超临界CO₂流体制备纳米脂质体的方法

专利名称：超临界CO₂流体制备纳米脂质体的方法
技术领域：
本发明属于药物制剂领域，具体涉及超临界微乳液耦合快速膨胀技术制备纳米脂 质体的方法。
背景技术：
纳米脂质体是以磷脂为药物载体，将药物包封于磷脂双分子层而制得的粒径小于 IOOnm的小单室脂质体(small unilamellar vesicles，SUVs)。相比于普通脂质体，纳米脂 质体具有突出的纳米效应，即小尺寸效应与表面效应，有利于改善难溶性药物的生物利用 度和吸收稳定性，提高药物的靶向作用，降低或减少药物对正常组织的损害，特别适合注射 给药。脂质体采用的制备方法有薄膜分散法、薄膜_超声波分散法、熔融法、冻融法、注 入法、逆相蒸发法、复乳法等。由于这些方法需要使用大量的有机溶剂，需要进行复杂的后 处理。更为关键的是，按传统方法制备的脂质体存在粒径较大，粒度分布不易控制等问题。超临界流体快速膨胀法(RESS)是一种新型超细粒子制备与包覆技术，其过程是 先将药物溶解在超临界CO2中，再通过喷嘴雾化喷出，经快速膨胀减压后，溶质因过饱和而 析出固体微粒。由于磷脂必须分散在水溶液中才能自发形成脂质体，常规RESS过程并不适 用脂质体形成，限制了其在脂质体形成的应用。中国专利“药物靶向脂质体的制备方法”(CN 1218746C)先将SOD药物形成乳浊液后，再利用超临界流体溶胀沉析药物。中国专利“化 妆品脂质体制备方法”(CN1254550A)、“脂溶性药物脂质体生产工艺及榄香烯脂质体注射 液” (CN1221607A)、“脂质体的生产工艺及设备” (CN148596A)都是将磷脂等原料等溶解在超 临界CO2中后，释放压力之形成微粒后，在常压下加入分散液中以形成脂质体。上述专利尽 管使用到了超临界CO2，但是脂质体膜材的溶解与分散是独立的两个步骤，未能充分利用超 临界CO2高流动性、连续过程的优势。申请者提出一种苍术酮脂质体的制备方法(苍术酮脂 质体及其制备方法，CN101703549A)，将脂质体膜材与苍术酮溶解于超临界CO2/乙醇中，溶 液经膨胀后分散缓冲溶液中，形成脂质体混悬液，使得超临界CO2介质中脂质体膜材、被包 封药物的膨胀与分散一步完成。但是，受限于超临界CO2与水的相容性问题，单纯利用RESS 技术在减小脂质体粒径还有一定局限，所制备脂质体的平均粒径在IOOnm左右，如进一步 减小脂质体的粒径，直至50nm以下，还有一定困难。超临界CO2微乳是把超临界CO2与微乳技术相结合而出现的一个崭新的领域。含 有双尾结构的磷脂可在超临界CO2中自发形成反胶团，进而增溶少量水，形成热力学稳定的 W/C(C02包水)的微乳液，微乳粒子大小在10 IOOnm之间，其质点大小可受超临界CO2参 数控制，从而为纳米材料的制备提供了模板。磷脂同时是构成脂质体的主要膜材，将磷脂在 CO2中形成的W/C微乳液经过超临界快速膨胀后喷射进水相介质中，可在超临界CO2介质中 均勻分散在水相中，获得分散性好、粒度分布均勻、平均粒度控制在IOOnm以下的纳米脂质 体混悬液。本申请将超临界流体微乳集成快速膨胀技术制备来制备纳米脂质体，相比于传统
3方法具有优势在于(1)使用化学惰性的CO2为溶剂，操作条件温和，可以防止磷脂的氧化 降解；(2)可以调节超临界CO2参数来控制微乳的质点大小或聚集分子层的厚度，为纳米脂 质体形成提供了有效模板；(3)超临界流体的快速膨胀质量传递特性(如高扩散度和低粘 度)，有利于纳米级、粒度均勻的脂质体的分散、析出与收集。整体看来，该技术将超临界微 乳模板技术与超临界快速膨胀沉析收集技术耦合起来，为超临界CO2介质中纳米脂质体的 自组装和收集提供了一条新途径，具有技术与应用的新颖性和创造性。

发明内容
