一种生产α?酮戊二酸的双酶共表达菌株的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种生产α?酮戊二酸的双酶共表达菌株的构建方法，属于发酵工程和酶工程技术领域。本发明在分析L?谷氨酸生产α?酮戊二酸的基础上，分析转化体系所需KatG用量；随后从转录水平和翻译水平共构建了不同表达水平的双酶共表达菌株，并通过摇瓶水平全细胞转化L?谷氨酸生产α?酮戊二酸来评价共表达菌株性能，转化条件为：110g/L L?谷氨酸，2～2.5g/L菌体，pH 6.5磷酸缓冲液体系，30℃，200rpm条件下转化18～24h。其中，最优菌株F006α?酮戊二酸产量可以达到107.2g/L，转化率为98.4％，完全替代外源添加过氧化氢酶；增加菌体浓度，132g/L底物条件下α?酮戊二酸的产量可以达到127.1g/L，转化率96.9％。
【专利说明】
-种生产a-酬戊二酸的双酶共表达菌株的构建方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种生产a-酬戊二酸的双酶共表达菌株的构建方法，属于发酵工程和 酶工程技术领域。
【背景技术】
[0002] a-酬戊二酸(a-ketoglu化rate,简称a-KG)作为一种重要的高值精细化学品（20- 25万元/吨），广泛应用于食品、医药、化工和化妆品等工业领域中。在医药领域中，a-KG能减 轻肾病患者的肾脏负担、减少并发症和促进患者手术后快速恢复;与精氨酸等氨基酸复配， 能快速帮助运动员补充能量，广泛应用于功能性营养强化剂;除此W外，由于a-KG特殊的化 学性质，被广泛用于化学合成行业。随着a-KG应用领域的不断拓展，导致国内和国际市场对 a-KG的需求不断增力日。从海关了解到的数据，目前国际市场对食品级a-KG需求量缺口达5万 吨W上，而目前食品级a-KG市场价格为20-25万元/吨，且面临有价无市的窘境。a-KG的生产 方法包括:化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。目前，工业化生产a-KG主要采用有机合 成法，设及一系列复杂的化学反应过程，从而引起原料来源、环境污染等方面一系列问题。 同时由于化学法合成a-KG过程中存在严重的安全问题，导致a-KG难W直接用于食品、医药 和化妆品等领域。因此，如何采用生物技术法大规模制备安全性高的0-KG，是国内外学术界 和产业界所关注的焦点问题。
[0003] 本研究室前期构建了k谷氨酸氧化酶高效表达菌株E.coli FMME089,并通过高密 度发酵手段实现了k谷氨酸氧化酶的大规模制备，使酶法转化k谷氨酸生产a-KG的工业化 生产成为可能。然而在酶法转化过程中需要添加过氧化氨酶，工业用过氧化氨酶中杂质较 多对a-KG产品后期的分离纯化造成困扰且外源添加过氧化氨酶造成成本较高。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，降低成本，本发明旨在原有レ谷氨酸生产a-KG体系的基础上 实现不添加过氧化氨酶条件下的高效率转化，构建符合条件的k谷氨酸氧化酶和过氧化氨 酶共表达菌株。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种生产a-酬戊二酸的双酶共表达菌株的构建方法， 所述方法在全细胞转化心谷氨酸生产a-酬戊二酸转化体系基础上预测所需k谷氨酸氧化 酶和过氧化氨酶的用量，进而通过分子生物学手段从转录和翻译水平调节双酶表达来构建 k谷氨酸氧化酶和过氧化氨酶的共表达菌株，实现两种酶不同表达量的要求，W达到该转 化体系下a-酬戊二酸高效生产，过程中无需过氧化氨酶的额外添加。
[0006] 所述方法，在构建单酶表达菌株测定酶学性质基础上确定双酶需求量，通过双酶 不同构建方式、SD序列与起始密码子ATG之间的间隔W及RBS序列强度优化等方法逐步实现 两种酶各种所需表达量要求，同时通过转化反应对共表达菌株性能进行验证。
