一种快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法，将沉默目的基因片段通过酶切连接的方式连接到TRV?GFP载体，转化农杆菌后，通过调整真空抽吸压强和抽吸方式，将携带沉默目的基因的TRV?GFP载体侵染入观赏海棠组培苗中；进一步通过抗生素培养和手提紫外灯荧光筛选，得到观赏海棠沉默阳性株系；沉默目的基因的观赏海棠组培苗阳性植株在侵染7天后，进行表型观察和半定量PCR筛选，从而构建完整的观赏海棠瞬时基因沉默体系。能够快速、高效的侵染观赏海棠组培苗植株，并能够方便进行沉默阳性植株筛选，进行基因沉默分析，改进了木本植物瞬时表达效率低等缺陷，能够应用于观赏海棠基因功能研究，为今后的观赏海棠遗传育种工作奠定基础。
【专利说明】
-种快捷的观赏海巣组培苗瞬时基因沉默的方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种植物功能基因组研究技术，尤其设及一种快捷的观赏海棠组培苗 瞬时基因沉默的方法。
【背景技术】
[0002] 病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)在植物功能基因组 研究中是一种方便快捷的研究工具。通常情况下，VIGS的祀标是通过构建一个重组病毒载 体携带上内源基因的片段来进行沉默实验化umagai et al. ,1995)。一旦病毒侵入到宿主 植物体中，宿主体内的像转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS) 的防御机制就会被激活，PTGS会祀标植物病毒通常产生的双链RNA，剪切双链RNA并产生 siRNA。运样siRNA会组装成RNAi沉默复合体(RNAi silencing comp lex, RISC)来降解内源 与siRNA同源的基因（Burch-Smith et al. ,2004)。由于VIGS是一种瞬时作用的方法，所W 它被认为是一种快速简便研究基因功能的方法，并且可W对一些突变致死基因也可W进行 研究。
[0003] 烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV;Liu et al. ,2002)是一种广泛应用 的VIGS植物病毒载体并且已经成功应用于多种植物中，包括烟草叶片，拟南芥，番茄果实， 矮牵牛花朵，月季花瓣和草替。但是自从VIGS载体从植物病毒中开发出来后，VIGS的应用具 有物种特异性。TRV载体更易于侵染茄科植物，例如:烟草、番茄、辣椒和矮牵牛。但是对于非 茄科植物和木本植物，侵染效率就会很低，像苹果、月季。
[0004] 前期工作中，
【申请人】将EGFP融合的开放阅读框融合到TRV载体的Coat Protein的 3 '末端，产生TRV-GFP载体。TRV-GFP载体在多种植物中进行了验证，包括:烟草、拟南芥、月 季、草替和菊花。结果表明，TRV-GFP载体侵染的植株能够被手提紫外灯检测，并且TRV-GFP 载体的侵染效率与TRV原始载体相同。所WTRV-GFP载体是一个新的研究植物功能基因组学 的工具，特别是对于非茄科植物。
[0005] 木本植物的遗传转化效率极低，且需要大量时间才能观察到表型并进行相关分 析。瞬时表达是一种快速有效的分析基因功能的方式，近年来得到了广泛的应用，但是在木 本植物中进行瞬时表达的方式也存在效率低，效果不稳定等缺点。因此，现有技术中，对于 TRV-GFP载体能否广泛应用于苹果、海棠等木本植物尚不清楚(Tian et al. ,2015)。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种快速、大量、有效并筛选方便的快捷的观赏海棠组培苗 瞬时基因沉默的方法。
[0007] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的：
[000引本发明的快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法，包括步骤：
[0009]将沉默目的基因片段通过酶切连接的方式连接到TRV-GFP载体，转化农杆菌后，通 过调整真空抽吸压强和抽吸方式，将携带沉默目的基因的TRV-GFP载体侵染入观赏海棠组 培苗中；
[0010] 进一步通过抗生素培养和手提紫外灯巧光筛选，得到观赏海棠沉默阳性株系；
[0011] 沉默目的基因的观赏海棠组培苗阳性植株在侵染7天后，进行表型观察和半定量 PCR筛选，从而构建完整的观赏海棠瞬时基因沉默体系。
