异性差、费时费力等诸多原因难以满足早期 诊断与快速诊断的需要。近年来随着分子生物学技术的发展，核酸诊断尤其是荧光PCR(灵 敏度一般为1-10条菌/ml)的广泛应用，使得结核病的快速准确诊断成为可能，已有获得 SFDA医疗器械注册证的荧光PCR产品上市。目前评价较高的商售MTC核酸诊断试剂有三 种，为Roche公司的TB Amplicor (采用PCR技术，检测TB的16S r DNA)、Gen-Probe公司 的 Amplified MTD (采用 TMA 技术检测 TB 的 16S r RNA)、BD 公司的 BD ProbeTec ET (采 用SDA方法扩增，发夹探针杂交技术检测TB的IS6110 DNA和16S rDNA)，其中Amplified MTD被业内公认为与细菌培养符合率最高的核酸试剂，也是当前评价最高的结核核酸诊断 产品。一般认为与其检测对象为RNA而非DNA有关，因为DNA结构稳定，细菌死亡后可以在 很长时间内仍为阳性，而PCR的灵敏度高，有痕量的菌体DNA残留，可测为阳性；RNA半衰期 短，细菌死亡后，很快降解，与细菌的活性相关。简而言之，DNA检测不能区分死菌还是活菌， 合适的RNA检测可以区分死活菌，DNA检测与RNA检测结核杆菌都有其相对的临床意义。然 而，现有的结核诊断尚无一种同步检测其DNA与RNA的试剂，究其原因，在于缺乏一种核酸 扩增方法可以同步特异检测其DNA与RNA，例如PCR方法，由于PCR无法直接对RNA进行扩 增，需经一个逆转录(RT)过程，将RNA转成DNA后再行扩增，无法区分相应的DNA与RNA， 比如RT-PCR法检测16Sr RNA时，其相应的16Sr DNA也被高效地扩增，无法区分检测的是 DNA还是RNA。再如TMA方法，由于采用等温扩增技术，温度较低，染色体DNA没有变性，参 与扩增的是单链RNA，因此，不能直接用作DNA检测，除非扩增前增加一步“高温变性”的步 骤；另外，即使增加了热变性步骤，也无法区分DNA与RNA。单一性检测结核DNA或RNA的 核酸试剂由于不能给出比痰培养更多的信息，专家认为核酸诊断并没有达到预期的效果， 多数学者认为其诊断准确性还不如细菌培养，部分学者甚至并不认可荧光PCR的结果。因此本领域迫切需要一种快速、准确、灵敏的核酸检测试剂，尤其是能够同步检测 结核杆菌DNA与RNA的快速诊断试剂。针对上述情况，我们通过独特设计，建立了一种适合 于国情的结核杆菌复合群DNA与RNA同步检测的新型荧光PCR方法和试剂。

发明内容
本发明的目的在于提供一种检测灵敏度高、检测速度快的能区分DNA和相应RNA 的核酸扩增检测方法和检测试剂盒。
本发明包括提供一种操作简捷快速、可半自动化的总核酸(DNA和RNA)提取试剂， 并提供一种通过实时荧光PCR法区分检测DNA与相应转录RNA的扩增试剂，并以结核病诊 断为例，详述本发明的具体内容。就结核病的致病菌MTC来说，根据本发明的方法，可以得 到结核患者标本中细胞质RNA和染色体DNA相对数量的双重信息，便于了解患者体内结核 杆菌的生长繁殖状态，是死菌还是活菌，同时克服传统微生物检测及蛋白检测的缺陷和不 足，而且弥补了现有国内外诊断产品的缺陷。就基因表达而言，可以借助本发明研究某个基 因与其转录RNA的数量，从而在基因表达调控研究领域获得精准的数据。本发明基本内容如下1.建立了一种专一检测RNA而不能混有其相应DNA信息的方法。本发明的发 明人在长期实践中建立了一种专一检测单链RNA而不能检测其相应DNA的末端序列依赖 TSD-RT-PCR方法，其特征是检测RNA的末端，或者说依赖于RNA末端的存在。原理类似于 真核生物表达文库构建时采用的全长m RNA克隆的SMART技术，但有别于该技术(SMART是 一种对未知序列的m RNA全长进行克隆为目标的扩增技术，而本技术是对已知全长序列的 某基因进行表达研究)。具体如下(如附

