专利名称：：食品中李斯特氏菌属微生物检测试剂盒及检测方法
技术领域：
：本发明涉及食品中李斯特氏菌属微生物检测试剂盒及检测方法。尤其是基于mPCR-DHPLC技术检测食品中李斯特氏菌属微生物的检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
：李斯特氏菌为腐生菌，在自然界中广泛分布，主要生存于土壤和腐生植物中，多种动植物食品、人畜排泄物、污水和青储饲料中均可检出。人和多种动物都可成为其宿主。人类粪便携带率达0.61.6%，人群中短期带菌者占70%。引起李斯特氏菌病爆发的食品主要有乳及乳制品、肉类制品、水产品以及蔬菜水果，其中乳及乳制品最为常见。食品被污染和中毒发生的原因李斯特氏菌是近年来己被重视的病原菌。食品作为传播李斯特氏菌的媒介亦渐被重视。世界卫生组织(WHO)关于单增李斯特氏菌食品中毒报告中指出，4%8%的水产品、5%10%的乳及乳制品、30%以上的家禽均被该菌污染。由于该菌在4。C冰箱保存的食品中也能生长繁殖，使其危害性更进一步增大。食品中存在的单核细胞增生李斯特氏菌对人类的安全有潜在的危险。由于此菌在环境中普通存活，广泛分布，在海水、淡水、土壤、粪肥、垃圾、饲料甚至甲壳动物、蝇中可分离到，能在大多数非酸性食品中生长、繁殖。在牛奶、蔬菜、青贮饲料和土壤中存活的时间比沙门氏菌长，并且存活率高；巴氏消毒不易杀灭此菌；耐盐性较强，25%NaCl环境中仍可存活，对多种物质有较强的抵抗力；不易被寒冷日晒等强烈因素所杀灭，对热的耐受力比一般无芽胞杆菌强，在4"C的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。单核细胞增生李斯特菌是嗜冷菌，在0"C50'C条件下均能生长。尽管30°C37'C是它最佳生长温度，但在冰箱温度条件下仍能生长。低于3'C时在磷酸蛋白胨肉汤、4"C牛奶中和0"C在肉中可存活1620天。而最新的分类学研究表明，李斯特氏菌属分为六个种单核细胞增生李斯牛寺氏菌(丄&ten.awo"oc;^oge"es)、绵羊李其Jf牛寺氏菌(ZiWer/"/va"ovz7)、英i若克3李斯特氏菌(Z/Wen'a细ocMa)、西尔李斯特氏菌(i^fer/awe/^^7')、烕尔斯李斯牛寺氏菌(丄&fen'awe/W/weW)以及格氏李斯年寺氏菌(丄^ten'agray/)、在这6个种中，单核细胞增生李斯特氏菌对人类致病性强，绵羊李斯特氏菌对人类也有一定的致病性，其余李斯特氏菌无致病性。然而，最近国内外有文献报道，食品中的英诺克李斯特氏菌也对人类具有一定的潜在致病性。有报道，2003年曾在广东省采集深圳、番禺、湛江、澄海、韶关五个地区的9类食品共430份中，检出单核细胞增生李斯特菌17株，英诺克李斯特菌1株，因而应加强相关的食品卫生监督管理。食品中李斯特氏菌引起食源性疾病的预防与控制已引起了世界各国关注，而食品中李斯特氏菌的检测技术是预防与控制的关健的技术环节。细菌的鉴定是一项既耗时又复杂的工作，由于细菌的生化特征相对的不稳定，给细菌的鉴定带来了很大的困难和不确定性，同时由于某些生化试剂、血清等质量不稳定、特异性不好等因素，经常给鉴定的结果带来不准确性。目前国内外常用的细菌鉴定卡如API，尽管质量稳定，但鉴定时人为影响因素较多，往往不同的操作者结果不一；细菌的自动鉴定仪器重现性较好，但由于只是局限在几个生化反应，相似的菌株间鉴别特别困难；荧光免疫检测法(VIDAS)检测成本极高，且存在着假性结果的问题；PCR-凝胶电泳检测技术虽然检测成本低，但存在着反应产物后处理极易造成污染的缺点；实时荧光PCR技术具有特异性强，灵敏度高等优势，但却存在着检测成本较高，荧光探针保存时间较短等不足。而目前食品中李斯特氏菌的检测仍以传统的病原菌培养、血清抗体检测、和生化特征比较水平为主，虽然已建立了许多基于分子生物学的检测方法，例如PCR、基因芯片、测序等，但还是不能满足日益发展的检验检疫工作的需要。常规分离培养是各种微生物检测的标准，但耗时长，工作量大，灵敏度低，尤其是其他非致病性的李斯特氏菌经常伴随着并抑制了单核细胞增生李斯特菌在培养基中的生和培养，使李斯特氏菌致病菌株的培养和检测带来困难；血清学方法简单快速，但因血清质量问题特异性差，假阳性高；PCR技术简单快速，灵敏度高，但工作量大，操作繁琐，通量低；基因芯片通量高，但也易造成假阳性，费用昂贵。因此非常必要建立高效、特异、准确、快捷、成本低廉的快速检测技术方法，从而在属、种、血清型、流行株的水平上，达到对食品中李斯特氏菌属、致病菌种、血清分型、流行株及李斯特氏菌属分类种的分种鉴别的高通量检测目的。