本发明的目的在于提供一种超临界CO2流体制备纳米脂质体的方法。根据本发明的目的，本方法利用脂质膜材在超临界CO2中形成的微乳液作为纳米 脂质体组装的模板，并结合超临界快速膨胀技术收集脂质体，避免纳米脂质体在收集过程 中的聚集现象，实现了纳米脂质体组装与收集过程的连续完成，以解决现有技术存在的脂 质体容易团聚的不足之处。本发明所述制备纳米脂质体的方法，包括以下步骤1)在超临界反应釜内将一定量的脂质膜材与助表面活性剂溶解于超临界CO2中， 并增溶一定量的蒸馏水形成超临界微乳液；2)将所述超临界微乳液在设定的压力、温度条件下预膨胀后，以一定流速通过喷 嘴快速喷射至超临界收集釜内的水相介质中，经分散并沉析，形成脂质体混悬液；3)将CO2持续通过超临界收集釜，溶解并除去脂质体混悬液中的残余乙醇，经转子 计量计计量后排空，收集超临界收集釜内的纳米脂质体混悬液。所述脂质体膜材为磷脂酰胆碱；所述助表面活性剂为乙醇；所述水相介质为中性 磷酸盐缓冲溶液(PBS)。所述脂质膜材的用量为磷脂酰胆碱在CO2中的摩尔分数[χ (PC)]计为3. 8 X 10_4 2. 3 X 1(Γ3，优选 6. 9 XlCT4 1.9Χ10_3。所述蒸馏水的用量为水在CO2中的摩尔分数[X(H2O)]计为0 3. IX 10、优选 9. 4Χ1(Γ2 2. 3X1CT1。所述助表面活性剂的用量为乙醇在CO2中的摩尔分数[X(CH3CH2OH)]计为0 1.9X 10、优选 9. 7XlCT2 1.5Χ10Λ所述预膨胀压力为10 30MPa，优选为25 30MPa。所述预膨胀温度为323 343K，优选为333 338K。所述超临界微乳液是以2 lOL/min的流速喷射至PBS缓冲溶液，优选流速为2 5L/min。所述脂质体平均粒径为28 774nm，在优选工艺条件下制备的脂质体的平均粒径 在IOOnm以下，粒度分布窄而均勻。与现有技术相比，本发明的特点和优点在于1)以磷脂为表面活性剂在超临界CO2中形成微乳，微乳液一方面作为脂质体形成 的膜材，另一方面为脂质体的组装提供有效模板，通过调节超临界CO2参数来控制微乳的质 点大小，进一步将脂质体粒径控制在IOOnm以内。2)直接将磷脂的超临界溶液直接喷射进水相中能制备符合药典要求的脂质体，但 是进一步制备粒径更小的纳米脂质体存在一定的困难。由于磷脂在CO2中形成的W/C微乳
4液与水、CO2亲和性较好，强化了 CO2与水溶液的混合传质作用，解决了脂质膜材在缓冲液中 不易扩散的问题，显著改善脂质体团聚现象，所制备的脂质体粒度分布窄而均勻。3)将超临界微乳液与超临界CO2快速膨胀耦合起来，使脂质体的制备与收集在超 临界CO2介质中连续完成，为进一步包封热敏性、不稳定药物创造了条件。


图1显示本发明制备纳米脂质体的方法的一种实施方式的流程图，其中ICO2钢 瓶；2热交换器1 ；3冷机；4高压泵1 ；5热交换器2 ；6反应釜；7液体储罐；8高压泵2 ；9回 压调节阀；10热交换器3 ； 11喷嘴；12收集釜；13转子流量计；14量筒图2显示根据本发明方法制备的纳米脂质体的微观结构的透射电镜(TEM)图；图3显示根据本发明方法制备的纳米脂质体的表面微观结构的扫描电镜(SEM) 图；
图4显示根据本发明方法制备的纳米脂质体的粒度分布图。
具体实施例方式为了更好地理解本发明的实质，以下实施例用于详细说明本发明的技术内容，但 不应理解为对本发明保护范围的限制。实施例1纳米脂质体的制备与测定1.纳米脂质体的制备磷脂酰胆碱，上海伯奥生物工程公司提供；实验装置江苏华安超临界反应装置，其中快速膨胀部件由华南理工大学现代化 技术中心设计制造，反应釜容量为1L，收集釜容量为2L，最大承受压力35MPa，最高温度 368K。制备方法在一种实施方式中，本发明制备纳米脂质体的方法可以在超临界0)2反 应装置中完成，流程图如图1所示。具体步骤为将22g磷脂酰胆碱[X(PC) = 1.7X ΙΟ"3] 溶解于150mL乙醇[X(CH3CH2OH) = 1. 5X IO"1]中，注入CO2流体反应釜6中，将PBS缓冲 溶液500mL注入收集釜12中，封盖。打开CO2钢瓶，CO2气体经冷机3冷却成液体后，由高 压计量泵4加压后进入反应釜6，反应釜的温度由换热器5控制。储罐7中的60mL蒸馏水 [X(H2O) = 1.9X10"1]由高压计量泵8按lmL/min速度注入反应釜。在预膨胀压力30MPa， 预膨胀温度为338K下孵育2h，直至微乳液充分形成。收集釜12的压力设定为5MPa，温度 设定为298K。控制超临界CO2沉析条件，快速释放压力，形成的微乳液随CO2经喷嘴11以 5L/min的流速喷射进收集釜12，使脂质体均勻分散在PBS缓冲溶液中。喷射过程结束后， 保持压力继续向收集釜中通入CO2,使混悬液中的乙醇随CO2流出收集釜，并经转子流量计 13排空，收集制成的脂质体混悬液。