[0007] 所述全细胞转化レ谷氨酸生产a-酬戊二酸转化体系是谷氨酸氧化酶重组菌 株E.coli FMME089进行全细胞转化。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述转化体系是指谷氨酸或者谷氨酸钢为底物 生产a-KG的方法，在抑6.0-8.0，溫度30-42°C下，转化18-24h，催化生产a-酬戊二酸。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述全细胞转化k谷氨酸生产a-酬戊二酸转化体系 及转化条件为：1 lOg/L ^谷氨酸，2~2.5g/L菌体，pH 6.5憐酸缓冲液体系，30~42°C， 200巧m条件下转化24h。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述底物浓度为110-135g/L。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌或共表达菌株为WE.coli BL21 (DE3)为宿主菌、WpET28a表达载体；L -谷氨酸氧化酶来源于 5付691:〇1117。日3旨11日]1日日]131341'〔〔14672，过氧化氨酶来源于6.。〇1;[1(12。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述心谷氨酸氧化酶和过氧化氨酶的性质是通过分 别构建酶的高效表达菌株FXC001和FXC007，诱导表达、破碎、离屯、、过滤、挂柱、洗脱及脱盐 等过程后测得。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述过氧化氨酶的用量是通过转化体系中直接添加 纯化后的过氧化氨酶直接测得。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述过氧化氨酶的需求量最低为lOOOU/mL。
[0015] 所述分子生物学手段是指通过基因克隆技术、PCR技术、融合表达技术、RBS强度预 测技术、质粒构建技术等，设及分子生物学领域的一些分子操作。
[0016] 所述转录水平调控双酶表达是指通过双酶不同构建方式如单启动子双酶双联表 达、双启动子双酶串联表达、单启动子双酶融合表达等来构建共表达质粒，其中心谷氨酸氧 化酶均位于过氧化氨酶之前，构建完成的=株共表达菌株分别命名为F001，F002和F003。
[0017] 所述翻译水平调控双酶表达是指通过改变SD序列与起始密码子之间的间隔或者 RBS序列强度调节核糖体与mRNA的结合强度，进而影响翻译起始速率，在翻译水平上调节蛋 白质表达量。所述SD序列与起始密码子ATG之间的间隔优化是指通过优化过氧化氨酶基因 前端的SD序列与起始密码子之间的间隔调控过氧化氨酶的不同表达量，间隔设定在3bp~ 1化P，分别构建了四株共表达菌株并命名为FXC003~FXC006。所述RBS序列强度优化是指通 iiRBS Calculator vl. Uhttps://www. denovodna.com/software/)预测j达菌J一定表达量 所需的过氧化氨酶基因前端RBS强度及翻译起始速率TIF>24,000au，从而设计4组符合要 求的RBS序列，构建双酶串联表达质粒，k谷氨酸氧化酶位于过氧化氨酶之前，构建成功的 四株共表达菌株分别命名为F004~F007。
[0018] 在本发明中所有重组菌的性能评价均在同一条件下诱导测定产酶效果，随后利用 菌体或者酶系转化k谷氨酸生产a-KG。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述诱导的诱导剂添加为0D600在0.6~1.2之间时， 添加0.3~0.5mmol/L IPTG或者3~7g/L乳糖诱导。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，所述诱导的诱导溫度为25-30°C。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述诱导的诱导时间为4-化。
[0022] 所述方法中，对于发酵培养基，本领域技术人员完全可W根据现有的大肠杆菌培 养基，选择适合产酶的培养基或者是进一步对培养基进行优化。
[0023] 所述方法中，对于转化体系，本领域技术人员完全可W根据现有转化，选择合适的 类似缓冲液体系和转化条件或者是进一步添加辅助因子。
[0024] 本发明的第二个目的是提供一种共表达レ谷氨酸氧化酶和过氧化氨酶的DM片 段，所述DNA片段由编码k谷氨酸氧化酶的基因序列、连接序列、编码过氧化氨酶的基因序 列依次连接而成。
[0025] 所述レ谷氨酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[00%] 所述过氧化氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核巧酸序列如SEQ ID NO.4所 /J、- 〇
