甘蓝tt8基因家族及其应用的制作方法

专利名称：甘蓝tt8基因家族及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及甘蓝型油菜(Brassica napus)及其亲本物种白菜(Brassica rapa)和甘蓝(Brassica oleracea) TT8 (TRANSPARENT TESTA 8，透明种皮8 ;又称bHLH42，BASIC HELIX-LOOP-HELIX 42，碱性螺旋-环-螺旋42)基因家族及其应用。
背景技术：
十字花科(Brassicaceae)的芸薹属(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和观赏植物品种，为人类提供营养价值丰富的食用油、蔬菜和观赏植物，并为畜牧业提供饲料，具有重要的经济价值。在芸薹属物种中，异源四倍体物种甘蓝型油菜是由2个二倍体物种白菜和甘蓝通过种间杂交后再加倍而形成的。甘蓝型油菜是世界第二大油料作物，在全世界广泛种植，栽培面积和产量仅次于大豆。白菜和甘蓝也是重要的油料、蔬菜和观赏作物。对甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝功能基因的比较基因组学研究将为揭示它们之间的遗传进化关系提供理论基础，并为芸薹属作物的性状改良提供应用基础。籽粒颜色是甘蓝型油菜的重要性状之一。甘蓝型油菜黄籽品系具有种皮薄、皮壳率低、粗纤维含量低、含油量高、饼柏蛋白含量高等优点，与黑籽品系相比，饼柏的经济价值和油的品质都有所提高。虽然白菜和甘蓝中均存在表型稳定的天然黄籽基因型，但自然界中不存在天然的甘蓝型油菜黄籽基因型。已有的甘蓝型油菜黄籽材料主要通过远缘杂交等方式而创造，存在黄籽率和黄籽度不高，表型不稳定，易受环境影响而变异，选育效率低，育种周期长，负相关性状难以克服等缺点，远远不能满足生产要求。因此，获得稳定遗传的甘蓝型油菜黄籽性状成为甘蓝型油菜育种的重要目标。长期以来，全世界众多研究者对该性状进行了广泛研究，但到目前为止对于黄籽性状形成的分子机理仍不清楚，更没有通过转基因分子育种创造黄籽性状的任何报道。类黄酮是植物的重要次生代谢物质，具有多种生物学功能，其中花青素苷 (anthocyanin, AN)、原花青素(proanthocyanidin, PA)和黄酮醇是十字花科等植物器官表面着色的重要成分。芸薹属和拟南芥(Arabidopsis thaliana)同属十字花科,具有较近的亲缘关系。在拟南芥种皮中，原花青素主要积累在内种皮和有颜色的合点区域，是种皮色素的核心成分。拟南芥TT8 (AtTT8)基因编码一个bHLH型正调控转录因子(AtbHLH42)，在积累有花青素苷和原花青素的细胞中被诱导表达，TT2、TT8和TTGl形成一个转录因子复合物，调控黄酮合成途径的“晚期”结构基因如DFR、BAN等的表达，从而调控原花青素、花青素苷、种皮粘液的积累。拟南芥tt8突变体的种子显示透明种皮即黄籽性状。因此，在芸薹属中对TT8基因进行同源克隆和功能鉴定，是筛选甘蓝型油菜黄籽位点的重要途径，也可用于芸薹属物种中与原花青素、花青素苷、种皮粘液相关性状的分子育种。
芸薹属和拟南芥起源于同一祖先，约在1700 1800万年前发生分离，芸薹族植物发生了基因组水平的三倍化，即芸薹属基本种白菜(AA组，529Mbp)、甘蓝(CC组，696Mbp) 和黑芥(BB组，632Mbp)等的基因组约相当于拟南芥基因组(157Mbp)的3倍，而甘蓝型油菜(AACC组，1132Mbp)的基因组相当于甘蓝和白菜两个基因组之和，约相当于拟南芥基因组的6倍，也就是说，在拟南芥中为单拷贝的基因在甘蓝和白菜中可能分别有3个对应的拷贝，而在甘蓝型油菜中可能有6个拷贝。目前，TT8基因在甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等芸薹属物种中的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性、黄籽等性状的关系以及转基因分子育种等都未见报道。

发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8 基因家族。为达到上述目的，本发明采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，分别克隆了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族成员的全长cDNA和对应的基因组序列，并对其进行了系统分析。结果显示所述白菜TT8(BrTT8)基因家族包括以下2个成员BrTT8_l基因和BrTT8_2基因； 所述BrTT8-l基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，BrTT8_2基因的全长cDNA序列如 SEQ ID No. 4 所示；所述甘蓝TT8(BoTT8)基因家族包括以下2个成员BoTT8_l基因和BoTT8_2基因； 所述BoTT8-l基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 6所示，BoTT8_2基因的全长cDNA序列如 SEQ ID No. 8 所示；所述甘蓝型油菜TT8(BnTT8)基因家族包括以下2个成员BnTT8_l基因和 BnTT8-2基因；所述BnTT8_l基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 10所示，BnTT8_2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 12所示。