发明内容本发明首先提供用于快速检测食品中李斯特氏菌的基于PCR-DHPLC检测的试剂盒。本发明所述的试剂盒中包括一种检测溶液，该检测溶液中含10mMTris《1、50mMKC1、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/)iL及李斯特氏菌引物对10)iM;其中，李斯特氏菌的特异性引物对序列如下菌株上、下游引物序列(5'-3')扩增产物(bp)李斯特氏菌5'画GTTAGTGGCGGACGGGTGAG-3'5'画TCAGGTCGGCTATGCATCGT-3'210本发明还提供了利用上述试剂盒检测词料中李斯特氏菌属微生物的mPCR-DHPLC方法，包括如下步骤①PCR反应取lul待测样品DNA溶液，加入10ul检测溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul;将以上各组分加入0.2mLPCR反应管中，混匀，5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR循环预变性94°C，3min;进入循环94。C变性60s，60。C退火60s，72。C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min;②将PCR扩增产物进行DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mmx50mm，粒度3柱温5965°C;流动相(体积比)O.Omin，53.7%缓冲溶液A，46.3%缓冲溶液B;0.5min，48.7%缓冲溶液A，51.3%缓冲溶液B;5.0min，39.7%缓冲溶液A，60.3%缓冲溶液B;其中，缓冲溶液A是浓度O.lmM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1MTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;检测器荧光检测器，光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s;上样量PCR产物5pL。其中，部分变性条件下的DHPLC检测，柱温优选6rC。本发明采用mPCR结合部分变性条件下的DHPLC技术，针对食品中李斯特氏菌属微生物进行灵敏便捷的检测，并建立应用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测食品中李斯特氏菌属微生物，并且检侧耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。本发明附图17幅，其中图1是李斯特氏菌属6个分类种的mPCR-DHPLC图谱，分别是单增李氏菌(A)、绵羊李氏菌(B)、英诺克李氏菌(C)、西尔李氏菌(D)、威尔李氏菌(E)、格式李氏菌(F);图2是单增李氏菌(A)和绵羊李氏菌(B)组合检测的图谱；图3是单增李氏菌(A)和英诺克李氏菌(B)组合检测的图谱；图4是单增李氏菌(A)和西尔李氏(B)菌组合检测的图谱；图5是单增李氏菌(A)和威尔李氏菌(B)菌组合检测的图谱；图6是单增李氏菌(A)和格式李氏菌(B)菌组合检测的图谱；图7是李氏菌属6种分类菌种共同检测的图谱，图中分别是格式李氏菌(A)、威尔李氏菌(B)、西尔李氏菌(C)、英诺克李氏菌(D)、单增李氏菌(E)、绵羊李氏菌(F);图8是单增李氏菌精密度试验mPCR-DHPLC谱图；图9是绵羊李氏菌精密度试验mPCR-DHPLC谱图；图10是英诺克李氏菌精密度试验mPCR-DHPLC谱图；图ll是西尔李氏菌精密度试验mPCR-DHPLC谱图；图12是威尔李氏菌精密度试验mPCR-DHPLC谱图；图13是格式李氏菌精密度试验mPCR-DHPLC谱图；图14是实施例5样品1的mPCR-DHPLC检测图谱，图中分别是单增李氏菌(A)和格式李氏菌(B);图15是实施例5样品2的mPCR-DHPLC检测图谱，图中分别是单增李氏菌(A)和绵羊李氏菌(B);图16是实施例5样品3的mPCR-DHPLC检测图谱，图中是英诺克李氏菌(A);图17是实施例5样品4的mPCR-DHPLC检测图谱，图中分别是单增李氏菌(A)和英诺克李氏菌(B).;上述附图中，横坐标均为保留时间(单位分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度(单位毫伏mV)。具体实施方式下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器及其商品来源为营养肉汤培养液，普通琼脂培养平板，以及本部分所使用的各菌株的增菌、分离和生化鉴定培养基等均按照相关的国家标准(GB)、检验检疫行业标准(SN)或国际权威标准方法中的配方，购于美国BD公司。