专利名称：一株原玻璃蝇节杆菌菌株及将其用于降解棉酚生产饲料蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一株原玻璃蝇节杆菌菌株，尤其涉及一种将其用于棉籽饼粕发酵降解 棉酚生产饲料蛋白的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
我国是世界产棉大国，棉花产量居世界第一位，每年棉籽饼粕产量约40(Γ500万 吨，占各类植物饼粕总产量的30%。棉籽饼粕不仅资源丰富、分布广泛，而且营养价值也很 高，蛋白质含量约为40%，氨基酸组成也较好，但因棉籽仁和棉籽饼粕中含有棉酚等有毒物 质，其用途受到很大限制，多年来我国的棉籽饼粕资源有80%左右都用作肥料还田，用作饲 料蛋白资源的不足30%，造成了蛋白质的极大浪费。特别是近年来随着畜牧业的发展，世界 范围内蛋白质饲料的缺乏日益突出。棉籽饼(粕)是当前形势下理想的替代豆粕的植物蛋 白质源，而且棉籽饼粕价格低廉，现时售价不到大豆饼粕价格的一半，对棉籽饼粕的开发利 用，无疑会给我国畜牧业带来显著的经济效益。棉酚，又叫棉毒素或棉籽醇，化学名为1，1，6，6，7，7-六羟基_5，5-二异丙基-3， 3- 二甲基-(2，2-联二萘)-8，8- 二醛基，分子式为C3tlH3tlO8,分子量518. 5，是棉属植物体内 形成的一种黄色多酚型物质。棉酚在生物体内与酶和蛋白质结合，破坏蛋白质的可消化性， 破坏胃粘膜组织并引起消化功能紊乱，当含量超过安全界限时会导致畜禽生长迟缓、中毒 及死亡。目前常用物理化学的方法对棉籽饼粕进行脱毒处理，游离棉酚的含量经处理后虽 可降低，但处理后产品的营养成分遭到了严重破坏，动物的适口性和采食量也降低了。生物 发酵法是目前最有发展前途的脱毒方法，生产成本低、脱毒效果也好，该方法在利用微生物 发酵降解棉酚的同时，也提高了粗饲料的营养价值。如何更好的处理棉籽饼粕，使棉粕这一 丰富的饲料蛋白资源更好地应用于畜牧业生产成为人们广为关注的技术问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是，提供一株原玻璃蝇节杆菌 菌株以及将其用于棉籽饼粕发酵降解棉酚生产饲料蛋白的方法，以便使棉粕更好地应用于 畜牧业生产。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是，一株原玻璃蝇节杆菌菌株， 其具有序列表1所列RNA序列的16S rRNA基因，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，编号为CGMCC No. 3554。命名为 A. protophormiae KDN0065。上述原玻璃蝇节杆菌菌株CGMCC No. 3554，在MRS培养基上37 °C培养48 72h，菌 落呈圆形，直径2 4mm，浅黄色，边缘整齐，中间微凸，粘稠湿润有光泽。其菌体形态特征为 革兰氏染色阳性，菌体形状有短杆状——球状的循环变化，有鞭毛，无芽孢。生理生化特征 为好气，呼吸代谢，氧化酶阴性，能还原硝酸盐，不抗酸，利用葡萄糖产酸不产气，能利用葡 萄糖、蔗糖、D-果糖、D-半乳糖、棉子糖，利用琼脂，最适生长温度为37°C。
本发明采取的技术方案之二是，将上述的原玻璃蝇节杆菌菌株CGMCCNo. 3554用 于棉籽饼粕发酵降解棉酚。一种原玻璃蝇节杆菌菌株CGMCC No. 3554用于棉籽饼粕发酵降解棉酚生产饲料蛋 白的方法，包括下列内容a、制备发酵菌种，制备过程如下(1)制备一级种子将原玻璃蝇节杆菌菌株CGMCC No. 3554接种至MRS斜面培养 基，37°C培养12h ；(2)制备二级种子从一级种子接种至含0. 08%琼脂的MRS液体培养基，37°C通风 培养24h，装液量50ml/250ml，回旋式摇床200r/min ；b、将二级种子植于添加了一定量葡萄糖和玉米浆的棉籽饼粕培养基中生长，在 37°C条件下发酵72hr，制得发酵脱毒的棉籽饼粕，即为饲料蛋白原料。在该棉籽饼粕中游离 棉酚含量降低60%，同时菌体生长产生大量代谢产物，能提高发酵底料棉籽饼粕的品质，从 而使之成为优质的饲料蛋白原料。上述的原玻璃蝇节杆菌菌株CGMCC No. 3554用于棉籽饼粕发酵降解棉酚生产饲料 蛋白的方法，其b步骤的具体内容如下(1)配制发酵培养基取一定量经细粉碎的棉籽饼粕，在每100份棉籽饼粕中加入 4份的葡萄糖、2份的玉米浆、0. 2份的KH2PO4和60份的水，混勻作为发酵培养基；发酵培养
