罗非鱼源无乳链球菌重组BP-2b蛋白疫苗的制备及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子疫苗学领域，具体的说是一种罗非鱼源无乳链球菌重组BP-2b蛋 白疫苗的制备及应用。
【背景技术】
[0002] 无乳链球菌（Streptococcus agalactiae)是一种人畜鱼共患革兰氏阳性菌，能引 起新生儿脑膜炎、牛乳腺炎和鱼类脑膜脑炎。无乳链球菌能感染多种海、淡水鱼类并引起死 亡，给我国乃至世界水产养殖业造成重大经济损失。
[0003] 无乳链球菌编码许多与其致病性相关的毒力蛋白。这些蛋白在病原体感染宿主过 程中起着重要的作用，也能够作为有效的疫苗候选分子（Johri et al.，2006)。目前，关于 研宄发现无乳链球菌毒力因子主要有以下几类：
[0004] 穿孔毒素：已知的GBS编码的穿孔毒素有两种，即β-hemolysin/cytolysin 和CAMP因子。宿主细胞粘附和入侵相关因子：参与此过程的毒力因子比较多，已知 的有纤维蛋白原结合蛋白（Fibrinogen-binding protein A/B，FbsA/B)，层粘连蛋白 (Laminin-binding protein，Lmb)，富含丝氨酸重复蛋白(Serine-rich repeat proteins， Srr)，免疫原性细菌粘附素 （Immunogenic bacteria adhesin，BibA)和菌毛（Pili)等 (Maisey et al.，2008)。免疫逃逸相关分子：这些因子包括唾液酸荚膜多糖（Sialic acid capsular polysaccharide，CPS)、C5a 肽酶（C5a peptidase，ScpB)、丝氨酸蛋白酶（Serine proteinase，CspA)和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SodA)等。以及其他毒 力因子和表面蛋白：比如透明质酸裂解酶（Hyaluronate lyase，HlyB)和蛋氨酸转运调节 子（Methionine transport regulator，MtaR)，还有一些附着在细胞表面的酶与细菌感染 有关，比如稀醇化酶（Enolase)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和葡萄糖 _6_ 憐酸异构酶（Glucose phosphate isomerase，GPI) 等。这些毒力因子都有作为蛋白疫苗的潜力，并且已有研宄证明部分毒力因子作为重组蛋 白疫苗具有一定的保护效果。
[0005] 本试验选用的菌毛Pili，是暴露在细胞表面细长的附属结构，可以促进粘附和定 植宿主细胞的，并介导无乳链球菌对抗菌肽AMPs的抗性（Sauer et al.，2000 ;Maisey et al.，2007)。多菌株基因组比较分析发现无乳链球菌存在3种类型的菌毛岛结构，即Pilus Island l(PI-l)，Pilus Island 2a(PI-2a)和 Pilus Island 2b(PI-2b)，其中 PI-I 基因 位于独立的一个区域，而PI_2a和PI_2b在基因组同一区域的不同位点（Sharma et al.， 2013)。菌毛蛋白包括一个主要的骨架蛋白（Backbone protein，BP)，一个主要的附属蛋白 APl和一个次级附属蛋白AP2。缺失BP的菌株毒力下降，且对吞噬作用和AMPs的易感性升 高，而其具体机制并不清楚。由于菌毛蛋白可以在小鼠体内产生保护性抗体，因而，菌毛蛋 白成为有效的疫苗候选分子（Margarit et al.，2009)。
[0006] 重组蛋白的表达系统包括原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺 乳动物细胞表达系统等，其中原核表达系统因发展完善、流程简洁快速、表达成本低、产量 高而成为疫苗制备的首选表达系统。原核表达系统常用菌株有E. coli和Bacillus，其 中E. coli是目前发展最完善的蛋白表达系统，常用的菌株有BL21(DE3)、BL21(DE3)Star、 Β834ΦΕ3)，这些菌株都是经过特定修饰的适合于表达重组蛋白的工程菌。原核表达载体有 pCoEl、pUC、pMBI、pSC101、pET等，这些载体经修饰后与目的基因连接后导入原核表达菌株， 经过表达条件的优化筛选从而得到完整的原核表达系统。