进一步，所述BrTT8-l基因的基因组序列如SEQ ID No. I所示，BrTT8_2基因的基因组序列如SEQ ID No. 3所示；所述BoTT8-l基因的基因组序列如SEQ ID No. 5所示， BoTT8-2基因的基因组序列如SEQ ID No. 7所示；所述BnTT8_l基因的基因组序列如SEQ ID No. 9所示，BnTT8-2基因的基因组序列如SEQ ID No. 11所示。上述3个物种的6条TT8基因之间具有很高的同源性，基因组序列的一致性为 69. 7 99. 9%，mRNA —致性为85. 8% 99. 8%，编码区的一致性为93. 2% 99. 9%，其中BnTT8-l基因与BoTT8-l基因的一致性高达99. 9%，BnTT8_2基因与BrTT8_l基因的一致性高达99. 1%。它们与AtTT8基因也具有很高的同源性，基因组序列的一致性为44. 2 52. 4%, mRNA的一致性为78. 0% 82. 1%，编码区的一致性为80. I % 83. 6%。6个TT8 基因编码的蛋白之间具有很高的同源性，一致性为89. 6% 100%，相似性为90. 6% 100%，其中BnTT8-l蛋白与B0TT8-I蛋白的相似性和一致性均为99. 6%，BnTT8_2蛋白与 BrTT8-l蛋白的相似性和一致性均为100%。它们与AtTT8蛋白也具有很高的同源性，一致性为71. 5 % 77. 2 %，相似性为77. 4 % 84. I %。系统进化分析表明，AtTT8先与BrTT8_2 聚在一起，BnTT8-2先与BrTT8_l聚在一起，然后这两个小类聚在一起；BnTT8_l与BoTT8_l 聚在一起，BoTT8-2虽然单独，但与BnTT8-l与BoTT8_l也很近。从基因结构、蛋白结构、核酸序列同源性、氨基酸序列同源性、系统进化等方面均表明，BnTTS-I基因起源于BoTTS-I 基因，BnTT8-2基因起源于BrTT8_l基因，且这6个TT8基因都是AtTT8基因的垂直同源基因。TT8基因家族主要在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜的生殖器官中表达，以发育中的种子表达最高，并随着种子的发育进程而逐渐下降。此外，TT8基因家族在白菜和甘蓝型油菜的黑、 黄籽材料间的总体表达存在着较明显的差异，且不同的基因成员表现出不同的黑、黄籽差异表达模式，而TT8基因家族总体及其成员在甘蓝黑、黄籽材料中的表达无明显差异，说明 TT8基因家族表达下调与白菜和甘蓝型油菜的黄籽性状有关，而TT8基因家族不是甘蓝黄籽性状的重要原因。基于上述结果，利用本发明的BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族中的任一种或多种基因或基因截短片段，可以构建TT8基因重组表达载体和转化体，用于TT8基因的正义表达、 反义抑制、RNA干扰等。本发明的目的之二在于提供所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用。进一步，所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族在甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用。为达到上述目的，本发明将BrTT8、B0TT8、BnTT8基因家族成员的全长cDNA序列分别插入PCAMBIA2301G载体中(插入片段由CaMV35S启动子驱动，由Nos终止子终止转录)，构建了正义植物表达载体 pBrTT8-l、pfoTT8-2、pBoTT8-2 和 pBnTT8_l，用 Flower Dip 法将它们转化拟南芥tt8突变体(种子为透明种皮)，通过卡那霉素(Kan)抗性筛选得到了 BnTTS-I转基因植株，该转基因植株T2代种子的种皮颜色恢复了野生型的深褐色，证明甘蓝型油菜等芸薹属的TT8基因具有与AtTT8基因对应的功能。因此，本发明的TT8基因家族在种子性状的分子育种中具有应用价值。当然，将甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族中任一种基因的基因组序列或全长cDNA序列正义插入pCAMBIA2301G载体的CaMV35S启动子与Nos终止子之间，都可以构建正义植物表达载体。同时，本发明还选取BnTT8-l基因的部分编码序列(如SEQ ID No. 10中第837 1653位碱基所示)，将其反义片段插入pCAMBIA2301G载体的CaMV35S启动子和Nos终止子之间，构建了反义植物表达载体pBnTTSA，并通过农杆菌介导的下胚轴侵染法转入甘蓝型油菜典型黑籽品种湘油15号，得到了抑制内源BnTTS基因表达的转基因株系。