基无需灭菌；(2)发酵培养在棉籽饼粕发酵培养基中接入10份的二级种子，37°C厌氧发酵 72hr ；(3)发酵结束，培养物在65 °C烘干，粉碎后包装。发明人通过下列途径得到原玻璃蝇节杆菌菌株CGMCC No. 3554。首先从棉粕堆 下土样中的大量菌株中筛选目的菌株在MRS平板中添加醋酸棉酚，共生长出来13个菌 株，增加平板中醋酸棉酚含量，筛选出其中生长良好的9株菌。然后进行培养，将生长良好 的9株菌分别接种到棉籽饼粕培养基中进行固态厌氧发酵，发酵结束检测棉粕中棉酚的含 量。经多次发酵培养，其中编号为KDN0065的菌株降解棉酚效果显著，遗传稳定，经其发 酵后棉籽饼粕中游离棉酚含量降低60%，不超过0. 5g/kg，显著低于国家标准1.2g/ kg)。对编号为KDN0065的目标菌株进行基因序列分析，结果表明该菌株为原玻璃蝇节杆菌 (A. protophormiae)，将其定名为A. protophormiae KDN0065，保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No. 3554。本发明的原玻璃蝇节杆菌菌株CGMCC No. 3554，其发酵培养基不需要灭菌，生产成 本低廉；应用菌株CGMCC No. 3554发酵降解棉籽饼粕中的棉酚生产饲料蛋白，采用固态厌 氧发酵，工艺简单；棉籽饼粕经发酵脱毒，不仅游离棉酚含量降低60%，还提高了棉粕底物 的营养价值。
具体实施例方式实施例1将棉粕堆下土样中的大量菌株接种在添加醋酸棉酚的MRS平板中，共生长出来13 个菌株，增加平板中醋酸棉酚含量，筛选出其中生长良好的9株菌。然后将生长良好的9株菌分别接种到棉籽饼粕培养基中进行固态厌氧发酵，发酵结束检测棉粕中棉酚的含量。经 多次发酵培养，其中编号为KDN0065的菌株降解棉酚效果显著，遗传稳定，经其发酵后棉籽 饼粕中游离棉酚含量降低60%，不超过0. 5g/kg。该菌株保藏编号为CGMCC No. 3554。实施例2菌株CGMCC No. 3554用于棉籽饼粕固态厌氧发酵。(1)将菌株CGMCC No. 3554接种至MRS斜面培养基，37°C培养12h ；(2)然后接种至含0. 08 %琼脂的MRS液体培养基，37 ！通风培养24h，装液量 50ml/250ml,回旋式摇床200r/min制得二级种子；(3)取一定量经细粉碎的棉籽饼粕，在每100份棉籽饼粕中加入4份的葡萄糖、2 份的玉米浆、0. 2份的KH2PO4和60份的水，混勻作为发酵培养基；(4)在棉籽饼粕发酵培养基中接入10份的二级种子，37°C厌氧发酵72hr。(5)发酵结束，培养物在65 °C烘干，粉碎后包装。按照国标GB13086-91“饲料中游离棉酚的测定方法”，发酵结束测得干燥后棉籽饼 粕中残余的游离棉酚小于0. 5g/kg。实施例3本实施例与实施例2的区别在于发酵培养基不同，其余步骤一样。发酵培养基配制取一定量经细粉碎的棉籽饼粕，在每100份棉籽饼粕中加入4份 的糖蜜、2份的玉米浆、和60份的水，混勻作为发酵培养基；发酵培养基无需灭菌。按照国 标GB13086-91 “饲料中游离棉酚的测定方法”测得干燥后棉籽饼粕中残余的游离棉酚小于 0.5g/kg。实施例4本实施例与实施例1的区别在于发酵底物接种原玻璃蝇节杆菌CGMCCNo. 3554的 同时，接种另一株干酪乳酸杆菌进行混菌发酵。干酪乳酸杆菌一级种子制备与菌株CGMCC No. 3554相同，其二级种子接种MRS液体培养基，37°C厌氧培养12hr，装液量170ml/250ml， 两种种子各接5份，其余操作步骤与实施例2相同。按照国标GB13086-91 “饲料中游离棉 酚的测定方法”测得干燥后棉籽饼粕中残余的游离棉酚为0. 5g/kg。序列表<110>青岛康地恩生物科技有限公司<120> 一株原玻璃蝇节杆菌菌株及将其用于降解棉酚生产饲料蛋白的方法<160>1<211>1498<212>16S rRNA<223> 原玻璃蠅节杆菌(A. protophormiae)<400>1TACGGCTACC TTGTTACGAC TTAGTCCCAA TCGCCAGTCC CACCTTCGAC 50GACTCCCCCC ACACAAGGTG GTTAGGCCAT CGGCTTCGGG TGTTACCAAC 100TTTCGTGACT TGACGGGCGG TGTGTACAAG GCCCGGGAAC GTATTCACCG 150CAGCGTTGCT GATCTGCGAT TACTAGCGAC TCCGACTTCA TGGGGTCGAG 200
TTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTAGGGATTAGCTCCACC250
TCACAGTATCGCAACCCATTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCC300
AAGACATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGT350
TGACCCCGGCAGTCTCCCATGAGTCCCCGGCATAACCCGCTGGCAACATG400
GAACGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACG450
AGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTGAACCAGCCCCAAAAGGGGAAAG500
ACCATCTCTGGCCCGGTCTGGAACATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCG550
CGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTC600
AATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCACTT650
AATGCGTTAGCTACGGCGCGGAAAACGTGGAATGTCCCCCACACCTAGTG700
CCCAACGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCC750
CATGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAAATGCCCAGAGACCTGCCTTCGCC800
ATCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTC850
CAGTCTCCCCTACATCACTCTAGTCTGCCCGTACCCACCGCAGATCCGAG900
GTTGAGCCTCGGACTTTCACGGCAGACGCGACAAACCGCCTACGAGCTCT950
TTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGC1000
TGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAAGTACCGTCACCCCAA1050
AAAGGGGCTTCTTCCCTACTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCAT1100
CCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCC1150
CCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGG1200
CCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCCATTA1250
CCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGAGTCCATCCCCAACCGATAAATCT1300
TTCCACCCCCTGCCATGCAGCAGGAAGTCATATCCGGTATTAGACCCAGT1350
TTCCCGGGCTTATCCCGAAGTCAGGGGCAGGTTACTCACGTGTTACTCAC1400
CCGTTCGCCACTAATCCACCAGTGCAAGCACCAGCATCATCGTTCGACTT1450
GCATGTGTTAAGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCCAGGATCAAAC1498
权利要求
一株原玻璃蝇节杆菌菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.3554；其具有ID NO1所示的16S rRNA基因。
2.将权利要求1所述的原玻璃蝇节杆菌菌株用于棉籽饼粕发酵降解棉酚。
3.一种将权利要求1所述的原玻璃蝇节杆菌菌株用于棉籽饼粕发酵降解棉酚生产饲 料蛋白的方法，包括下列内容a、制备种子，种子制备过程如下(1)制备一级种子将原玻璃蝇节杆菌菌株CGMCCNo. 3554接种至MRS斜面培养基， 37°C 培养 12h ；(2)制备二级种子从一级种子接种至含0.08%琼脂的MRS液体培养基，37°C通风培养 24h，装液量50ml/250ml，回旋式摇床200r/min ；b、将二级种子接种到添加葡萄糖和玉米浆的棉籽饼粕培养基中生长，在37°C条件下发 酵72hr，制得发酵脱毒的棉籽饼粕饲料蛋白。
4.根据权利要求4所述的原玻璃蝇节杆菌菌株用于棉籽饼粕发酵降解棉酚生产饲料 蛋白的方法，其b步骤的具体内容如下(1)配制发酵培养基取一定量经细粉碎的棉籽饼粕，在每100份棉籽饼粕中加入4份 的葡萄糖、2份的玉米浆、0. 2份的KH2PO4和60份的水，混勻作为发酵培养基；发酵培养基无 需灭菌；(2)发酵培养在棉籽饼粕发酵培养基中接入10份的二级种子，37°C厌氧发酵72hr；(3)发酵结束，培养物在65°C烘干，粉碎后包装。
全文摘要
一株原玻璃蝇节杆菌菌株，保藏编号为CGMCC No.3554，其具有ID No1所示的16S rRNA基因。一种将该原玻璃蝇节杆菌菌株用于棉籽饼粕发酵降解棉酚生产饲料蛋白的方法，包括a、制备种子，b、将种子接种到添加葡萄糖和玉米浆的棉籽饼粕培养基中生长，在37℃条件下发酵72h，制得发酵脱毒的棉籽饼粕饲料蛋白。该原玻璃蝇节杆菌菌株的发酵培养基生产成本低廉；应用该菌株发酵降解棉籽饼粕中的棉酚生产饲料蛋白的工艺简单；棉籽饼粕发酵脱毒后，游离棉酚含量降低60％，棉粕底物的营养价值提高。
文档编号C12N1/20GK101892172SQ20091021720
公开日2010年11月24日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者于俊尧, 周生飞, 柳红艳, 蔡冬梅, 马立周 申请人:青岛康地恩生物科技有限公司