图1所示)设计一条与检测RNA末端部分互补的 辅助寡核苷酸，该寡核酸序列由位于5’端的S区与位于3’端的T区组成，其T区序列与检 测靶RNA的末端互补，S区的序列与人工引物一致，S与T中间可隔几个碱基；人工引物是 用作扩增的引物之一，其序列可由设计者自由引入。整个检测体系中含有RT引物、人工引 物、辅助寡核酸、TaqMan探针等4种寡核酸。其中由RT引物与人工引物组成一对有效的扩 增引物对；辅助寡核酸只用作逆转录后的延伸，PCR扩增前为UNG消化降解，不进入扩增检 测环节，为防止辅助寡核酸自行延伸，将其3’端封闭或修饰其自由羟基；TaqMan-MGB探针 用作扩增产物的检测。具体步骤如下a)逆转录与RNA 5’末端转换模板合成RT引物(16R)以16S rRNA为模板，在逆 转录酶作用下延伸，当延伸至5’末端时，与反应体系中的辅助寡核苷酸杂交而通过SMART 机制继续合成至辅助寡核苷酸的5’末端。SMART ^"Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript"
通常用在以微量mRNA为起始模板，逆转录后扩增得到全长cDNA的表达文库构建中。由于 mRNA含有5，帽子结构与3，Poly A，在合成cDNA的反应中事先加入的3，末端带Oligo (dG) 的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5，末端时碰到真核 mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个(dC)，SMART 引物的Oligo (dG)与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶 会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得 到的所有cDNA单链的一端有含Oligo (dT)的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序 列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。该技术实际上是利用逆转录酶内源的末端 转移酶活性。类似地，本发明采用的辅助寡核苷酸其T区相当于Oligo(dG)，S区相当于SMART 引物。当逆转录进行至16S r RNA的5’末端时，转录出的新生链可与预设的单链辅助寡 核酸互补杂交，逆转录酶会自动转换模板，以该互补寡核酸作为延伸模板继续延伸cDNA单 链，直到该互补寡核酸末端。不同之处在于，本辅助寡核苷酸的3’端采用生物素或其它修饰封闭掉可能的延伸反应，为不干扰后续PCR反应，将辅助寡核苷酸中的T以U代替，PCR 开始前的UNG步骤将含U的辅助寡核苷酸清除。辅助寡核苷酸的S区序列可以自由设计， 与用作扩增的“人工引物”序列一致。另外，由于原核细菌RNA的5’末端不含帽子结构，不 能直接应用SMART技术扩增，而可以通过本设计方案进行有效扩增，更为重要的是，相应的 16S rDNA由于不具备上述游离的5’末端而不能被有效扩增(如附图2所示)，所以本项发 明为一种专一检测RNA末端而不能检测相应DNA的方法。b)取上述步骤产生的新模板加入到荧光PCR体系中，体系中的UNG酶将辅助寡核 苷酸消化。c)由“逆转录引物16R”与“人工引物”组成的引物对新模板进行有效的PCR扩增。 用设计于16S rRNA上的特异性TaqMan探针对扩增产物进行实时检测。2.为了同步给出相应DNA的信息，提供结核分枝杆菌染色体核酸的数量，在 RT-PCR体系中引入另一对引物，针对其染色体DNA，且该DNA序列不存在于MTC RNA中。 16S-23S r DNAITS序列和插入序列IS6110序列是最佳的候选之一，因其不被转录，没有 RNA阶段，类似于真核生物断裂基因中的内含子；更为合适地，IS6110序列和ITS序列均为 MTC特异，可以区分于NTM及其它细菌，近年来有较多报道利用IS6110序列或ITS序列作 为MTC的TaqMan探针法PCR特异检测，甚至用作与NTM鉴别检测。