[0007] 目前在国内已有一些与链球菌疫苗相关的专利。【申请号】200580013779.x，发明名 称：无乳链球菌疫苗公布了一种β溶血性无乳链球菌的完整灭活细胞和该菌培养物的浓 缩提取物制备的组合疫苗通过注射和浸泡两种方式对罗非鱼抗无乳链球菌的免疫保护效 果分别为80%和35%。【申请号】200780025577. 6,发明名称：抗链球菌的联合疫苗公布了一 种联合疫苗，当难辨链球菌和海豚链球菌在疫苗制剂中的比例（基于细胞：细胞）为20 : 1 或40 : 1时，可得到抗难辨链球菌的64%的相对保护率和抗海豚链球菌的71 %的相对保 护率。【申请号】201080047156. 5,发明名称：链球菌组合疫苗公布了一种组合疫苗，包含无 乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和血清型III细胞的组合疫苗提供针对罗非鱼抗无乳链 球菌生物型1血清型Ia的88. 9%保护率和抗罗非鱼无乳链球菌生物型1血清型III的 92%的保护率。【申请号】201010207289. 6,发明名称：罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方 法公布了一种罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌等体积混合二联疫苗的制备过程。【申请号】 201210337267. 0,发明名称：一种预防罗非鱼链球菌病的疫苗，该发明公布了一种无乳链球 菌全菌灭活疫苗通过浸泡、注射和口服免疫罗非鱼后最高分别能达到60%、90%和75%的 免疫保护率。【申请号】201410121138. 7,申请名称：一种无乳链球菌的口服疫苗及其制备方 法。该发明构建一种表达无乳链球菌sip蛋白的重组减毒沙门氏菌，将其拌料投喂罗非鱼 后最高可获得63 %的抗无乳链球菌免疫保护率。
[0008] 以上公开使用的无乳链球菌疫苗均是单一或是二联全菌灭活疫苗，制备出的疫苗 免疫效力与疫苗菌株的免疫原性直接相关，并且只对血清型一致的无乳链球菌有效，对海 豚链球菌没有效果。而本发明希望获得一种有效的重组蛋白疫苗，能够对罗非鱼抗无乳链 球菌不同血清型产生特异性的保护性。该重组蛋白疫苗的制备方法简单、制备过程安全，疫 苗对罗非鱼抗无乳链球菌的免疫保护率达到41. 93%。
【发明内容】
[0009] 本发明目的在于提供一种来源于罗非鱼的无乳链球菌BP-2b基因编码的重组 BP_2b蛋白的制备及应用，并作为重组蛋白疫苗来防治罗非鱼无乳链球菌病。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0011] 一种来源于罗非鱼的无乳链球菌BP-2b基因编码的重组BP-2b蛋白，其特征在于： 所述的BP-2b重组蛋白的编码基因是从罗非鱼的无乳链球菌中克隆得到的，所述罗非鱼的 无乳链球菌重组BP-2b蛋白具有氨基酸序列为序号1。
[0012] 一种来源于罗非鱼的无乳链球菌BP_2b基因编码的重组BP_2b蛋白，包括以下步 骤：
[0013] (1)引物设计：
[0014] 以来源于罗非鱼的无乳链球菌为模板，设计一对包含限制性内切酶的引物 BP-2b-F 和 BP-2b-R，序列如下：
[0015] BP-2b-F:5, -CGCGGATCCGCTGAGACAGGGACAAT-3'
[0016] BP-2b-R : 5，~CCGCTCGAGACCACCTGTTGAAGGCA~3'
[0017] 上游引物BP-2b-F下划线部分是BamH I酶切位点，下游引物BP-2b-R下划线部分 是Xho I酶切位点。
[0018] (2)BP_2b 基因克隆
[0019] 提取罗非鱼的无乳链球菌基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR反应。PCR反 应体系为：25μ1反应体系含ΙμL模板DNA，lyl IOXPCR Buffer，lyl PCR反应。PCR 反应体系为：25μ1 反应体系含 ΙμL 模板 DNA，lyl 10XPCRBuffer，lyl dNTP，0.5yM BP-2b-F，0.5yM BP-2b-R，0.25yl rTaq，加灭菌蒸馏水至 25μ1。PCR条件为：94°C 预变性 51^11;然后94°0变性3〇8,55°0退火6〇8,72°0延伸21^11下作用30个循环 ；最后72°0延伸 lOmin。PCR产物回收纯化后与pMD18-T载体连接，16°C下连接12h。连接体系为：10μ1体 系内含4μ1 PCR 产物，ΙμL pMD18-T Vector，5yl Solution I。将 ΙΟμΙ 连接产物转入 50 μ 1大肠杆菌TGl感受态细胞，冰浴30min，42°C热激60s，然后加入840 μ I LB液体培养 基，37°C震荡培养2h，取100 μ 1混合液加入含有100 μ g/ml氨苄青霉素（Amp+)的LB固体 培养基上，涂布均匀后在37°C培养24小时。随机挑取平板上的10个单菌落进行菌落PCR 鉴定，鉴定结果为阳性的单菌落即为BP-2b克隆菌株。
[0020] (3)重组质粒pET28-BP-2b的构建
[0021] 提取BP-2b克隆菌株质粒，将质粒和表达载体pET28a(+)分别用BamH I和Xho I 进行双酶切，双酶切体系为：1〇〇μ1总体积含1〇μ1 l〇XBuffer，5yl BamH Ι，5μ1 Xho I，30μl质粒或pET28a(+)，50μl不含核酸酶的水。37°C水浴12h。将酶切产物胶回收，连 接BP-2b基因片段和pET28a (+)，16°C连接12h，连接体系为：10 μ 1连接体系含4 μ I BP-2