专利名称：一种短短芽孢杆菌菌株制备羟苯乙酯的方法
一种短短芽孢杆菌菌株制备羟苯乙酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物制备化合物的方法，尤其涉及一种短短芽孢杆菌菌株制备羟苯乙酯的方法。
背景技术：
微生物是产生天然活性化合物的天然宝库。据估计，现在已知的细菌不到总数的 1%，已知的真菌不到总数的5%，表明还有成千上万的微生物种类有待进一步开发(Leslie AA)。由于不同的生态环境下微生物的种类和数量各不相同，因而就会产生不同种类和不同功能的次级代谢物。拮抗微生物在代谢活动中通过分泌抗菌物质直接对病原物产生抑制是自然界普遍存在的现象，也是众多拮抗微生物应用的物质基础。杨利珍等从瑞香狼毒根际这一独特的生态环境中分离出一株高抑菌活性的青霉菌，乙酸乙酯相TLC法系统预试结果表明，其主要成分为挥发油、黄酮、萜类、留体及其苷类、酚性成分、内酯及香豆素和有机酸类。魏鸿刚等发现青枯病生防菌菌株HY96发酵液的粗提物可能是分子量低于5kD的混合物，该混合物对青枯雷尔氏菌具有很好的拮抗作用。短短芽孢杆菌是一类革兰氏染色阳性或可变、菌体杆状、以周生鞭毛运动、产芽孢的一类细菌。据报道，短短芽孢杆菌产生的短杆菌素一般由九种核糖体产生的线状短杆菌肽和二十八种以上非核糖体产生的短杆菌酪肽和tryptocidines组成，这些蛋白往往具有不同的生物活性(RauterAach等)。羟苯乙酯(CAS120-47-8)为白色结晶性粉末，无臭或有轻微的特殊香气，味微苦、 灼麻。对真菌的抑菌效果较强，但对细菌的抑菌效果较弱。用作抑菌防腐剂，广泛用于液体制剂、半固体制剂以及食品和化妆品的防腐。羟苯乙酯通常由邻羟基苯甲酸(即水杨酸) 与乙醇酯化而得，即利用化工合成制备羟苯乙酯，且目前未见关于从短短芽孢杆菌中制备羟苯乙酯方法的报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种短短芽孢杆菌菌株制备羟苯乙酯的方法，即提供了一种获得羟苯乙酯的新途径，避免了化工合成对环境所造成的污染。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的一种短短芽孢杆菌菌株制备羟苯乙酯的方法，其具体包括如下步骤(1)短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的活化用接种环将短短芽孢杆菌 FJAT-0809-GLX划线于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养Mh，且培养温度设定为 30 0C ；(2)制备种子液将步骤(1)所获得的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的单菌落接种于IOOmL的种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养Mh，温度30°C，转速 180rpm ；(3)制备液体发酵液按10%移种量将步骤⑵所获得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中培养，温度30°C，转速180rpm，并在培养过程中每隔一段时间取适量的发酵液检测其PH值及孢子数量，当其孢子数达到IOX IO8AiL时则获得所需的液体发酵液；(4)短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX次生代谢产物的制备及活性检测将步骤 (3)所获得的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX发酵液置于常温下离心30min，且离心转速为3600rpm，离心结束后取上清液，该上清液经大孔树脂富集，并将富集所得的富集液进行浓缩，浓缩所得物质为短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的次生代谢产物，并采用抑菌圈法检测所得次生代谢产物的活性；(5)羟苯乙酯的分离纯化将步骤中所获得的具有活性的次生代谢产物经丙酮萃取，且所得萃取物经硅胶柱进一步进行分离纯化，该分离纯化后得到的产物即为所述的羟苯乙酯。进一步地，所述步骤中的大孔树脂采用大孔树脂AmberliteXAD16。进一步地，所述步骤中的大孔树脂富集的具体操作如下先将所述上清液与大孔树脂混合，且按每升所述上清液中加40g大孔树脂的量进行混合，并将该混合所形成的混合液置于30°C下振荡4h，振荡转速为160rpm ；接着将振荡结束后的混合液填入层析柱；之后采用蒸馏水将层析柱的混合液洗至无色；然后再用3倍洗脱体积的丙酮进行洗脱， 并收集富集液即丙酮洗脱液；最后将该富集液于40°C下旋转蒸发进行浓缩，浓缩所得物质即为短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的次生代谢产物。进一步地，所述步骤(5)中采用硅胶柱进行分离纯化的具体操作方法如下将所述粉状物采用40倍上样量的300目硅胶柱进行分离纯化，经体积比为2 1的乙酸乙酯与二氯甲烷洗脱，且每2mL —个馏分进行收集，并采用薄层层析检测所收集到的组分，检测结果确认在迁移率&为0. 437的位置上出现的组分为单一点，之后回收该单一点组分即为所述的羟苯乙酯。进一步地，所述菌株培养基的组分牛肉浸膏0. 3%，蛋白胨0. 5%，葡萄糖1%，琼脂粉1.7%，蒸馏水配制，pH7.0;所述种子培养基的组分淀粉1 %，牛肉浸膏0. 5%，蛋白胨0. 3%，蔗糖1 %，酵母粉 0. 5%，CaCl20. 5%，蒸馏水配制，pH7. 0 ；所述发酵培养基的组分淀粉0.8%，豆饼粉3 %，蛋白胨0.2%，蔗糖2 %， CaCl2O. 5%，消泡剂0. 17%，蒸馏水配制，pH7. 0 ；且上述各培养基组分中的百分比均为质量比。本发明一种短短芽孢杆菌菌株制备羟苯乙酯的方法的有益效果在于为羟苯乙酯的获得提供了一种新的途径，且因本发明的制备方法为生物法，能够避免现有化工合成制备羟苯乙酯时对环境所造成的污染；另外，本发明制备过程简单，易操作。