为此，本发明还公开了 一种以MTC ITS或IS6110序列为靶基因的TaqMan或TaqMan MGB PCR法检测引物与探针， 用以辅助前述发明的有效实施。3.就结核核酸诊断而言，选择合适的检测靶基因尤为重要，以16s rRNA的5’端区 域最为合适。由于16s rRNA在分支杆菌中的拷贝数为lOOO-lOOOOcopies/cell，因此选择 16s rRNA作为靶序列容易获得很高的检测灵敏度，例如Gen-Probe公司的Amplified MTD 就是以16s rRNA为TMA扩增的靶核酸，临床试验表明其检出率高于Roche的TB Amplicor, FDA批准其为唯一可用于涂阳标本与涂阴标本检测的试剂。但Amplified MTD也有缺陷， 仅能检测16s rRNA而不能检测16s rDNA ；TMA方法学限制，仅能定性检测而不用作定量检 测；价格昂贵。4.就16s rRNA靶序列而言，应选择合适类型的检测探针。设计专一性高的TaqMan MGB探针用作检测MTC的16S r RNA。核糖体是细菌唯一的细胞器，是蛋白质合成的场所。 编码rRNA的基因是按5’16S-23S-5S 3’方式排列的，由两个非编码的间隔区序列(ITS)所 分开。16S rDNA及23S rDNA序列均可作为一个较理想的分类学靶基因。此两段基因序列 均由保守区和可变区组成，由于承担重要的生物学功能因而在进化压力下保持了高度的保 守性，普遍存在于各种细菌细胞内，最能符合通用性的要求，常用于细菌同源性分析，是理 想的引物和探针来源。16S rRNA及23SrRNA基因的保守区对真细菌界的所有细菌均具有 同源性，所以要满足能够检测出所有病原菌的临床需要，可在该区选择探针和引物。而要检 测特异的种，可以在16S rRNA基因的变异区中设计探针与引物在变异区中，科、属、种间 具备特征性变异，可根据需要设计不同分类等级特异的引物和探针，将病原菌鉴别开来，甚 至能设计出型特异的探针。本发明人通过基因序列分析比较及临床试验验证，以16S r RNA 为靶基因，设计出只检测结核复合群的引物和探针。由于可变区内其它非结核分支杆菌也 有同源性较高的核酸序列，与结核复合群的核酸序列区别仅几个碱基，为了取得较高的分 辨率和优秀的信噪比，选用了 TaqMan MGB探针。MGB探针其显著优点是探针短，信噪比好；为非荧光淬灭基团，性能稳定而荧光干扰小；分辨率高，可以区分一个碱基(一个碱基不同 即可引起Tm值的大幅降低如20°C，错配即可为阴性结果，被广泛用于基因的单碱基突变分 析(SNP:Single Nucleotide Polymorphism，即单核苷酸多态性)；而常规的TaqMan探针具 有一定的“容错”能力，单个甚至两个、三个碱基错配有可能不影响到检测，Tm相差不大，结 果仍为阳性，如 Yao Y ( "Evaluation of minor groove binding probeand Taqman probe PCR assays :Influence of mismatches and template complexity onquantification", Mol Cell Probes, 2006)等人研究表明=TaqMan探针可以在高达五个碱基错配时仍有检测 信号，而设计合理的MGB探针有一个碱基错配即无检测信号。通过设计合适的TaqMan MGB 探针来区分结核分支杆菌复合体(MTC)和非结核分支杆菌(NTM)，保证NTM检测结果为阴性 (引物可以扩增MTC和部分NTM)，MTC结果均为阳性。5.本发明还提供了一种快速简捷的核酸提取试剂，以硅胶为吸附核酸的介质，简 单、快速、方便、操作难度低。由胍盐组成的强力裂解液使待测样品中的细胞迅速裂解、蛋白 变性、核酸释放，核酸酶被灭活。加入硅胶颗粒，核酸被吸附，经过洗涤液洗涤两次，吸附有 核酸的硅胶颗粒直接用作逆转录，并在辅助寡核苷酸的作用下完成末端转换模板合成。