2.纳米脂质体的表征实验仪器JEM-1230透射电镜(TEM)，日本电子公司；Hitachis_3400N扫描电子 显微镜(SEM)日本日立公司，Malven Zetasizer Nano ZS动态激光纳米粒度分布仪，英国 Malvern仪器公司。测定方法取脂质体1滴，稀释100倍后滴在铜网上，利用透射电镜对脂质体微观形态进行观察并拍照。同时取脂质体1滴，稀释100倍后滴在铜台上，真空冷冻干燥后喷金 导电，利用扫描电镜对脂质体表面形态进行观察并拍照。再取脂质体一滴，稀释100倍后， 动态激光纳米粒度分布仪测定脂质体的粒径。对制备的纳米脂质体进行表征与粒径测定，脂质体的微观结构与表面形态如图2、 图3所示，粒径及粒度分布见图4。表征结果显示，脂质体呈高度分散状态，微观呈清晰的双 层膜结构，表面形态为球形或椭球形，呈现脂质体的典型微观特征。脂质体粒径为11. 7 78. 8nm，平均粒径为28. 4nm，粒径分布呈单峰正态分布，优于中国药典关于纳米药物的质量 标准。实施例2磷脂用量对脂质体形成的影响本实施例考察形成微乳所需磷脂用量[磷脂在超临界CO2摩尔分数，X(PC)]对 纳米脂质体形成的影响。控制X(PC)为3.8X10—4 2.3X10—3，乙醇和水的用量分别设为 χ (CH3CH2OH) = 1. 5 X KT1 与 X(H2O) = 1. 5 X Ι Γ1，在预膨胀压力 25MPa，预膨胀温度为 333K 下平衡2h。形成的超临界微乳液以2L/min喷射进缓冲溶液中，收集所制备的脂质体混悬 液。按实施例1的方法与参数，测定所制备脂质体的平均粒径与粒径分布，结果如表1所示。表1磷脂用量对纳米脂质体制备的影响
权利要求
一种超临界CO2流体制备纳米脂质体的方法，包括以下步骤1)在超临界反应釜内将一定量的脂质膜材与助表面活性剂溶解于超临界CO2中，并增溶一定量的蒸馏水形成超临界微乳液；2)将所述超临界微乳液在设定的压力、温度条件下预膨胀后，以一定流速通过喷嘴快速喷射至超临界收集釜内的水相介质中，经分散并沉析，形成脂质体混悬液；3)将CO2持续通过超临界收集釜，溶解并除去脂质体混悬液中的残余乙醇，经转子计量计计量后排空，收集超临界收集釜内的脂质体混悬液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质膜材为磷脂酰胆碱(PC)；所述助表面活 性剂为乙醇；所述水相介质为中性磷酸盐缓冲溶液(PBS)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质膜材的用量为磷脂酰胆碱在在CO2 中的摩尔分数[X(PC)]计为3.8X10_4 2.3X10_3，蒸馏水的用量为水在CO2中的摩 尔分数[X(H2O)]计为0 3. IX ΚΓ1，助表面活性剂的用量为乙醇在CO2中的摩尔分数 [χ (CH3CH2OH)]计为 0 1. 9 X ICT1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述预膨胀压力为10 30MPa；预膨胀温度为 323 343K ；所述超临界微乳液是以2 lOL/min的流速喷射至水相介质中。
全文摘要
本发明公开了一种超临界CO2流体制备纳米脂质体的方法，该方法包括步骤1)在超临界反应釜内将一定量的脂质膜材与助表面活性剂溶解于超临界CO2中，并增溶一定量的蒸馏水形成超临界微乳液；2)将所述超临界微乳液在设定的压力、温度条件下预膨胀后，以一定流速通过喷嘴快速喷射至超临界收集釜内的水相介质中，经分散并沉析，形成脂质体混悬液；3)将CO2持续通过超临界收集釜，溶解并除去脂质体混悬液中的残余乙醇，经转子计量计计量后排空，收集超临界收集釜内的脂质体混悬液。该技术利用脂质膜材在超临界CO2中形成的微乳液作为脂质体组装的模板，并结合超临界快速膨胀技术收集脂质体，为纳米脂质体的制备提供了一条新途径。
文档编号A61K9/127GK101972228SQ201010297180
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者刘剑洪, 刘波, 文震, 游新奎, 蒲一涛, 郑宗坤 申请人:深圳大学