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。图1是本发明方法所获得的待测物的总离子流图。图2是本发明方法所获得的待测物的色谱图。图3是羟苯乙酯标准样品的色谱图。
具体实施方式本申请人在中国发明公开号为CN101955902A，名称为一种新的短短芽孢杆菌菌株及其应用的专利中揭露了短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的相关信息及该菌株的制备方法；而本发明实质为该短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的另一种应用，具体地，是利用该短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX制备羟苯乙酯。1.利用短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX制备羟苯乙酯的具体步骤如下(1)短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的活化用接种环将短短芽孢杆菌 FJAT-0809-GLX划线于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养Mh，且培养温度设定为30°C ； 该菌株培养基的组分为牛肉浸膏0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，琼脂粉1.7%，蒸馏水配制，pH7. 0 ；(2)制备种子液将步骤(1)所获得的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的单菌落接种于IOOmL的种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养Mh，温度30°C，转速 ISOrpm ；该种子培养基的组分淀粉1 %，牛肉浸膏0. 5%，蛋白胨0. 3 %，蔗糖1 %，酵母粉 0. 5%, CaCl2O. 5%,蒸馏水配制，pH7. 0 ；(3)制备液体发酵液按10%移种量将步骤⑵所获得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中培养，温度30°C，转速180rpm，并在培养过程中每隔一段时间取适量的发酵液检测其PH值及孢子数量，当其孢子数达到IOX IO8AiL时则获得所需的液体发酵液；其中发酵培养基的组分淀粉0. 8%，豆饼粉3%，蛋白胨0. 2%，蔗糖2%，CaCl2O. 5%，消泡剂 0. 17%，蒸馏水配制，pH7.0 ；(4)短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX次生代谢产物的制备及活性检测将步骤 (3)所获得的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX发酵液置于常温下离心30min，且离心转速为3600rpm，离心结束后取上清液，该上清液经大孔树脂富集，并将富集所得的富集液进行浓缩，浓缩所得物质为短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的次生代谢产物，并采用抑菌圈法检测所得次生代谢产物的活性；(5)羟苯乙酯的分离纯化将步骤中所获得的具有活性的次生代谢产物经丙酮萃取，且所得萃取物经硅胶柱进一步进行分离纯化以获得待测物。其中，步骤(4)中的大孔树脂富集的具体操作如下先将所述上清液与大孔树脂 AmberliteXAD16混合，且按每升所述上清液中加40g大孔树脂的量进行混合，并将该混合所形成的混合液置于30°C下振荡4h，振荡转速为160rpm ；接着将振荡结束后的混合液填入层析柱；之后采用蒸馏水将层析柱的混合液洗至无色；然后再用3倍洗脱体积的丙酮进行洗脱，并收集富集液即丙酮洗脱液；最后将该富集液于40°C下旋转蒸发进行浓缩，浓缩所得物质即为短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的次生代谢产物。步骤( 中采用硅胶柱进行分离纯化的具体操作方法如下将所述粉状物采用40 倍上样量的300目硅胶柱进行分离纯化，经体积比为2 1的乙酸乙酯与二氯甲烷洗脱，且每2mL —个馏分进行收集，并采用薄层层析检测获得单一点的样品，具体地，这个单一点是在薄层层析之前获得的，因通过硅胶柱可以获得很多组分，有的组分可能是混合点，有的组分可能是单一点，而通过薄层层析可以确定在迁移率&为0. 437的位置上出现的组分为单一点，之后回收该单一点组分即待测物。另外，上述各培养基组分中的百分比均为质量比。
