专利名称：一种以电压门控质子通道Hv1作为乳腺癌治疗的靶向位点的基因药物的制作方法
一种以电压门控质子通道Hvl作为乳腺癌治疗的靶向位点
的基因药物
所属技术领域本发明属于生物医药技术领域，涉及一种抑制电压门控质子通道Hvl表达的药物 用途发明，其本质为电压门控质子通道Hvl的cDNA干扰片段。本发明采用基因沉默的方法 抑制电压门控质子通道Hvl的表达，从而抑制乳腺癌细胞的转移，这类药物可在乳腺癌的 诊断和治疗中得到广泛的应用。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据资料统计，发病率占全身各种恶性肿瘤 的7-10%，在妇女仅次于子宫癌。它的发病常与遗传有关，严重影响妇女身心健康甚至危及 生命。寻找乳腺癌细胞的生物标志物，对于诊断乳腺癌，尤其是早期诊断乳腺癌和判断 预后有极大帮助。这个标志物在正常组织中极少表达，而在乳腺癌组织中大量特异表达，不 仅仅可用来诊断乳腺癌或判断预后、协助分期等，同时还可以被用作免疫导向治疗的靶位 点。可以说，乳腺癌的生物标志物在乳腺癌的诊断、预防、治疗、判断预后等方面均起着重要 的作用。乳腺癌的标志物要具备以下几个条件1)该标志物特异地表达于乳腺癌组织或细 胞，就是说该标志物的特异性要高，在正常组织中极少表达，而在多数甚至绝大多数乳腺癌 组织或细胞中表达。特异性高不仅为采用该标志物诊断乳腺癌奠定了必要的基础，同时也 为以该标志物为靶点的免疫导向治疗的有效性和安全性提供了保障。2)该标志物应该与乳 腺癌细胞的发生、发展、迁移及浸润有密切关系，这样才能使基于该标志物的免疫导向治疗 药物通过相应的抗体特异地识别乳腺癌细胞。3)该标志物对于人体来说属于抗原性物质， 可以激起人体的免疫反应，这将使该标志物(抗原)具备作为乳腺癌预防性疫苗和治疗性 疫苗的潜力。目前已经发现的乳腺癌标志物有十几种，它们或与人源乳腺癌内分泌直接相 关，或可辅助乳腺癌诊断，或与乳腺癌预后相关。这些抗原包括雌激素受体(estrogen receptor ER)、孕激素受体(progesterone receptor PR),雄激素受体(androgen receptor AR)，PS2 基因又称乳腺癌雌激素诱导基因(breast cancer estrogen induced, BCEI), CA15 3 抗原，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA),泌乳素(prolactin, PRL)，肿瘤易感基因(BreastPovariancancer susceptibility gene，BRCA1)，p53 抑癌基 因，增殖细胞核抗原(proliferating cellnuclear antigen,PCNA),C-erbB-2 (HER-2/neu) 基因，组织蛋白酶D(Cath印sin-D，Cath-D)，p27抑癌基因，p21抑癌基因，转移抑癌基因 nm23 等。在已经发现的抗原中，有些虽然可作为免疫导向治疗的靶位点，但是特异性不高， 可能存在于很多种腺癌中，例如CA15 3。综上所述，目前已知的乳腺癌生物标志物中，尚缺乏一种针对乳腺癌特异性高，而 阳性率也高的标志物；对于乳腺癌主动免疫治疗来说，也缺乏一种较佳的细胞抗原靶点。因而寻找一种特异性高、在乳腺癌中表达阳性率高、对人具有抗原性的乳腺癌抗原对于人乳 腺癌的早期诊断具有十分重要的意义。本专利工作得到了国家自然科学基金(No. 30840028和No. 30970579)、 天津市基础科学和高新技术研究项目(No. 08JCYBJC25800)及教育部博士点基金 (No. 200800551035)的资助，在此表示最衷心的谢意。
发明内容本发明目的是解决现有抗原作为免疫导向治疗的靶位点特异性不高的问题，提供 一种以电压门控质子通道Hvl作为乳腺癌治疗的靶向位点的基因药物。电压门控质子通道Hvl蛋白全长为273个氨基酸残基，依据该通道各氨基酸残基 的疏水特性，可将Hvl蛋白全长划分为3个结构域N-端胞外结构域、跨膜结构域和C-端 胞外结构域。Hvl对质子具有特异高选择性，能够高效地跨膜转运质子。癌细胞周围pH值 为6. 85-6. 95，癌细胞在缺氧低pH值的酸性体液环境中易生长与扩散；当人体体液的pH值 正常时，免疫细胞的活性最强，能够吞噬和消灭癌细胞，而在酸性体液环境中，免疫细胞的 吞噬及识别功能显著下降。这暗示了电压门控质子通道Hvl极有可能和人类重大疾病有 关。