细菌基因组DNA提取试剂(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)及ExTaq等试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；三乙胺乙酰盐(TEAA，色谱纯)购自Transgenomic公司；乙腈(色谱纯)购自Fisher公司。基因扩增仪(美国ABI公司)；变性高效液相色谱(简称DHPLC，美国Transgenomic公司)。本部分试验所使用的标准菌株分分别购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)或由中国检验检疫科学研究院菌种保藏中心(IQCC)提供。如表1所示表1序号菌株名称拉丁名1单核细胞增生李斯特氏菌(la血清型)2单核细胞增生李斯特氏菌(2a血清型)3单核细胞增生李斯特氏菌(4a血清型)4单核细胞增生李斯特氏菌(4b血清型)单核细胞增生李斯特氏菌(4e血清型)6单核细胞增生李斯特氏菌了单核细胞增生李斯特氏菌(1/2a血清型)8单核细胞增生李斯特氏菌(1/2b血清型)Z/欲r/"附(7/(7C，,(9^/7^5*79单核细胞增生李斯特氏菌(3a血清型)10单核细胞增生李斯特氏菌(3b血清型)11单核细胞增生李斯特氏菌(4c血清型)12单核细胞增生李斯特氏菌(4d血清型)13绵羊李斯特氏菌14英诺克李斯特氏菌15威尔斯李斯特氏菌16西尔李斯特氏菌17格氏李斯特氏菌18脱氮李斯特氏菌19单核细胞增生李斯特氏菌20绵羊李斯特氏菌21英诺克李斯特氏菌22威尔斯李斯特氏菌23西尔李斯特氏菌24格氏李斯特氏菌25霍乱弧菌01群26霍乱弧菌0139群27霍乱弧菌非01/非0139群28副溶血性弧菌29溶藻性弧菌30创伤弧菌31拟态弧菌32梅氏弧菌33河弧菌34嗜水气单胞菌35类志贺邻单胞菌36鼠伤寒沙门氏菌37猪霍乱沙门氏菌38猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种39肠炎沙门氏菌40绿脓杆菌(铜绿假单胞菌)41荧光假单胞菌尸srai/o腳was1y7wo，cgra42阪崎肠杆菌43大肠埃希氏菌44肠出血性大肠埃希氏菌0157:H745产肠毒素大肠埃希氏菌46肠致病性大肠埃希氏菌47肠侵袭性大肠埃希氏菌48摩根氏摩根氏菌49产酸克雷伯氏菌50肺炎克雷伯氏茼51弗劳地柠檬酸杆菌52阴沟肠杆菌53阪崎肠杆菌54产气肠杆菌55福氏志贺氏菌56金黄色葡萄球菌57小肠结肠炎耶尔森氏菌58溶血性链球菌59普通变形杆菌60奇异变形杆菌61空肠弯曲菌实施例l、食品中李斯特氏菌属微生物检测试剂盒及检测方法(1)引物的设计、合成与试剂盒的组装菌株上、下游引物序列(5'-3')扩增产物(bp)李斯特氏菌5'-GTTAGTGGCGGACGGGTGAG-3'5'隱TCAGGTCGGCTATGCATCGT-3'210在此基础上，设计用于PCR-DHPLC检测的试剂盒该试剂盒中包括一种检测溶液，该检测溶液中含10mMTris'Cl、50mMKC1、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/nL及上述李斯特氏菌引物对10pM。.(2)PCR-DHPLC检测方法的建立本检测方法使用本实施例建立的PCR-DHPLC检测的试剂盒，包括如下步骤①待检样品的制备建立表1菌株的DNA模板库用于以下实施例试验按传统的培养方法分别增菌培养表l中的菌株。取参考菌株的细菌培养液lmL，采用细菌DNA提取试剂盒(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)提取细菌DNA，保存于-20'C备用以待检测。使用前，取表l中所列试验菌种，经培养后分别提取基因组DNA，建立模板库。弧菌接种于3XNaCl营养肉汤中(37士i:rC培养1824h，弯曲菌属的菌株在布氏肉汤中，于42"微需氧环境下培养(5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气)24h。其他的菌株在胰蛋白胨大豆肉汤中，于37。C培养24h。②PCR扩增取lul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒检测溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul;将以上各组分加入0.2mLPCR反应管中，混匀，5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR循环预变性94°C，3min;进入循环94。