提 取试剂经过优化，对DNA与RNA均有相同的得率，经证实该试剂对于MTC DNA与RNA具有相 同的提取效率，是一种纯化总核酸的提取试剂。根据上述的发明所述，优选的特异性扩增检测MTC 16S r RNA的引物、TaqMan MGB 探针如下辅助寡核苷酸Hl:5'-ccg cag aac acg ggt tea utt tgt ttg gag agu ttg ate ctg gcu cag g-3'SEQ ID NO 1 ；人工弓丨物 API :5，-ccg cag aac acg ggt tca_3，SEQ ID NO 2 ；逆转录引物 16R :5，-gcc ttg gta ggc cgt cac_3， SEQ ID NO 3 ；检测探针16P :Rl-aag aca tgc ate ccg t_MGB NFQ SEQ ID NO :4。根据上述的发明所述，优选的特异性扩增检测MTC ITS DNA的引物、TaqMan MGB探 针如下ITSF 5' -acc tcc ttt cta agg age acc a_3'SEQ ID NO 5 ；ITSR 5' -gat get cgc aac cac tat cca_3'SEQ ID NO 6 ；ITSP :Rl(R2)-aag aca tgc ate ccg t_MGB NFQSEQ ID NO :7。根据上述的发明所述，优选的特异性扩增检测MTC IS6110 DNA的引物、TaqMan MGB探针如下ISF 5' -ggg tag cag acc tea cct atg-3'SEQ ID NO 8 ；ISR :5，-cgt agg cgt egg tga caa a_3，SEQ ID NO 9 ；ISP :Rl(R2)-tgt cga cct ggg cag g-MGB NFQ SEQ ID NO :10。上述探针中的R 为荧光报告基团，如 FAM、VIC、HEX、ΤΕΤ、JOE、CY3、CY5、NED、ROX 等荧光基团，Rl与R2分别代表两种荧光报告基团，其中的一种为FAM，另一种根据使用的荧 光PCR仪拥有的第二检测波长而定。如ABI7500/7000等，R2优选为VIC ；如MJ0PTIC0N2， R2优选为HEX等，使用者可以根据需要选择合适的R2，使得同管PCR/RT-PCR的两种检测荧 光均为仪器识别(有的仪器需要校正后方能使用)且无干扰。
基于上述核酸扩增检测方法，本发明还提供相应的核酸检测试剂盒。该核酸检测 试剂盒核酸检测试剂盒包含裂解液、核酸提取液、溶菌酶溶液、逆转录缓冲液、逆转录酶系、 结核DNA PCR反应液、结核RNA PCR反应液和质控对照试剂；其中，所述裂解液为裂解细菌 的硫氰酸胍溶液；所述核酸提取液为二氧化硅颗粒；所述PCR反应液含结核DNA/RNA引物、 Taqman-MGB探针和dNTP、耐热聚合酶及缓冲盐溶液；所述逆转录酶系为多酶组份体系；所 述质控对照试剂为选择使用，包括强阳性对照、弱阳性对照、活菌对照、死菌对照；所述阳性 对照为含有结核核酸的一段DNA或RNA ；所述活菌对照为卡介苗；所述死菌对照为灭活的卡 介苗；结合本发明提供的用于MTC RNA/DNA检测的引物、探针，本发明的试剂盒中的组分 如下①裂解液6MGTC,5 % NP_40、5 % Triton X-100U % 肌氨酸钠、50m M Tris-HCI(pH 6.0)②核酸提取液5%SILICA(sigma)③溶菌酶溶液500KU/ml溶菌酶 50 mM Tris-HCI (ρ Η7. 5)④逆转录缓冲液RTBuffer 中含 1. 6m M d NTPs,2mM DTT,4mM MgC12,0. 3 μ M it 转录引物即SEQ ID NO :3。⑤逆转录酶系 υ/μ 1逆转录酶，5υ/μ 1 RNasin，0. 5 μ M辅助寡核苷酸Hl即 SEQID NO :1。⑥MTC-DNA PC R 反应液PCR Buffer 中含 0. 8m M d NTPs,4mM MgC12，0. 