[0027] 所述连接序列的核巧酸序列如沈Q ID NO.5、SEQ ID NO.6或者沈Q ID NO.7所示。
[0028] 本发明的第S个目的是提供表达所述DM片段的重组载体或者重共表达菌株。
[0029] 所述重组载体，是将所述DNA片段连接到祀T28a表达载体上得到的。
[0030] 所述共表达菌株，是将所述重组载体转化到宿主大肠杆菌中得到的共表达菌株。 [0031 ]本发明的第四个目的是提供所述DNA片段经表达后得到的酶系。
[0032] 本发明的第五个目的是提供所述酶系或者共表达菌株在转化生产a-酬戊二酸方 面的应用。
[0033] 在本发明的一种实施方式中，所述应用，是Wレ谷氨酸或谷氨酸钢为底物，在pH 6.0-8.0，溫度30-42°(：下，转化18-2地，利用所述酶系或者共表达菌株催化生产〇-酬戊二 酸。
[0034] 在本发明的一种实施方式中，所述应用需要添加1~5mmol/L的MnCl2作为两种酶 的激活剂。
[0035] 在本发明的一种实施方式中，所述底物的浓度为110-135g/L。
[0036] 本发明的有益效果：
[0037] 1、应用本发明方法先后得到11株心谷氨酸氧化酶和过氧化氨酶共表达菌株，实现 了两种酶的不同表达水平的高效表达；
[0038] 2、应用本发明合理实现了目标酶特定的表达量范围；
[0039] 3、部分共表达菌株在额外添加 Mn2+条件下，也可W实现无过氧化氨酶添加条件下 a-酬戊二酸的高效生产；
[0040] 4、共表达菌株F006发酵得到的菌体细胞可W直接用于转化生产a-KG，底物转化率 可达98.7%，既无过氧化氨酶添加也无需添加 Mn2+;
[0041 ] 5、在llOg/L心谷氨酸，2~2.5g/L菌体，pH 6.5憐酸缓冲液体系，30°(：，200巧111条 件下转化18~2地，最优菌株。006的〇-酬戊二酸产量可^达到107.2肖凡，转化率为98.4%， 完全替代外源添加过氧化氨酶且无需添加 Mn2+;增加菌体浓度，132g/L底物条件下a-酬戊二 酸的产量可W达到127. Ig/L，转化率96.9 %。
【附图说明】
[0042] 图1:重组LG0X纯化及SDS-PAGE分析（1为发酵液，2为重组菌，3为Ni柱纯化后LG0X， 4为脱盐后LG0X);
[0043] 图2:重组KatG纯化及SDS-PAGE分析（1为化21空质粒菌，2为重组菌，3为纯化后蛋 白）；
[0044] 图3:30°C下LG0X的溫度稳定性；
[0045] 图4:Lineweave;r-Burk 双倒数曲线；
[0046] 图5 :KatG添加量对转化的影响；
[0047] 图6:不同间隔共表达质粒的构建；
[0048] 图7:不同RBS强度共表达菌株蛋白电泳图；
[0049] 图8:全细胞催化剂对转化的影响。
【具体实施方式】
[0050] 实施例化-谷氨酸氧化酶性质研究及过氧化氨酶需求量确定
[0051 ] 分别将来源于Str邱1:〇1117。63旨11日]1日6]131341'〔〔14672的心谷氨酸氧化酶（LG0X)基因 (氨基酸序列如560 10^).1所示，核巧酸序列如560 10^.2所示），来源于6.(3〇111(12的 过氧化氨酶基因肪*6(氨基酸序列如56〇10^).3所示，核巧酸序列如56〇10^.4所示）， 通过引物 1 (上游引物：5 ' -CATGCCATGGCAATGCTGCCCGCACCGGCCGCCT-3 '，序列如SEQ ID 側.8;下游引物：5'-〔〇：446(：1761'〔4〔6口'616了6641'口'〇：446-3'，序列如沈9 10側.9)^及引 物2(上游引物：5'-〔416〇：4166〔441646〔4〔61'〔464〔641'-3'，序列如560 10^.10;下游引 物：5^ -CCCAAGCTTGCAGCAGGTCGAAACGGTC-3'，序列如沈Q ID NO. 11)克隆表达于质粒祀T28a 中，重组质粒转入E.coli BL21 (DE3)中，筛选出阳性菌株分别命名为FXC001和FXC007。重组 菌株于TB培养基中诱导表达，当OD600为0.6-1.2之间时加入0.4mmol/L的IPTG进行30°C诱导 5~化，随后经过破碎、离屯、、过滤、挂柱、洗脱及脱盐处理后分别获得两种纯化后的酶（图1 和图2)，蛋白大小分别为65kDa和80kDa。最后，对两种酶进行性质研究。