[0012] 由上述本发明提供的技术方案可W看出，本发明实施例提供的快捷的观赏海棠组 培苗瞬时基因沉默的方法，针对观赏海棠运一木本植物，构建基于TRV-GFP载体的基因沉默 体系，该体系能够快速、高效的侵染观赏海棠组培苗植株，并能够方便进行沉默阳性植株筛 选，进行基因沉默分析，改进了木本植物瞬时表达效率低等缺陷，本发明能够应用于观赏海 棠基因功能研究，为今后的观赏海棠遗传育种工作奠定基础。
【附图说明】
[001引图la至图Ic为本发明实施例中TRV-GFP载体构建示意图，其中：
[0014]图la为TRV1载体示意图；
[001引图化为TRV2-GFP载体示意图；
[0016] 图Ic为McRDMl基因通过酶切连接的方式插入TRV-GFP载体，生成PTRV2-GFP- Mc畑Ml载体示意图；
[0017]图2为本发明实施例中沉默与对照植株的半定量PCR分析结果示意图。
[0018] 图3本发明实施例中双酶切电泳图。
【具体实施方式】
[0019] 下面将对本发明实施例作进一步地详细描述。
[0020] 本发明的快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法，其较佳的【具体实施方式】 是：
[0021] 包括步骤：
[0022] 将沉默目的基因片段通过酶切连接的方式连接到TRV-GFP载体，转化农杆菌后，通 过调整真空抽吸压强和抽吸方式，将携带沉默目的基因的TRV-GFP载体侵染入观赏海棠组 培苗中；
[0023] 进一步通过抗生素培养和手提紫外灯巧光筛选，得到观赏海棠沉默阳性株系；
[0024] 沉默目的基因的观赏海棠组培苗阳性植株在侵染7天后，进行表型观察和半定量 PCR筛选，从而构建完整的观赏海棠瞬时基因沉默体系。
[0025] 所述沉默目的基因片段主要为5'段编码区序列。
[0026] 本发明针对木本植物瞬时表达效率低运一缺点，通过TRV-GFP载体介导，采用真空 抽吸的方式，在观赏海棠组培植株上沉默了Me畑M基因，并通过巧光表型、半定量PCR等方式 进行了验证。确定了基于TRV-GFP载体的VIGS系统能够通过真空抽吸的方式，快速侵染观赏 海棠组培苗植株，应用于观赏海棠植株进行基因沉默分析，可W在今后的育种工作中得到 进一步应用。
[0027] 本发明主要是将合适的沉默目的基因片段，主要为5'段编码区序列，通过酶切连 接的方式连接到TRV-GFP载体，转化农杆菌后，通过调整合适的真空抽吸压强和抽吸方式， 将携带沉默目的基因的TRV-GFP载体侵染入观赏海棠组培苗中；进一步通过抗生素培养和 手提紫外灯巧光筛选，得到观赏海棠沉默阳性株系;沉默目的基因的观赏海棠组培苗阳性 植株在侵染7天后，进行表型观察和半定量PCR筛选，从而构建完整的快速高效观赏海棠瞬 时基因沉默体系。
[0028] 本发明的有益效果：
[0029] 本发明主要是针对观赏海棠运一木本植物，构建基于TRV-GFP载体的基因沉默体 系，该体系能够快速、高效的侵染观赏海棠组培苗植株，并能够方便进行沉默阳性植株筛 选，进行基因沉默分析，改进了木本植物瞬时表达效率低等缺陷，本发明能够应用于观赏海 棠基因功能研究，为今后的观赏海棠遗传育种工作奠定基础。
[0030] 具体实施例，如图la至图3所示：
[0031 ]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 实施例1.在观赏海棠组培苗中沉默McRDMl基因：
[0034] 1.沉默观赏海棠 RDM1基因的TRV-GFP载体的获得：
[0035] WMc畑Ml基因编码区序列设计引物McRDM 1-F、Me畑M1-R，引物5 '端和3 '端分别加 上Xbal和Kpnl酶切位点，W克隆有Me畑Ml基因的质粒为模板进行PCR，PCR产物纯化。用Xbal 和Kpnl限制性内切酶（购自化W England Biolabs公司）双酶切Me畑Ml的PCR产物和TRV2- GFP载体，反应体系和反应条件如表1。电泳后回收大片段，如图3。利用宝生物工程有限公司 的T4 Vector载体将酶切后的McRDMl基因和TRV2-GFP载体连接。连接体系为TRV2-GFP载体 0.化L，Me畑Ml基因目的片段DNA 7.化L，T4酶化L，10 X Buf f er化L混匀后4 °C连接20h-24h。
[0036] 引物序列如下：
[0037] McRDMl-F：
[00；3 引
[0039]
[0040]
[0041] 表1双酶切反应体系与反应条件
[0042]
[0043] 2. TRV-GFP-McRDMl转化观赏海棠组培苗