研究发现，⑶S 染色检测呈阳性的反义转基因植株收获种子的颜色与对照相比有明显变浅，虽然没有达到标准的金黄色性状，但已比较接近黄籽。反义BnTTS转基因后代植株的主体形态特征与非转基因的对照植株无明显差异，但是转基因种子普遍饱满度下降，粒形偏离球形，千粒重由对照的3. 15g下降到2. 54g。说明BnTTS基因除了参与调控种皮色素合成以外，还参与调控了一些其它种子性状如种子大小，可用于芸薹属作物种皮颜色、种子大小等种子性状的分子育种。当然，将甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT8基因家族中任一种基因的全部或部分编码序列反义插入PCAMBIA2301G载体的CaMV35S启动子与Nos终止子之间，都可以构建反义植物表达载体。本发明的有益效果在于本发明提供了 TT8基因在甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝中的成员数、各成员的全长cDNA序列和基因组序列、编码蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性等，并确认了 TT8基因家族表达下调与白菜和甘蓝型油菜的黄籽性状有关，由此本发明提供了 TT8基因在芸薹属作物种子性状改良特别是甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用，应用前景好。


为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图I为BrTT8、B0TT8、BnTT8基因家族5’ cDNA末端扩增的琼脂糖凝胶电泳。图2为BrTT8、B0TT8、BnTT8基因家族3’ cDNA末端扩增的琼脂糖凝胶电泳。图3为BrTT8、B0TT8和BnTT8基因家族成员全长cDNA的扩增，其中A和B分别为 FBnTT816+RBrTT819、FBnTT816+RBrTT821 扩增 BrTT8 基因家族全长 cDNA ；C 和 D 分别为 FB0TT8+RB0TT8-I、FBoTT8+RBoTT8_2 扩增 BoTT8 基因家族全长 cDNA ;E 和 F 分别为 FBoTT8+RBoTT8-l、FBrTT8+RBrTT8-l 扩增 BnTT8 基因家族全长 cDNA。
图4为BnTT8、BrTT8、BoTT8基因家族成员及AtTT8基因mRNA的核苷酸序列比对。 图5为BnTT8、BrTT8、BoTT8基因家族成员及AtTT8基因的聚类分析。
图6为BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族成员的Southern杂交鉴定。
图7为BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族蛋白及AtTT8蛋白的氨基酸序列比对。
图8为BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族编码蛋白与其它植物TT8蛋白的聚类分析。图9为RT-PCR检测BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族总体和各成员在不同组织器官中的表达。图10为RT-PCR检测BnTT8、BrTT8和BoTT8基因家族总体和各成员在黑、黄籽近
等基因系生殖器官中的表达。图11为pCAMBIA2301G正义植物表达载体中T-DNA区域中的表达元件。图12为pBnTT8_l载体转化拟南芥tt8突变体T1代转化子的筛选，其中A为T1代植株的Kan抗性筛选，B为Kan抗性的T1代植株苗期，C为Kan抗性的T1代植株初花期。图13为Kan抗性的拟南芥T1代植株的⑶S染色鉴定。图14为拟南芥野生型种子(A)、BnTT8-l转化拟南芥tt8突变体后的T2代种子 (B)、拟南芥tt8突变体种子(C)。图15为反义植物表达载体pBnTT8A构建过程中的电泳检测，其中A为从pMD18_T 上酶切BnTT8A, B为从pCAMBIA2301G上切下I. 9kb的GUS基因，C为pBnTT8A的检测。图16为反义植物表达载体pBnTT8A的T-DNA区段图。图17为pBnTT8A转化湘油15后的部分再生抗Kan植株。图18为pBnTT8A转化湘油15后(右)与对照(左)的叶片⑶S染色。图19为pBnTT8A转化湘油15后各T3株系的种子(CK为非转基因对照)。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