1 0· 4μ M 引物探针组合 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7(或 SEQ ID NO 8、SEQ ID NO :9、SEQID NO 10 组合)。⑦MTC-RNA PC R 反应液PCR Buffer 中含 0. 8m M d NTPs,4mM MgC12，0.1 0. 4μΜ 引物探针组合 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO 3, SEQID NO :4。⑧强阳性对照适量基因工程技术获得的DNA及其体外转录的RNA，溶于核酸稳定 储存液。⑨弱阳性对照适量基因工程技术获得的DNA及其体外转录的RNA，溶于核酸稳定 储存液。⑩活菌对照(减毒株)小于lOOng/ml卡介苗，BSA、蔗糖、甘油，含有防腐剂的TE 溶液。经定标后还可制成定量工作标准品。 死菌对照(减毒株)小于lOOng/ml灭活处理的卡介苗，BSA、蔗糖、甘油，含有 防腐剂的TE溶液。经定标后还可制成定量工作标准品。其中组分① ③为标本处理试剂(核酸提取)；组分④ ⑦为核酸扩增检测试剂， ④ ⑦各组分中还包含常规使用的稳定剂和促进剂等。其余为质控对照试剂可根据实际应 用情况选用。检测流程A标本预处理A. 1 痰液A. 1. 1以清晨第一口痰为宜，嘱患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管中。Α. 1. 2痰液中加入2 3倍体积的液化剂(可选用IM NaOH)，振荡混勻，室温置15-30分钟液化。Α. 1. 3取液化后的标本1. Oml至1. 5ml离心管，12000rpm离心5分钟。Α. 1. 4去上清，沉淀加PBS 1ml，混勻，12000rpm离心5分钟。Α. 1. 5去上清，沉淀加PBS 1ml，混勻，12000rpm离心5分钟。A. 1.6去上清，沉淀中加PBS 80 μ 1，混勻后备用。Α. 2肺及支气管灌洗液、尿液、脑脊液、腹水等Α. 2. 1取液体1. Oml至1. 5ml离心管，12000rpm离心5分钟。A. 2. 2去上清，沉淀加PBS 1ml，混勻，12000rpm离心5分钟。A. 2. 3去上清，沉淀中加PBS 80 μ 1，混勻后备用。B.病毒核酸提取B. 1实验前准备B. 1. 1将裂解液置70°C加热5分钟，使试剂瓶内的结晶全部溶解。B. 1. 2配制洗涤液取50ml Corning离心管，加入无水乙醇35ml，补纯化水至 50ml，混勻后室温备用。B. 2实验步骤B. 2. 1取步骤A预处理后的样本，作好标记；另取数个1. 5ml离心管，分别加入 80 μ 1质控对照品，并作好标记。B. 2. 2在上述样本管中加入20 μ 1溶菌酶溶液，混勻后置37。C反应30分钟。B. 2. 3分别加入200 μ 1裂解液，盖上管盖，上下颠倒混勻或振荡混勻。B. 2. 4分别加入20 μ 1核酸提取液，盖上管盖，振荡混勻，室温5 10分钟。B. 2. 5 2000 4000rpmX lmin,去上清。B. 2. 6分别加入500μ 1洗涤液，振荡混勻，使沉淀分散，充分悬起。B. 2. 7 2000 4000rpmX lmin,去上清。B. 2. 8分别加入200μ 1洗涤液，振荡混勻，使沉淀分散，充分悬起。B. 2. 9置4000rpmX lmin,去上清，管壁不得残留液体。B. 2. 10开盖后置60 80°C烘干5 10分钟，目测管内不残留任何液体且固体呈 白色。C.逆转录及末端交换模板合成C. 1逆转录反应液的配制根据待检样品数按逆转录缓冲液逆转录酶系= 19 1的体积比例配制逆转录反应液，混勻后离心，时间5 12秒。C. 2取步骤B. 2. 10中干燥后的沉淀管，加入20 μ 1逆转录反应液。混勻后置42C 反应30分钟完成逆转录及末端交换模板合成反应。D. PCR扩增检测D. IMTC-DNA PCR反应液、MTC-RNA PCR反应液室温下(例如15°C "30 °C )融化混 勻，低速离心，时间可为5 20秒。D. 2将其分别分装至PCR反应管中，每管28 μ 1。D. 3加样在装有PCR反应液的反应管中，用带滤芯吸头分别加入2 μ 1步骤C. 2的 产物，即每个样品MTC-DNA PCR反应管中加2 μ 1，MTC_RNA PCR反应管中加2 μ 1，盖上管盖 后转移到扩增检测区上机。