[0052] 1)测定30°C条件下LG0X的活性随时间的变化值，拟合失活方程曲线（图3)计算出 该酶的半衰期为4.62h;随后对其动力学参数进行了测定，得到图4所示Lineweaver-Burk双 倒数曲线，计算出LG0X的结合常数Km为6.32mmol ? L-i，Vmax为40皿〇1 ? min-i ? mg-i，对应的 kcat 为 1.23min_i。
[0化3] 2)在转化体系（110g/Lレ谷氨酸，2~2.5g/LE.coliFMME089菌体，pH6.5憐酸缓 冲液)基础上，通过添加0~2000U/mL纯化后的KatG测定24h内a-KG的产量，结果见图5，粗略 估算该转化体系共需要该类过氧化氨酶的用量为1250U/mL或W上(此时转化率超过95%)， 确定了共表达菌株中所需该基因的表达水平。
[0054] 实施例2双酶共表达菌株转录水平调控
[0055] WpET28a为表达载体设定了S种不同策略构建共表达菌株，策略1采用单启动模 式将LG0X和KatG串联表达，通过与LG0X前相同的RBS序列连接KatG，构建成功的共表达菌株 命名为F001;策略2采用双启动子模式与LG0X和KatG前面添加同样的启动子及相关序列，构 建共表达菌株命名为F002;策略3采用单启动子模式将LG0X和KatG通过化nd III直接串联 在一起，构建成功的共表达菌株命名为F003。其中，策略1会转录生产一条mRNA，含有两个核 巧酸结合位点，翻译出两条蛋白；策略2会转录出一大一小两条mRNA，均含有核巧酸结合位 点，翻译出两条蛋白；策略3会转录出一条mRNA，仅含有一个核巧酸结合位点，翻译出一条融 合蛋白。其中，策略2的KatG蛋白表达量由于策略1，希望能得到不同KatG表达量的菌株;策 略3可W实现LG0X和KatG的肤链数目一致，期望一个融合酶能够完成目标反应，两种酶的活 性与折叠结构有关不易判断。
[0056] 重组菌接种于LB种子培养基上10-1化后，W4%的接种量转接到TB培养基中，当 ODsoo为0.6-1.2之间时加入0.4mmol/L的IPTG进行30°C诱导5~化;随后离屯、获得共表达菌 体，在1 lOg/L心谷氨酸、2~2.5g/L菌体等转化条件下反应24h; 3株共表达菌株的产酶效果 和转化效果整理成表格1，可W发现KatG酶活F002〉F001〉F003，LG0X活性F003〉F001〉F002， a-KG产量。003光001光002，且〇-1?产量。001与。003相差不大。因此，可^看出相同启动子串 联表达不利于双酶表达，大片段基因融合表达可操作性较差且无法确定双酶活性，单启动 子双酶串联表达可W通过RBS调控基因的表达可操作性强，且能较好保存双酶活性，是下一 步优化的基础。
[0057]表1不同构建方式细胞浓度、产酶及转化效果比较 [0化引
[0化9] 实施例3SD序列（Shine-Dalgarno sequence)与ATG间隔的影响
[0060] 按照图6质粒构建方式构建重组质粒(其中RBS*代表不同SD与ATG间隔的序列），设 定间隔分别为3bp、化p、9bp和12bp，上游引物分别为KatG-rbsl(序列如SEQ ID N0.12)、 KatG-rbs2(序列如沈Q ID N0.13)、KatG-rbs3(序列如沈Q ID側.14)和1(日16-计34(序列如 869 10顯.15)，下游引物为1(曰*6-4(序列如569 10顯.16)(表2)，通过传统的构建方式构 建并验证重组菌株，将构建并验证成功的菌株分别命名为。乂0)03少乂0)04、。乂0)05(即心谷 氨酸氧化酶和过氧化氨酶通过SEQ ID ^.5的连接序列进行连接）少乂〇)06。
[0061] 表2本发明所使用的引物 [00621
[0063] 将四株重组菌株于TB培养基中培养OD600至0.6~1.2,添加0.4mmol ? L-ilPTG诱导 5~化，测定此时细胞浓度、LGOX活性及KatG活性，并收集细胞进行蛋白电泳及全细胞转化 生产a-KGal0g?L-lレ谷氨酸，全细胞细胞，pH6.5憐酸盐缓冲液体系，200r?min-l，3(rC 转化2地）。不同重组菌株的细胞浓度OD6〇o、LGOX酶活、KatG活性及全细胞转化a-KG产量列于 表3,可 W看出LG0X酶活。乂0)03光乂0)05光乂0)06光乂0)04，且。乂0)04少乂0)05^乂0)06相差不 大，而KatG活性。乂0)05沖乂0)04沖乂0)06光乂0)03，其中。乂0)03远低于其它^株仅为561]?1111^ -1。其中FXC005菌株的KatG活性最接近实验预测值1250U ? mL-i，a-KG产量最高为86.7g ? L -1，转化率为79.6%。虽然有了较大的提高仍没有满足完全替代过氧化氨酶的目的，需要进 一步优化。