优选实施例采用的植物材料白菜材料均来自于白菜型油菜亚种(B.rapa ssp. oleifera)，包括典型黑籽系06K130和黄籽系06K124 ;甘蓝材料均来自于羽衣甘蓝变种 (B. oleracea var. acephala)，包括典型黑籽系06K158和黄籽系06K165 ;甘蓝型油菜材料包括典型黑籽系5B、黑籽品种湘油15号、籽色近等基因系黑籽系LI和黄籽系L2，均由重庆市油菜工程技术研究中心提供，大田常规种植。优选实施例采用的主要试剂及试剂盒Taq DNA聚合酶(5U/ yl)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；DNA分子量标准A-HindIII digest DNA Marker和DL-2000 plus Marker、LATaq DNA 聚合酶(5U/ u I)、pMD18_T 载体试剂盒、RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0购自宝生物工程(大连)有限公司；限制性内切酶EcoRI、EcoRV等购自美国New England Biolabs公司；限制性内切酶SacI等、T4 DNA连接酶(10U/u I)购自立陶宛MBI Fermentas 公司；MS 基本培养基(Murashige & Skoog medium, including vitamins)购自荷兰Duchefa Biochemie公司；柱式小量植物组织RNA抽提试剂盒、小量胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，GeneRacer Kit购自美国Invitrogen 公司，Southern杂交与检测的试剂(盒)、尼龙膜购自德国Roche公司。优选实施例米用的主要仪器PTC_200Programmable Thermal Controller PCR 仪购自美国MJ Research公司，UVP HL-2000杂交紫外交链仪购自美国UVP公司，其它均为分子生物与学基因工程常用仪器。—、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族的克隆I、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜基因组总DNA的提取取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜06K130和甘蓝06K158的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。I. 0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的3个物种的基因组总DNA完整性好，平均分子量均大于入-HindIII DNA Marker的23kb条带，RNA消化比较完全，经分光光度法检测纯度较高，可以直接用于PCR扩增及Southern杂交。2、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜各器官总RNA的提取取大田常规条件下栽培的白菜06K130、甘蓝06K158、甘蓝型油菜5B的根(Ro)、下胚轴(Hy)、子叶(Co)、茎(St)、叶(Le)、蕾(Bu)、花(Fl)、开花后10天的种子(IOD)、开花后20天的种子(20D)、开花后30天的种子(30D)和荚果皮(SP)共11个器官；以及大田常规条件下栽培的白菜06K124、甘蓝06K165，甘蓝型油菜LI和L2的蕾、花以及发育不同阶段的种子(甘蓝型油菜取10D、20D和30D的种子；白菜和甘蓝取IOD和30D的种子)等主要生殖器官；采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒提取各器官总RNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。I. 0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的3个物种的总RNA 特征条带清晰，且无明显RNA降解和DNA污染，经分光光度法检测纯度较高，能够满足RACE 操作的基本要求。3、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜RACE第一链cDNA的获得分别取白菜06K130、甘蓝06K158、甘蓝型油菜5B的蕾、花、10D、20D、30D种子的总
RNA混合，采用GeneRacer Kit按其说明书进行一系列的RACE操作，分别获得白菜、甘蓝、甘蓝型油菜第一链cDNA(3’端和5’端同时锚定有人工接头序列)，PCR放大后进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，3个物种的总cDNA呈现出大小在200bp IOkb的拖带，重心区域在500bp 4kb之间，最核心区在I. 5kb左右，说明反转录完全，得到了高质量的RACE 总cDNA，可用于克隆白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族完整的cDNA末端。4、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族5’ cDNA末端的克隆采用Vector NTI Suite 9. 0 对来自拟南芥(NM_117050. 