E.荧光PCR运行参数如下表所示(可参照各类仪器的操作软件自行设置)
权利要求
一种区分DNA与相应转录的RNA的核酸扩增检测方法，其特征在于设计一条与检测RNA末端部分互补的辅助寡核苷酸，该寡核酸序列由位于5’端的S区与位于3’端的T区组成，其T区序列与检测靶RNA的末端互补，S区的序列与人工引物一致，S与T中间可隔几个碱基；人工引物是用作扩增的引物之一，其序列可由设计者自由引入；整个检测体系中含有RT引物、人工引物、辅助寡核酸、TaqMan探针4种寡核酸；其中由RT引物与人工引物组成一对有效的扩增引物对； 辅助寡核酸只用作逆转录后的延伸，PCR扩增前为UNG消化降解，不进入扩增检测环节，为防止辅助寡核酸自行延伸，将其3’端封闭或修饰其自由羟基；TaqMan MGB探针用作扩增产物的检测；具体步骤如下a)逆转录与RNA 5’末端转换模板合成RT引物(16R)以16S rRNA为模板，在逆转录酶作用下延伸，当延伸至5’末端时，与反应体系中的辅助寡核苷酸杂交而通过SMART机制继续合成至辅助寡核苷酸的5’末端；b)取上述步骤产生的新模板加入到荧光PCR体系中，体系中的UNG酶将辅助寡核苷酸消化；c)由“逆转录引物16R”与“人工引物”组成的引物对新模板进行有效的PCR扩增。用设计于16S rRNA上的特异性TaqMan探针对扩增产物进行实时检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在RT-PCR体系中引入另一对引物，16S-23S r DNA ITS序列和插入序列IS6110序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于选择16srRNA的5’端区域为检测靶基因。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用TagmanMGB探针作为检测MTC的 16srRNA的探针。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于特异性扩增检测MTC16S r RNA的引物、 TaqMan MGB探针如下辅助寡核苷酸Hl 5' -ccg cag aac acg ggt tea utt tgt ttg gag agu ttg ate ctg gcu cag g-3'SEQ ID NO 1 ；人工弓丨物 API 5' -ccg cag aac acg ggt tca_3'SEQ ID NO 2 ；逆转录引物 16R: 5，-gcc ttg gta ggc cgt cac_3，SEQ ID NO 3 ；检测探针 16P Rl-aag aca tgc ate ccg t_MGB NFQSEQ ID NO 4 ；特异性扩增检测MTC ITS DNA的引物、TaqMan MGB探针如下 ITSF 5' -acc tcc ttt cta agg age acc a_3' SEQ ID NO 5 ； ITSR 5' -gat get cgc aac cac tat cca~3' SEQ ID NO :6 ； ITSP Rl(R2)-aag aca tgc ate ccg t_MGB NFQ SEQ ID NO -J ； 特异性扩增检测MTC IS6110 DNA的引物、TaqMan MGB探针如下 ISF 5' -ggg tag cag acc tea cct atg-3' SEQ ID NO :8 ； ISR 5' -cgt agg cgt egg tga caa a~3'SEQ ID NO :9 ；ISP Rl(R2)-tgt cga cct ggg cag g-MGB NFQ SEQ ID NO 10 ； 上述探针中，Rl与R2分别代表两种荧光报告基团，其中的一种为FAM，另一种根据使用 的荧光PCR仪拥有的第二检测波长而定。