[0044] 含有TRV-GFP-McRDMl载体的农杆菌3101 菌株28°C下在添加了lOmM MES，20mM AS, lOOiig ? L-iRif(Rifampicin)and 50yg ? L-iKan化anamycin)的LB培养基中培养 12-16小时 培养。5000巧111离屯、10111；[]1收集菌液，用侵染8证'6'(1011111旨〔12,2001111日。61:〇371'；[叫0]16, and lOmM MES,抑5.6)悬浮菌体。在00600下调整到菌液浓度至00600=1.0，^1:1的比例 混合，室溫黑暗条件下静置4小时。侵染液中添加0.01 %的Si Iwet L-77。空载体TRV-GFP操 作与TRV-GFP-Mc畑Ml载体的操作相同。
[0045] 真空抽吸使用GAST牌真空累(D0A-P504-BN)和真空干燥器，观赏海棠组培苗在超 净工作台放入盛有农杆菌悬浮液的锥型瓶中，封上封口膜。真空抽吸直至-25kPa，有大量气 泡出现在叶片表面停止抽吸，保持Imin后，缓慢释放到大气压强;开盖把植株旋转方向后， 重复上述操作一次。侵染后，吸净组培苗表面所有菌液，置于灭菌的去离子水中刷洗2遍，然 后将组培苗接种到新的含有抗生素的MS培养基（1L MS培养基配制:MS粉4.33g，薦糖20g，琼 脂粉7g)中，并黑暗处理4她。
[0046] 暗处理后的观赏海棠组培苗置于智能光照培养箱中，观赏海棠组培苗生长条件为 白天20°C，晚上18°C，通过昼夜溫差促进病毒的繁殖和扩散。
[0047] 3. TRV-GFP-McRDMl转化观赏海棠组培苗阳性植株的筛选：
[0048] GFP巧光检测:侵染7天后，整株观赏海棠植株使用lOOw手持长波紫外灯检测GFP巧 光化V products，Upland，CA 91786，Black Ray model B 100AP/R)，在侵染植株的新生叶 片中观察GFP巧光，应表现为明显的黄绿色的巧光，并且使用Kodak wratten filter 15滤 光片进行拍照。
[0049] 抗生素筛选:将组培苗接种到新的含有抗生素的MS培养基(抗生素工作液浓度:卡 那霉素50yg/mL，头抱霉素500yg/mL)中，筛选阳性植株。
[0050] 4. TRV-GFP-McRDMl转化观赏海棠组培苗阳性植株的的表型观察和分析
[0051] 表型观察:观赏海棠畑Ml基因与花色素巧积累呈正相关，同时TRV病毒能够运输并 大量积累在植株新生器官中，因此沉默RDM1基因后，观赏海棠沉默植株新生叶片应表现为 绿色。侵染7天后，观察沉默侵染植株的新生叶片，生成绿色叶片的植株结合GFP巧光初选为 侵染阳性植株，同时空载体侵染植株新生叶片应保持红色。
[0052] 侵染阳性植株的半定量PCR检测：总RNA分别从初选的侵染阳性植株和对照植株， 使用RNase打ee面ase I(Promega，USA)处理。使用化g总RNA进行第一条链cDNA合成，TRV1 和TRV2检测使用TRV特定引物(P化156 R和0YL198)进行反转录，oligod(T)引物用于目的基 因的反转录，CP-GFP使用随机引物进行反转录。侵染阳性植株和对照植株能够检测到TRV1、 TRV2、CP-GFP、GFP条带，同时侵染阳性植株的畑Ml表达水平应明显低于对照植株。
[0053] W上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该W权利要求书的保护范 围为准。
【主权项】
1. 一种快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法，其特征在于，包括步骤： 将沉默目的基因片段通过酶切连接的方式连接到TRV-GFP载体，转化农杆菌后，通过调 整真空抽吸压强和抽吸方式，将携带沉默目的基因的TRV-GFP载体侵染入观赏海棠组培苗 中； 进一步通过抗生素培养和手提紫外灯荧光筛选，得到观赏海棠沉默阳性株系； 沉默目的基因的观赏海棠组培苗阳性植株在侵染7天后，进行表型观察和半定量PCR筛 选，从而构建完整的观赏海棠瞬时基因沉默体系。2. 根据权利要求1所述的快捷的观赏海棠组培苗瞬时基因沉默的方法，其特征在于，所 述沉默目的基因片段主要为5'段编码区序列。
【文档编号】C12N15/82GK106047920SQ201610391259
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】姚允聪, 田佶, 宋婷婷, 张 杰, 韩振云
【申请人】北京农学院