2，AJ277509)、牵牛花 (Ipomoeatricolor) (AB154370)、百合(Lilium) (AB222076)、紫花牵牛(Ipomoea purpurea) (AB154369)、矮牵牛(Iomoea nil) (AB232775)的TT8或编码bHLH转录因子的核酸序列进行多重比对，针对5’和3’末端的最保守区域设计了 2个正向引物(FTT8-3和FTT8-3N)和 2个反向引物(RTT8-5和RTT8-5N)(表I)作为扩增白菜、甘蓝和甘蓝型油菜TT8基因家族成员cDNA末端的特异引物。分别以白菜、甘蓝和甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，用引物组合5’P+RTT8_5进行 5’cDNA末端的 RACE—扩。50ii I 标准Taq PCR扩增体系为10XPCR Buffer 5u l,25mmol/ L 的 MgCl23ii l,10mmol/L 的 dNTPs Iu l,10umol/L 的正向引物 Iu l,10umol/L 的反向引物I ，5U/ ill的Taq酶0. 5 ill，模板2u I,加双蒸水至总体积为50u I0 PCR扩增程序为94°C预变性2分钟；再94°C变性I分钟，52 °C退火I分钟，72 °C延伸I分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟。再以一扩产物为模板，用引物组合5’NP+RTT8-5N进行5’cDNA 末端的RACE巢扩，PCR扩增体系与一扩相同但模板改为0. I u 1，PCR扩增程序为94°C预变性2分钟；再94°C变性I分钟，56°C退火I分钟，72°C延伸I分钟，共28个循环；最后72°C 延伸10分钟。PCR产物进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，BrTT8获得了一条600bp左右的宽带，BoTT8获得了一条550bp的条带，BnTT8获得了一条350-550左右的很亮的宽带(图 I)。采用小量胶回收试剂盒回收目标片段，与PMD18-T载体连接，再转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含有氨苄青霉素(Amp)、IPTG和X-gal的LB平板培养至蓝白斑清晰，挑取白斑单菌落，用含有Amp的LB液体培养基增菌培养后，取菌液进行PCR鉴定，结果阳性克隆子表现出明显的长度多态性，每个物种挑选多个代表性单克隆子委托上海英竣生物工程技术有限公司进行测序。表15’和3’ RACE中的基因特异引物(GSP)和GeneRacer试剂盒引物
权利要求
1.甘蓝TT8基因家族，其特征在于，包括以下2个成员包括以下2个成员BoTT8-l基因和BoTT8-2基因；所述BoTT8-l基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 6所示，BoTT8_2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 8所示。
2.根据权利要求I所述的甘蓝TT8基因家族，其特征在于，所述BoTTS-I基因的基因组序列如SEQ ID No. 5所示，BoTT8-2基因的基因组序列如SEQ ID No. 7所示。
3.含有权利要求I或2所述的甘蓝TT8基因家族中任一种或多种基因或基因保守片段的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为正义植物表达载体，是将甘蓝TT8基因家族中任一种基因的基因组序列或全长cDNA序列正义插入 PCAMBIA2301G载体的CaMV35S启动子与Nos终止子之间而得到。
5.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为反义植物表达载体，是将甘蓝TT8基因家族中任一种基因的全部或部分编码序列反义插入 PCAMBIA2301G载体的CaMV35S启动子与Nos终止子之间而得到。
6.含有权利要求3至5任一项所述重组表达载体的转化体，所述转化体为微生物。
7.权利要求I或2所述的甘蓝TT8基因家族在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用，所述种子性状为种皮颜色和种子大小。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述芸薹属作物为甘蓝型油菜。
全文摘要
本发明公开了甘蓝TT8基因家族，包括BoTT8-1基因(全长cDNA序列如SEQ ID No.6所示)和BoTT8-2基因(全长cDNA序列如SEQ ID No.8所示)二个成员，该基因家族可应用于芸薹属作物种皮颜色和种子大小等种子性状的分子育种。
文档编号C12N1/21GK102533783SQ20121001847
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者张瑞熙, 李加纳, 林呐, 柴友荣, 殷家明, 肖霞, 许本波, 谢伶俐, 赵文军 申请人:西南大学