专利名称：气液接触式卷烟全烟气暴露下细菌回复突变试验方法
技术领域：
本发明涉及一种气液接触式卷烟全烟气暴露下细菌回复突变试验方法，属于卷烟烟气安全性评价技术领域。
背景技术：
用于烟草毒理学评价的全烟气暴露方法由于其在模拟人体内环境、能够实现多个相关检测终点、在线即时检测原始全烟气等方面所具有的不可替代的优势，引起了世界各烟草公司和分析检测实验室的广泛关注，一些研究人员已经对该暴露方法进行了深入系统的研究[1-2]。目前，有关卷烟全烟气体外暴露检测方法已有公开报道。如申请号 200810230659. O公开了一种卷烟主流烟气的细胞毒性测试方法，主要的暴露装置是细胞培养瓶；申请号201110025480. 3公开了一种卷烟全烟气染毒的细胞毒性测试方法，主要的暴露装置是插入式细胞培养皿；专利号201120063251. 6公开了一种用于卷烟全烟气暴露的装置，基于气液接触原理而设计，使用的是处于悬浮状态的细胞，该暴露装置易与吸烟机连接；申请号201110423501. 7公开了一种气液接触式卷烟全烟气暴露下的细胞毒性检测方法，使用专利号201120063251. 6的暴露装置进行。以上文献都是关于卷烟全烟气暴露下的细胞毒性检测方法。细菌回复突变试验，简称Ames试验，是一种初筛环境诱变剂或致癌物的简便而快速的试验，主要有平板法和微量波动法两种。平板法作为经典方法被广泛用于化学品、环境污染物、天然提取物等的检测[3-4]，同时被OECD组织推荐用于各类化学品的检测[5]，也被C0RESTA组织和加拿大卫生部推荐用于卷烟主流烟气总粒相物的检测[6]。微量波动法较传统的平板法具有较为灵敏的特点，已被用于污染水体和卷烟烟气总粒相物的安全性评价[7-8]。关于微量波动法在水体致突变性检测中的应用已有公开报道。专利号201010154116. 2公开了一种水体致突变性的Ames实验微量波动法，采用鼠伤寒沙门氏菌TA98菌株测试确定了该方法的最佳剂量，并通过对TA97、TA100、TA102菌株反应情况分析，验证了反应体系的通用性，用于水质及食品等的致突变性检测。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。参考文献[I]Aufderheide M,Mohr U. AmodifiedcULTEX system for the direct exposure of bacteria to inhalable substances[J]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2004,55 :451-454.[2] Richter A, Maunders H, Massey E D, et al. A toxicogenomic study of primary human lung epithelial cells exposed to whole cigarette smoke[C]. 2005 Coresta Congress,2005.[3]Evandri MG,Battinelli L, Daniele C,et al. The antimutagenic activity of Lavandula angustifolia(lavender)essential oil in the bacterial reversemutation assay[J]. Food and Chemical Toxicology,2005,43(9) :1381-1387.[4]林春芳，陈明中.吐温80作为Ames试验中样品溶剂的可行性研究[J].中国卫生检验杂志，2011，21 (2) :371-374.[5]OECD guideline for testing of chemicals Bacterial reverse mutation test, No. 471，1997.[6]Health Canada. Bacterial reverse mutation assay for mainstream tobacco smoke, official method T-501, Second Edition[S]. Canada, 2004 1-18.[7]胡明阳，季秀玲，倪红梅，等.一种检测污染水体致突变性的快速简便方法 [J].环境监测管理与技术，2011，23 (5) :55-57.[8]邹琳，潘秀颉，吴维佳，等.微量波动Ames试验在卷烟烟气毒理学评价中的应用研究[J].湖南农业科学，2010，11 =82-84,89.
发明内容
本发明的目的在于提供一种气液接触式卷烟全烟气暴露下细菌回复突变试验方法，为卷烟烟气安全性评价提供技术支持。本发明涉及的鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium TA98菌株为实验室常规实验用菌株，从美国Molecular Toxicolog, Inc.公司购买得到。本发明所用卷烟全烟气暴露的装置为本申请人的ZL201120063251. 6。本发明的目的可通过下述技术步骤来实现I、按常规方法培养TA98菌株，菌液浓度要求600nm下的吸光值在0. 2-0. 3之间；2、配制细菌混合液，改进之处在于pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液是26mmol/L，鼠肝S9 液的体积比是1% ;3、将细菌混合液分装至ZL201120063251. 6的全烟气暴露装置的瓶内，每瓶10mL，