[0064]表3不同间隔共表达菌株细胞浓度、产酶及转化效果比较
[00 化]
[0066] 实施例4核糖体结合位点(RBS序列)强度对产酶的影响
[0067] 在FXC003中（RBS序列，即两酶连接序列，为rbsl)，LG0XWNco I和Hindlll为酶切 位点连接到祀T28a，对应的 AGtot为4.21kcal ? mol-i，TIR为375.4au;KatGWHindin和趾〇1 I插入到pET28a-LG0X，对应的 A Gtnt = 1.85kcal ? mol-i，TIR= 1087.31au;又KatG活性为 5611-1111/1，约为需求量的4.5%(所需1(曰*6活性为12501]-1111/1)，因此所需1?85的1'1尸在 24433.9auW 上为宜。
[006引分别设计4组rbs序列，分别命名为rb巧(序列如SEQ ID N0.17)、rbs6(序列如SEQ 10^.18)、计37(序列如569 10^.19)和&38(序列如沈9 10顯.20)，其序列见表4，其 TIR均在24,000auW上。并分别设计上游引物KatG-rbs5(序列如SEQ ID N0.21)、KatG-rbs6 (序列如56010顯.22)、1(日16-计37(序列如56010^.23)和1(日16-计38(序列如56010 NO.24)，下游引物为KatG-A(表2)，通过传统的构建方式构建并验证重组菌株，将构建出正 确的阳性菌株并分别命名。004、。005(即心谷氨酸氧化酶和过氧化氨酶通过569 10^.6的 连接序列进行连接）、F006(目化-谷氨酸氧化酶和过氧化氨酶通过SEQ ID NO. 7的连接序列 进行连接）、F007。
[0069] 表4不同RBS及其特征
[0070]
[00川将验证成功的共表达菌株于TB培养基中培养06日日至0.6~1.2,添加0.4mmol ? L- ilPTG诱导5~化，收集细胞进行蛋白电泳。结果如图7所示，与对照化.coli化21和FXCOOl) 相比，共表达菌株生产LG0X蛋白大小约为65kDa，KatG蛋白大小约为80kDa，两种蛋白都有表 达。其中F004和F005的KatG条带明显高于LG0X，F006中KatG和LG0X相差不大，F007中LG0X的 条带明显超过KatG。总体KatG的条带亮度。004光005光006光007，符合1'11?预测。
[0072] 参照实施例3对F004、F005、F006和F007进行产酶效果表征，其结果见表5。发现 LG0X酶活。007沖006光004光005，肪16活性。005沖006沖004沖007，且。005及。006的1(日16活 性接近预测值1250U ? mL-i，结合SDS-PAGE图谱发现KatG蛋白表达量与KatG活性不成比例， 且TIF预测有一定的偏差(F006和F007)。将四株菌进行全细胞转化生产a-KG(110g ? [1心谷 氨酸，全细胞细胞，pH 6.5憐酸盐缓冲液体系，200r ? mirTi，30°C转化24h)，发现a-KG产量 尸006沖005光004沖007，1(曰16活性对转化效果较显著，其中。006的转化效果最好，0-雌产量 达到103. Ig ? 1/1，转化率达到94.6%，较好的实现了双酶转化效果。
[0073] 表5重组菌产酶效果
[0074]
[0075] 实施例5共表达菌株F006转化体系优化
[0076] Wl32g ? [1心谷氨酸为底物，在Immol ? [iMn2+条件下，添加不同比例的全细胞催 化剂进行实验，其中W同体积发酵液所获得的细胞作为1倍全细胞催化剂（菌体浓度在 2.5g/L~3.5g/L之间）。分别添加1倍、1.5倍和2倍全细胞催化剂进行转化实验，30°C、 200''111111-1条件下2地转化效果见图8，1.5倍时0-撕产量为121.8旨.[1，转化率为92.9%， 2倍时0-撕产量为127.1肖.[1，此时转化率为96.9%，0-撕产量提高了23.2%。
[0077] 实施例6酶的应用
[0078] 将上述所有共表达菌株发酵液离屯、获得菌体，用于转化k谷氨酸生产a-KG。