C变性60s，6(TC退火60s，72'C延伸60s，35次循环;终止延伸72°C，7min;③DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mmx50mm，粒度3柱温61°C;流动相(体积比)O.Omin，53.7%缓冲溶液A，46.3%缓冲溶液B;0.5min，48,7%缓冲溶液A，51.3%缓冲溶液B;5.0min，39.7%缓冲溶液A，60.3%缓冲溶液B;其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1MTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;检测器荧光检测器，光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s;上样量PCR产物5lLlL。实施例2、特异性试验(1)以标准李斯特菌为检测原料，按照实施例1所建立的试剂盒及方法对六种菌进行检测，检测结果如附图17所示。李斯特氏菌引物在6rc部分变性的检测结果图谱。由图i可见，单增李氏菌、绵羊李氏菌、英诺克李氏菌、西尔李氏菌、威尔李氏菌、格式李氏菌均达到了部分变性的差异检测效果。6种菌在6rc部分变性条件下，从各自差异基因位点不同程度地解链，随着片段的解链域不同，各自核苷酸片段在TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的垸基发生疏水作用力相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同性质的6种菌种核苷酸片段分子的分离，因而各自出现了特异性的分离图谱，可以很明显地从检测图谱上将6种菌种区分开来。如图l-A所示，单增李斯特氏菌在4.8min和5.5min出现吸收峰；如图l-B所示，绵羊李斯特氏菌在5.2min出现吸收峰；如图1-C所示，英诺克李斯特氏菌在4.9min和5.5min出现吸收峰；如图l-D所示，西尔李斯特氏菌在4.9min和5.3min出现吸收峰；如图l-E所示，威尔李斯特氏菌在5.2min和5.5min出现吸收峰；如图1-F所示，格氏李斯特氏菌在5.5min出现吸收峰。且各种李斯特氏菌株的吸收峰型具有明显差异，可以清楚区分。图2图7分别显示了不同的李斯特菌的混合检测的结果。实施例3、灵敏度试验分别取李氏菌属6个分类菌种标准菌株，加入10mL的营养肉汤培养液于37X:振荡培养过夜。用比浊法定量所培养的6种李氏菌的菌液浓度。首先用麦氏比色管试剂盒制作OD550值——每mL菌液里的细菌个数的标准曲线，再测定所培养菌液的OD550值，将OD55。值代入标准曲线，得到所培养菌液的浓度，单位为CFU/mL。把菌液稀释成lxlO'CFU/mL、lxl02CFU/mL、lxl03CFU/mL、lx104CFU/mL、lxl05CFU/mL、lxl06CFU/mL等梯度。将几个梯度的6种李氏菌菌液采用细菌DNA提取试剂盒(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)提取DNA，各取2|_iL做为模板，按照实施例1所建立的方法进行PCR-DHPLC检观U，将检测结果与稀释梯度结果比较，确定检测灵敏度。灵敏度试验结果表明实施例1所建立的方法检出李氏菌属6个分类菌种的灵敏度可达到103CFU/mL菌浓度。实施例4、精密度试验取在灵敏度试验中以"比浊度法"制备的1X103CFU/mL浓度的6种李氏菌菌液，按照实施例1所建立的方法进行10次重复DNA提取及PCR-DHPLC检测，以确定方法的精密度。li检测结果如附图813所示，结果显示，本发明的方法检测精密度非常高。实施例5、在实际样品检测中的应用试验自2008年1月至2008年5月，将上述建立的李斯特氏菌的mPCR-DHPLC检测试剂盒及检测方法用于实际样品中李斯特氏菌的检验，同时采用国家标准方法(GB/T4789.30-2003)进行比较。试验统计结果如表2所示<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>经统计，用mPCR-DHPLC方法检出的26份阳性样本采用经典的国家标准(GB)方法验证，均证实为阳性。mPCR-DHPLC方法检测出的阴性结果与GB方法结果符合。试验中mPCR-DHPLC方法吻合率为100%,显示该方法具有广泛而且良好的适用性。本实施例中，使用GB/T4789.30-2003的方法，检测每个样品平均总耗时(包括样品制备)168h，检测耗时(不包括样品制备)167h;使用mPCR-DHPLC方法，检测每个样品平均总耗时(包括样品制备)25h，检测耗时(不包括样品制备)0.5h。下面为实际样品检测中的部分具体试验。(1)从样品1的增菌后的MMA平板上选取疑似李氏菌的多个单菌落，分别接种于三糖铁琼脂斜面备用于生化鉴定，另取这些菌落同时接种于同一管的营养肉汤中，培养2448h后，取10mL以实施例1的方法提取DNA并mPCR-DHPLC检测。结果显示检出如附图14所示的单增李氏菌和格式李氏菌的特征图谱。