6.一种用于权利要求1所述检测方法的试剂盒，其特征在于核酸检测试剂盒包含裂 解液、核酸提取液、溶菌酶溶液、逆转录缓冲液、逆转录酶系、结核DNA PCR反应液、结核RNA PCR反应液和质控对照试剂；其中，所述裂解液为裂解细菌的硫氰酸胍溶液；所述核酸提取 液为二氧化硅颗粒；所述PCR反应液含结核DNA/RNA引物、Taqman-MGB探针和dNTP、耐热 聚合酶及缓冲盐溶液；所述逆转录酶系为多酶组份体系；所述质控对照试剂为选择使用， 包括强阳性对照、弱阳性对照、活菌对照、死菌对照；所述阳性对照为含有结核核酸的一段 DNA或RNA ；所述活菌对照为卡介苗；所述死菌对照为灭活的卡介苗。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于特异性扩增检测MTC16S r RNA的引物、 TaqMan MGB探针如下辅助寡核苷酸Hl 5' -ccg cag aac acg ggt tea utt tgt ttg gag agu ttg ate ctg gcu cag g-3'人工引物API 逆转录引物16R 检测探针16P 5' -ccg cag aac acg ggt tca_3， 5' -gcc ttg gta ggc cgt cac~3' Rl—aag aca tgc ate ccg t_MGB NFQ特异性扩增检测MTC ITS DNA的引物、TaqMan MGB探针如下ITSF ITSR ITSP5' _acc tcc ttt cta agg age acc a_3’ 5' -gat get cgc aac cac tat cca~3' Rl(R2)-aag aca tgc ate ccg t_MGB NFQ特异性扩增检测MTC IS6110 DNA的引物、TaqMan MGB探针如下ISF ISR ISP5' -ggg tag cag acc tea cct atg-3' 5' -cgt agg cgt egg tga caa a-3' Rl(R2)-tgt cga cct ggg cag g-MGB NFQ SEQ ID NO 10 ；SEQ ID NO 1 ； SEQ ID NO 2 ； SEQ ID NO 3 ； SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO 5 ； SEQ ID NO 6 ； SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO 8 ；SEQ ID NO 9 ；上述探针中，Rl与R2分别代表两种荧光报告基团，其中的一种为FAM，另一种根据使用 的荧光PCR仪拥有的第二检测波长而定。
全文摘要
本发明属医学检测技术领域，具体为一种区分DNA与相应转录的RNA的核酸扩增检测方法，并提供相应的检测试剂盒。该试剂盒包括裂解液、核酸提取液、溶菌酶溶液、逆转录缓冲液、逆转录酶系、结核DNA PCR反应液、结核RNA PCR反应液等。其中选用的引物分别针对结核杆菌染色体DNA的一段ITS序列或IS6110序列、核糖体RNA上的一段16Sr RNA的序列，探针最好为Tagman MGB探针，并选用不同的荧光素标记。本发明的试剂盒，含有UNG酶组分，可以判定每个细菌内含有16S r RNA的相对量，用来判断标本中的结核杆菌的生长情况以监测感染状态。本发明简便快捷，可专一性RNA及专一性DNA检测，为临床提供更全面的信息。
文档编号C12Q1/68GK101948908SQ20091020098
公开日2011年1月19日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年12月25日
发明者周科隆, 王缦, 袁青 申请人:上海科华生物工程股份有限公司