2.通过GC/MS对待测物进行检测分析GC/MS检测时其中，色谱条件采用HP5-MS色谱柱，进样口温度250°C，压力 5. 5977psi，总流量104mL/min,隔垫吹扫流量3mL/min,分流比为100 1 ；升温程序先50°C保持anin，之后以3°C /min的升温速率上升到120°C并在120°C 处保持5min，接着以10°C /min的升温速率上升到200°C，然后以20°C /min的升温速率上升到280°C并在280°C处保持5min ；质谱条件溶剂延迟为4. OOmin、采集模式为全扫描、EMV模式为相对值，其中全扫描的参数开始时候的质量数50. OOamu，结束时的质量数550. OOmu ；MS温度离子源 230°C, MS 四级杆 150°C。GC/MS检测获得待测物的总离子流图(如图1所示)及色谱图(如图2所示)，观察图1可知，在保留时间为21. 980min时，检测到1个色谱峰，之后仪器获得待测物在保留时间为21. 980min处的色谱图(如图2所示)，发现该色谱图与羟苯乙酯标准样品的色谱图 (如图3所示)的匹配度高达100%，从而可知待测物即为羟苯乙酯3.短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX次生代谢产物及羟苯乙酯的活性检测(1)检测所需材料将本发明所得的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX次生代谢产物和羟苯乙酯分别用二甲基亚砜(DMSO)溶解成浓度为 20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2. 5mg/mL 和 1. 25mg/mL 的溶液备用；目标菌株为病原真菌和细菌，取青枯雷尔氏菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、黑曲霉菌和茄形镰孢菌(其中，青枯雷尔氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌都是细菌，串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、黑曲霉菌和茄形镰孢菌都是病原真菌)为例，且将病原真菌置于PDA培养基中培养以备用，将细菌置于NA培养基中培养以备用。(1)检测方法因次生代谢产物与羟苯乙酯活性的检测方法一样，以羟苯乙酯为例进行说明。设置试验组、阴性对照组、细菌的阳性对照组、及病原真菌的阳性对照组，在试验组中，串珠镰刀菌、青枯雷尔氏菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、尖孢镰刀菌、黑曲霉菌和茄形镰孢菌的试验处理方式一致，以串珠镰刀菌为例进行说明，在预先培养串珠镰刀菌的PDA培养基中挑取串珠镰刀菌单菌落并装至含25mL PDA培养液的250mL三角瓶内，之后将该三角瓶置于30°C 下振荡培养Mh，转速为160rpm，振荡结束后吸取ImL培养液并将其加至熔化且冷却到50°C 的6mL 0. 7%琼脂的PDA培养基内，混合均勻后形成上层培养基，接着将该上层培养基倾覆于预先已凝固地PDA平板上，待上层培养基凝固后，在每块PDA平板上打孔，然后在各PDA 平板上分别用移液器于每个孔内加入50 μ 1配制好的浓度为20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、 2. 5mg/mL和1. 25mg/mL羟苯乙酯的二甲基亚砜溶液，再将各PDA平板分别置于30°C培养箱中培养48h，培养结束后测定各抑菌圈的直径；以不含羟苯乙酯及其它物质的二甲基亚砜溶液作为阴性对照；使用25U/mL硫酸链霉素的二甲基亚砜溶液为细菌的阳性对照；采用 200 μ g/mL潮霉素的二甲基亚砜溶液为病原真菌的阳性对照。在上述试验组中，若处理的是细菌，则处理方式中的PDA培养基用NA培养基替换、 PDA培养液用NA培养液、PDA平板用NA平板。(2)检测结果检测结果如表1与表2所示。结果表明，次生代谢产物和羟苯乙酯对不同病原真
6菌和细菌均具有比较明显的抑菌作用，且随着浓度的增加，抑菌效果更加明显。在次生代谢产物的浓度为20mg/mL时，其对青枯雷尔氏菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、尖孢镰刀菌、黑曲霉菌、茄形镰孢菌和串珠镰刀菌的抑菌圈直径大小分别为12. 83mm、10. 70mm、10. 95mm、 14. 32mm、15. 87mm、14. 14mm与13. 20mm ；在次生代谢产物的浓度为5mg/mL时，其对该七种菌的抑菌圈直径大小仍分别可达到9. 02mm、8. 58mm、8. 41mm、9. 20mm、10. 95mm、9. 99mm和 9. 89mm ；甚至在次生代谢产物的浓度为1. 25mg/mL时，其仍然对该七种菌均具有抑制作用， 具体地，其对该七种菌的抑菌圈直径大小分别为5. 88mm、6. 65mm、5. 87mm、6. 96mm,7. 53mm、 7. 99mm和5. 59mm。在羟苯乙酯的浓度为5mg/mL时，其对青枯雷尔氏菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、尖孢镰刀菌、黑曲霉菌、茄形镰孢菌和串珠镰刀菌的抑菌圈直径大小分别为4. 50mm、 2. 54mm,2. 03mm、7. 72mm、6. 39mm,7. 21mm 和 5. 75mm ；在羟苯乙酯的浓度为 20mg/mL 时，其对该七种菌的抑菌圈直径均增大了，分别增大至18. 79mm,7. 16mm、6. 68mm、19. 89mm、22. 77mm、 18. 70mm 与 14. 11mm。表1不同浓度次生代谢产物对各病原真菌和细菌的抑菌圈直径(mm)的测定