为验证该检测结果的准确性，从接种于三糖铁上的菌落中，经生化鉴定，确实分离出了单增李氏菌和格式李氏菌的分离株。(2)从样品2的增菌后的MMA平板上选取疑似李氏菌的多个单菌落，分别接种于三糖铁琼脂斜面备用于生化鉴定，另取这些菌落同时接种于同一管的营养肉汤中，培养2448h后，取10mL以实施例1的方法提取DNA并mPCR-DHPLC检测。结果显示检出如附图15所示的单增李氏菌和绵羊李氏菌的特征图谱。为验证该检测结果的准确性，从接种于三糖铁上的菌落中，经生化鉴定，确实也分离出了单增李氏菌和绵羊李氏菌的分离株。(3)从样品3的增菌后的MMA平板上选取疑似李氏菌的多个单菌落，分别接种于三糖铁琼脂斜面备用于生化鉴定，另取这些菌落同时接种于同一管的营养肉汤中，培养2448h后，取10mL以实施例1的方法提取DNA并mPCR-DHPLC检测。结果显示检出如附图16所示的英诺克李氏菌的特征图谱。为验证该检测结果的准确性，从接种于三糖铁上的菌落中，经生化鉴定，确实分离出了英诺克李氏菌的分离株。(4)从样品4的增菌后的MMA平板上选取疑似李氏菌的多个单菌落，分别接种于三糖铁琼脂斜面备用于生化鉴定，另取这些菌落同时接种于同一管的营养肉汤中，培养2448h后，取10mL以实施例1的方法提取DNA并mPCR-DHPLC检测。结果显示检出如附图17所示的单增李氏菌和英诺克李氏菌的特征图谱。为验证该检测结果的准确性，从接种于三糖铁上的菌落中，经生化鉴定，确实也分离出了单增李氏菌和英诺克李氏菌的分离株。权利要求1、食品中李斯特氏菌属微生物检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中包括一种检测溶液，该检测溶液中含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及李斯特氏菌引物对10μM；其中，李斯特氏菌的特异性引物对序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"wi="161"></tables>2、食品中李斯特氏菌属微生物的检测方法，包括如下步骤①PCR反应取lul待测样品DNA溶液，加入10ul检测溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul;将以上各组分加入0.2mLPCR反应管中，混匀，5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR循环预变性94°C，3min;进入循环94。C变性60s，60。C退火60s，72。C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min;②将PCR扩增产物进行DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mmx50mm，粒度3柱温5965°C;流动相(体积比)O.Omin，53.7%缓冲溶液A，46.3%缓冲溶液B;0.5min，48.7%缓冲溶液A，51.3%缓冲溶液B;5.0min，39.7%缓冲溶液A，60.3%缓冲溶液B;其中，缓冲溶液A是浓度O.lmM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1MTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;检测器荧光检测器，光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s;上样量PCR产物5iiL。3、根据权利要求2所述的食品中李斯特氏菌属微生物的检测方法，其特征在于步骤②DHPLC分析的柱温61°C。全文摘要食品中李斯特氏菌属微生物检测试剂盒及检测方法，该试剂盒中包括一种检测溶液，该检测溶液中含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl<sub>2</sub>、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及李斯特氏菌引物对10μM。本发明采用mPCR结合部分变性条件下的DHPLC技术，针对食品中李斯特氏菌属微生物进行灵敏便捷的检测，并建立应用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测食品中李斯特氏菌属微生物，并且检侧耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。文档编号C12Q1/68GK101649349SQ20091001079公开日2010年2月17日申请日期2009年3月20日优先权日2009年3月20日发明者曹际娟,王振国申请人:曹际娟;王振国