因此，在本发明中我们的几种基因药物都是以电压门控质子通道Hvl为靶位点，通过抑 制其表达，从而抑制癌细胞迁移和浸润的能力。本发明是以编码电压门控质子通道Hvl的基因作为靶向位点，运用慢病毒感染的 方法来治疗乳腺癌的。电压门控质子通道Hvl的基因序列如序列表序列1所示。本发明提供的一对以电压门控质子通道Hvl作为乳腺癌治疗的靶向位点药物的 cDNA干扰片段，它的序列为Hvl-SiRNA-PLVTHM5' -CGCGTCCCCCTACAAGAAATGGGAGAATTTCAAGAGAATTCTCCCATTTCTTGTAGTTTTTGGAAAT-3 ‘(序列 2)5' -CGATTTCCAAAAACTACAAGAAATGGGAGAATTCTCTTGAAATTCTCCCATTTCTTGTAGGGGGA-3 ‘(序列 3)将它们通过pLVTHM载体包装入慢病毒，用来感染乳腺癌细胞，抑制了乳腺癌细胞 株的迁移和浸润能力，从而用于乳腺癌治疗、预防药剂中。本发明还提供了上述药物包装有cDNA干扰片段的慢病毒在制备基因治疗和基因 工程药物中的应用。本发明的优点和积极效果本发明提供的作为乳腺癌治疗的靶向位点即电压门控质子通道Hvl是一种在乳 腺癌中的表达阳性率高，在正常细胞不表达的蛋白，因而利用电压门控质子通道Hvl为靶 位点，利用本发明提供的前述抗电压门控质子通道Hvl表达的相应cDNA干扰片段制成的药 物，可以用于乳腺癌的治疗，在乳腺癌的治疗中发挥很大的作用，前景十分广阔。
图1是检测乳腺癌细胞中Hvl分布状况的免疫组化图，其中A B图显示乳腺癌细 胞被染成褐色，C图显示正常乳腺细胞未被染色。
图2是琼脂糖电泳检测电压门控质子通道Hvl的沉默情况，其中MB-231是未用慢 病毒感染细胞，siMB-231是用慢病毒感染细胞。Hvl是电压门控质子通道，GAPDH是管家基 因。图3是用western blotting检测电压门控质子通道Hvl的表达，其中MB-231是 未用慢病毒感染细胞，siMB-231是用慢病毒感染细胞。Hvl是电压门控质子通道，β-actin
是管家基因。图4是划痕试验，其中ABC分别是未用慢病毒感染的MDA-MB-231细胞在划痕0小 时，12小时，24小时的生长迁移状态。DEF分别是用慢病毒感染的MDA-MB-231细胞在划痕 0小时，12小时，24小时的生长迁移状态。
具体实施方式实施例1电压门控质子通道Hvl (人源乳腺癌重组蛋白抗原)的制备首先设计出新的人源乳腺癌抗原Hvl的c端引物，序列如下C-HvlBamH I-F :5，CGCGGATCC AAGACACGTTCAGAACGGC(序列 4)EcoR I-R :5，CGGAATTCCTAGTTCACTTCACCAAGAAG(序列 5)通过PCR扩增，双酶切PCR产物和载体pGEX6p_l并回收，连接，得到重组质 粒。这个克隆就是含有本发明提到的电压门控质子通道Hvl (人源乳腺癌抗原)DNA序列 的重组表达质粒的克隆，它命名为pGEX6p-l-c-Hvl。将pGEX6p-l-c-Hvl转化到感受态 E. coliBL21(DE3)大肠杆菌，使用0. 5mM IPTG诱导剂，进行蛋白表达。通过离子交换柱纯化 得到电压门控质子通道Hvl (人源乳腺癌重组蛋白抗原)，基因序列如序列表序列1所示。实施例2抗人源乳腺癌抗原Hvl鼠多克隆抗体的制备采用50ug/每只人源乳腺癌抗原Hvl的重组蛋白抗原混合完全福氏佐剂多点皮下 免疫Balb/c小鼠，10天后采用50ug/每只人源乳腺癌抗原Hvl的重组蛋白抗原混合不完全 福氏佐剂多点皮下第二次免疫Balb/c小鼠。第二次免疫后，间隔一周进行第三次免疫。第 三次免疫后10天采血测效价，当效价>1 106，处死动物采血，采用凝结法收集血清，低速 离心去沉淀。用生理盐水1 2稀释，上Protein A亲和层析柱纯化，pH2. 8的0. IM甘氨 酸缓冲液洗脱，IM Tris中和后对PBS透析3次，检测0D280定抗体含量，获得抗人源乳腺癌 抗原Hvl的鼠多克隆抗体。如果效价<1 106，则继续免疫至效价> 1 106。实施例3 采用电压门控质子通道Hvl的抗体作为药物诊断乳腺癌采用常规免疫组化方法，石蜡切片，以山羊血清封闭，一抗采用小鼠抗人乳腺癌抗 原Hvl多克隆抗体，二抗采用山羊抗小鼠IgG-HRP，DAB显色，苏木精染。结果如图1所示，在乳腺癌组织上着色密集，同时在正常的乳腺组织未被染色。证 明电压门控质子通道Hvl在乳腺癌细胞中高表达。