[0079] 在底物为110~135肖/1的心谷氨酸，采用抑7.0的憐酸盐缓冲液，添加不同浓度的 Mn2+(lmM~5mM)，30°C转化18~24h测定a-KG的产量。发现FXC005、F005和F006均可W达到转 化率在95 % W上，实现不添加过氧化氨酶条件下的a-KG高效生产。
[0080] 根据上述方法可W判断出成功构建出符合要求的共表达菌株FXC005、F005和 F006，其中最有菌株为F006。
[0081] 虽然本发明已W较佳实施例公开如上，但其并非用W限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该W权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种生产α-酮戊二酸的双酶共表达菌株的构建方法，其特征在于，所述方法在全细 胞转化L-谷氨酸生产α_酮戊二酸转化体系基础上预测所需L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶 的用量，进而通过分子生物学手段从转录和翻译水平调节双酶表达来构建L-谷氨酸氧化酶 和过氧化氢酶的共表达菌株，实现两种酶不同表达量的要求，以达到该转化体系下α-酮戊 二酸高效生产，过程中无需过氧化氢酶的额外添加;所述方法在构建单酶表达菌株测定酶 学性质基础上确定双酶需求量，通过双酶不同构建方式、SD序列与起始密码子ATG之间的间 隔和/或RBS序列强度优化的方法逐步实现两种酶各种所需表达量要求，同时通过转化反应 对共表达菌株性能进行验证。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法通过pET28a质粒分别构建L-谷氨 酸氧化酶和过氧化氢酶高效表达菌株，宿主菌为E. col i BL21 (DE3)，在研究L-谷氨酸氧化 酶和过氧化氢酶的酶学性质的基础上，通过在转化体系中添加纯化后的过氧化氢酶确定共 表达菌株中所需过氧化氢酶的表达量。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸 转化体系及转化条件为：1 l〇g/L L-谷氨酸，2~2.5g/L菌体，pH 6.5磷酸缓冲液体系，30~ 42°C，200rpm条件下转化24h。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的转录水平调控双酶表达是指通 过双酶不同构建方式如单启动子双酶双联表达、双启动子双酶串联表达或者单启动子双酶 融合表达等来构建共表达质粒，表达质粒为pET28a，宿主菌为E. coli BL21 (DE3)。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SD序列与起始密码子ATG之间的间隔 优化是指通过优化SD序列与过氧化氢酶基因起始密码子之间的间隔调控过氧化氢酶的不 同表达量，间隔设定在3bp~12bp，L-谷氨酸氧化酶串联到过氧化氢酶之前，表达质粒为 pET28a，宿主菌为E.coli BL21(DE3)。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RBS序列强度优化是指在权利要求5的 SD序列与起始密码子ATG之间的间隔优化所构建的共表达菌株的基础上，计算RBS强度及翻 译起始速率TIF进而预测过氧化氢酶基因前端所需的RBS强度，从而构建符合要求的RBS序 列，构建双酶串联表达质粒，L-谷氨酸氧化酶串联到过氧化氢酶之前，表达质粒为pET28a， 宿主菌为E.coli BL21(DE3)。7. -种共表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段由 编码L-谷氨酸氧化酶的基因序列、连接序列、编码过氧化氢酶的基因序列依次连接而成;所 述连接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。8. 含有权利要求1所述DNA片段的重组载体或者共表达菌株。9. 权利要求7所述的DNA片段经表达后得到的酶系。10. 权利要求9所述的酶系或者权利要求8所述的共表达菌株在转化生产α-酮戊二酸方 面的应用。
【文档编号】C12P7/50GK106047913SQ201610365301
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】刘立明, 樊祥臣, 刘佳, 林小宝
【申请人】江南大学