权利要求
1.一种短短芽孢杆菌菌株制备羟苯乙酯的方法，其特征在于具体包括如下步骤(1)短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的活化用接种环将短短芽孢杆菌 FJAT-0809-GLX划线于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养Mh，且培养温度设定为 30 0C ；(2)制备种子液将步骤(1)所获得的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的单菌落接种于IOOmL的种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养Mh，温度30°C，转速 180rpm ；(3)制备液体发酵液按10%移种量将步骤( 所获得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中培养，温度30°C，转速ISOrpm，并在培养过程中每隔一段时间取适量的发酵液检测其PH值及孢子数量，当其孢子数达到IOX IO8AiL时则获得所需的液体发酵液；(4)短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX次生代谢产物的制备及活性检测将步骤(3) 所获得的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX发酵液置于常温下离心30min，且离心转速为 3600rpm,离心结束后取上清液，该上清液经大孔树脂富集，并将富集所得的富集液进行浓缩，浓缩所得物质为短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的次生代谢产物，并采用抑菌圈法检测所得次生代谢产物的活性；(5)羟苯乙酯的分离纯化将步骤中所获得的具有活性的次生代谢产物经丙酮萃取，接着所得萃取物经浓缩干燥成粉状，之后将该粉状物采用硅胶柱进一步进行分离纯化， 该分离纯化后得到的产物即为所述的羟苯乙酯。
2.如权利要求1所述的一种短短芽孢杆菌菌株制备羟苯乙酯的方法，其特征在于所述步骤中的大孔树脂采用大孔树脂AmberliteXAD16。
3.如权利要求1所述的一种短短芽孢杆菌菌株制备羟苯乙酯的方法，其特征在于所述步骤(4)中的大孔树脂富集的具体操作如下先将所述上清液与大孔树脂混合，且按每升所述上清液中加40g大孔树脂的量进行混合，并将该混合所形成的混合液置于30°C下振荡4h，振荡转速为160rpm ；接着将振荡结束后的混合液填入层析柱；之后采用蒸馏水将层析柱的混合液洗至无色；然后再用3倍洗脱体积的丙酮进行洗脱，并收集富集液即丙酮洗脱液；最后将该富集液于40°C下旋转蒸发进行浓缩，浓缩所得物质即为短短芽孢杆菌菌株 FJAT-0809-GLX的次生代谢产物。
4.如权利要求1所述的一种短短芽孢杆菌菌株制备羟苯乙酯的方法，其特征在于所述步骤(5)中采用硅胶柱进行分离纯化的具体操作方法如下将所述粉状物采用40倍上样量的300目硅胶柱进行分离纯化，经体积比为2 1的乙酸乙酯与二氯甲烷洗脱，且每 2mL—个馏分进行收集，并采用薄层层析检测所收集到的组分，检测结果确认在迁移率&为 0. 437的位置上出现的组分为单一点，之后回收该单一点组分即为所述的羟苯乙酯。
5.如权利要求1所述的一种短短芽孢杆菌菌株制备羟苯乙酯的方法，其特征在于所述菌株培养基的组分牛肉浸膏0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，琼脂粉1.7%，蒸馏水配制，pH7. 0 ；所述种子培养基的组分淀粉1 %，牛肉浸膏0. 5 %，蛋白胨0. 3 %，蔗糖1 %，酵母粉 0. 5%, CaCl2O. 5%,蒸馏水配制，pH7. 0 ；所述发酵培养基的组分淀粉0. 8%，豆饼粉3%，蛋白胨0. 2%，蔗糖2%，CaCl2O. 5%， 消泡剂0. 17%，蒸馏水配制，pH7. 0。
全文摘要
本发明涉及一种短短芽孢杆菌菌株制备羟苯乙酯的方法，先将短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX进行活化，之后依次制备种子液、液体发酵液，接着将液体发酵液进行离心、大孔树脂富集、浓缩以获得短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的次生代谢产物，然后分离纯化该次生代谢产物以获得羟苯乙酯。本发明的优点在于提供了一种获得羟苯乙酯的新途径，避免了化工合成羟苯乙酯对环境所造成的污染。
文档编号C12R1/08GK102559786SQ20121001908
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日 公开号201210019087.8
发明者刘波, 史怀, 唐建阳, 朱育菁, 车建美, 陈峥 申请人:福建省农业科学院农业生物资源研究所