实施例4 慢病毒感染沉默电压门控质子通道Hvl培养293T细胞，用含有电压门控质子通道Hvl的cDNA干扰片段Hvl-SiRNA-PLVTHM (其序列如序列2和序列3)的pLVTHM载体与包装混合质粒1 3 (w/w) 混合，感染正常的293T细胞，感染6-8小时后换成新鲜的培养液，37°C,5% CO2培养箱培养 48小时，收集上清，0. 45nm过滤，高速离心得到病毒，加入无血清无抗性的培养液中，-70°C 保存待用。将重组慢病毒加入到正常培养的MDA-MB-231细胞中，37°C，5% CO2培养箱培养 16小时，加入强力霉素，培养5天后收集细胞。(1)基因水平检测电压门控质子通道Hvl的基因采用RT-PCR的方法，分别用RNAiso Reagent提取用慢病毒感染的细胞和未用慢 病毒感染细胞的总RNA，反转录成相应的cDNA，再用合成的Hvl引物和管家基因GAPDH引物 分别扩增Hvl和GAPDH，通过琼脂糖电泳检测。结果如图2所示，未用慢病毒感染的乳腺癌细胞系MDA-MB-231含有表达电压门控 质子通道Hvl的基因，而用慢病毒感染的乳腺癌细胞系MDA-MB-231基本不含有表达电压门 控质子通道Hvl的基因。(2)蛋白水平检测电压门控质子通道Hvl的表达采用免疫印迹的方法，分别提取用慢病毒感染的细胞和未用慢病毒感染细胞的 总蛋白，经过BCA定量后，12.5% (ν/ν)的SDS-PAGE，并将蛋白转到醋酸纤维素膜上，5% (w/v)的脱脂奶粉封闭后，用小鼠抗人乳腺癌抗原Hvl多克隆抗体做一抗，用山羊抗小鼠 IgG-HRP做二抗，再经化学发光法，使用胶片感光。结果如图3所示，，未用慢病毒感染的乳腺癌细胞系MDA-MB-231表达电压门控质 子通道Hvl蛋白，用慢病毒感染的乳腺癌细胞系MDA-MB-231基本不表达电压门控质子通道 Hvl蛋白。(3)划痕试验将正常的MDA-MB-231细胞和用慢病毒感染后的MDA-MB-231细胞分别加入24孔 板中，待细胞长满后用枪头划痕，枪头要垂直，不能倾斜，用PBS洗细胞3次，去除划下的细 胞，加入培养基，放入37°C，5% CO2培养箱培养，按0，6，12，24小时取样，拍照。结果如图4所示，，用慢病毒感染后的MDA-MB-231细胞迁移能力明显低于正常的 MDA-MB-231 细胞。(4) Transwell 实验将正常的MDA-MB-231细胞和用慢病毒感染后的MDA-MB-231细胞分别加入铺好 matrigel的Transwell中，再将Transwell放入24孑L板中，在Transwell禾口 24孑L板中力口入 相同的培养液，37°C,5% CO2培养24小时，多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色，计数。结果显示，用慢病毒感染后的MDA-MB-231细胞浸润能力明显低于正常的 MDA-MB-231 细胞。根据实验的结果表明，电压门控质子通道Hvl的cDNA干扰片段可以抑制高转移乳 腺癌细胞的迁移和侵润能力，从而抑制肿瘤的转移。
权利要求
一对以电压门控质子通道Hv1作为乳腺癌治疗的靶向位点药物的cDNA干扰片段，它的序列为Hv1 SiRNA PLVTHM5′ CGCGTCCCCCTACAAGAAATGGGAGAATTTCAAGAGAATTCTCCCATTTCTTGTAGTTTTTGGAAAT 3′(序列2)5′ CGATTTCCAAAAACTACAAGAAATGGGAGAATTCTCTTGAAATTCTCCCATTTCTTGTAGGGGGA 3′(序列3)。
2.权利要求1中所述的cDNA干扰片段在制备基因治疗和基因工程药物中的应用。
全文摘要
一种以电压门控质子通道Hv1作为乳腺癌治疗的靶向位点的基因药物。本发明是以编码电压门控质子通道Hv1的基因作为靶向位点，运用慢病毒感染的方法来治疗乳腺癌。电压门控质子通道Hv1的基因序列如序列表序列1所示。本发明提供的一对以电压门控质子通首Hv1作为乳腺癌治疗的靶向位点药物的cDNA干扰片段Hv1-SiRNA-PLVTHM，其序列如序列2和序列3。根据实验结果表明，电压门控质子通道Hv1的cDNA干扰片段可以抑制高转移乳腺癌细胞的迁移和侵润能力，从而抑制肿瘤的转移。因此利用本发明提供的抗电压门控质子通道Hv1表达的相应cDNA干扰片段制成的药物，可以用于乳腺癌的治疗，在乳腺癌的治疗中发挥很大的作用，前景十分广阔。
文档编号A61K48/00GK101979549SQ20101029743
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者李树杰, 潘君成, 王一凡, 王汉中, 赵青 申请人:南开大学