并将全烟气暴露瓶和直线型吸烟机连接；4、参照国标GB/T 16450要求，在吸烟机控制面板上设定卷烟抽吸参数；5、按照步骤4设定的参数进行卷烟的抽吸，使全烟气暴露瓶内的细菌混合液分别暴露于不同的卷烟烟气暴露时间下；6、暴露完毕，取下全烟气暴露瓶，用微量波动法进行细菌回复突变试验，即分别将暴露瓶内的细菌混合液接种至96孔细胞培养板内，于37°C下培养16h后，加入显色剂溴甲酚紫溶液，于37°C下继续培养48-72h后观察，孔内培养液由蓝紫色变为黄色的为阳性孔；7、结果与分析将烟气暴露组的阳性孔数与自发回复突变组的相比较，阳性孔数是自发回复突变组阳性孔数的2倍以上的即为阳性反应；绘制卷烟烟气不同的暴露时间下诱发的阳性孔数。本发明方法的优点在于易于操作，成本低廉，能快速实现细菌的卷烟全烟气暴露检测，为卷烟烟气安全性评价提供技术支持。
图I是某一混合型卷烟烟气不同的暴露时间下诱发的阳性孔数，个。
图2是某一烤烟型卷烟烟气不同的暴露时间下诱发的阳性孔数，个。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。实施例涉及的鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium TA98菌株为实验室常规实验用菌株，从国内外的菌种保藏机构购买得到。实施例所用卷烟全烟气暴露的装置为本申请人的ZL201120063251. 6。实施例一某一混合型卷烟全烟气暴露下细菌回复突变试验I、鼠伤寒沙门氏菌TA98菌株的培养将TA98菌株接种至含有30mL营养肉汤培养基的50mL无菌三角瓶中，于37°C水浴摇床中静置培养16h后，于600nm下测定细菌培养液的吸光值，要求在O. 2-0. 3之间；2、配制细菌混合液(I)用无菌去离子水配制细菌稀释液lx Vogel-Boner缓冲溶液，16g/L葡萄糖溶液，2mg/L组氨酸溶液，3mg/L生物素溶液，26mmol/L pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液，6. 6mmol/L 氯化钾溶液，I. 6mmol/L氯化镁溶液，lmmol/L葡萄糖_6_磷酸钠盐溶液，O. 8mmol/L辅酶II 溶液，1%鼠肝S9液；(2)将细菌稀释液与TA98细菌培养液按体积比100 I配制成细菌混合液；3、将细菌混合液分装至ZL201120063251. 6的全烟气暴露瓶内，每瓶10mL，并将之和直线型吸烟机连接；4、参照国标GB/T 16450要求，在吸烟机控制面板上设定卷烟抽吸参数卷烟抽吸容量35mL，抽吸持续时间2s，抽吸间隔58s，进行某一混合型卷烟的抽吸和细菌混合液的烟气暴露，烟气暴露时间分别是30s，60s，120s, 180s, 240s ；5、暴露完毕，取下全烟气暴露瓶，用微量波动法进行细菌回复突变试验，即分别将暴露瓶内的细菌混合液接种至96孔细胞培养板内，每孔50 μ L，共48孔，于 37°C下培养16h后；用去离子水配制显色剂溴甲酹紫溶液lx Vogel-Boner缓冲溶液、8g/L 葡萄糖溶液、6. 7mg/L溴甲酚紫，过滤除菌后加入96孔细胞培养板内，每孔150μ L，于37°C 下继续培养48-72h观察，孔内培养液由蓝紫色变为黄色的为阳性孔，并计数每组的阳性孔数，见表I。6、结果与分析将烟气暴露组的阳性孔数与自发回复突变组的相比较，阳性孔数是自发回复突变组阳性孔数的2倍以上的即为阳性反应，由表I知，烟气暴露组的烟气暴露时间从30s到 240s时的阳性孔数均是自发回复突变组的2倍以上，即烟气暴露组均为阳性反应；烟气暴露时间从30s到180s，阳性孔数与烟气暴露时间呈剂量反应关系。绘制卷烟烟气不同的暴露时间下诱发的阳性孔数，见图I。表I某一混合型卷烟烟气不同的暴露时间下诱发的阳性孔数，个
烟气暴露时间，S阳性孔数，个3011. 50±0. 7权利要求
1.一种气液接触式卷烟全烟气暴露下细菌回复突变试验方法，其特征在于该方法的步骤如下a、按常规方法培养TA98菌株，菌液浓度要求600nm下的吸光值在O.2-0. 3之间；b、配制细菌混合液，改进之处在于pH7.4的磷酸盐缓冲溶液是26mmol/L，鼠肝S9液的体积比是I% ;C、将细菌混合液分装至ZL201120063251. 6的全烟气暴露装置的瓶内，每瓶IOmL，并将全烟气暴露瓶和直线型吸烟机连接；d、参照国标GB/T16450要求,在吸烟机控制面板上设定卷烟抽吸参数；e、按照步骤d设定的参数进行卷烟的抽吸，使全烟气暴露瓶内的细菌混合液分别暴露于不同的卷烟烟气暴露时间下；f、暴露完毕，取下全烟气暴露瓶，用微量波动法进行细菌回复突变试验，即分别将暴露瓶内的细菌混合液接种至96孔细胞培养板内，于37°C下培养16h后，加入显色剂溴甲酚紫溶液，于37°C下继续培养48-72h后观察，孔内培养液由蓝紫色变为黄色的为阳性孔；j、结果与分析将烟气暴露组的阳性孔数与自发回复突变组的相比较，阳性孔数是自发回复突变组阳性孔数的2倍以上的即为阳性反应；绘制卷烟烟气不同的暴露时间下诱发的阳性孔数。
全文摘要
一种气液接触式卷烟全烟气暴露下细菌回复突变试验方法，属于卷烟烟气安全性评价技术领域。方法为a、培养TA98菌株，菌液浓度要求600nm下的吸光值在0.2-0.3之间；b、细菌混合液中pH7.4的磷酸盐缓冲溶液是26mmol/L，鼠肝S9液的体积比是1％；c、细菌混合液按每瓶10mL分装至ZL201120063251.6的全烟气暴露装置的瓶内并与吸烟机连接；d、按国标GB/T 16450设定卷烟抽吸参数；e、按步骤d设定的参数进行卷烟的抽吸，使全烟气暴露瓶内的细菌混合液分别暴露于不同的卷烟烟气暴露时间下；f、暴露完毕，取下全烟气暴露瓶，用微量波动法进行细菌回复突变试验；j、结果与分析。本发明的优点在于易于操作，成本低廉，能快速实现细菌的卷烟全烟气暴露检测，为卷烟烟气安全性评价提供技术支持。
文档编号C12R1/42GK102586385SQ201210018959
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者唐萍, 夭建华, 李雪梅, 米其利, 缪明明, 高茜 申请人:云南烟草科学研究院