专利名称：人胰岛素原c肽高产菌株的构建的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域中的重组多肽药物的生产方法。
背景技术：
人胰岛素原C肽是人胰岛素原中A链和B链之间的连接肽，含31个M 酸，人胰岛素原经酶解形成等摩尔的胰岛素和C肽。胰岛素用于控制糖尿病 患者的血糖，C肽曾^皮认为无临床价值，最新研究证明C肽能够减少糖尿病 患者的最严重并发症，如糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变和糖尿病性神 经病变。采用胰岛素与C肽联合用药可有效控制血糖和减少糖尿病并发症的 发生。由于人胰岛素原C肽具有巨大的治疗价值和经济价值，现在各国大力 开展其生产工艺和临床前研究，目前全世界还没有正式生产上市。
人胰島素原C肽是一种含31个氨基酸的内源性小肽，生产人胰岛素原C 肽主要有三条工艺路线可供选择化学合成法、生物组织提取法、基因工程 法。人胰岛素原C肽含31个氨基酸，用化学合成法生产人胰岛素原C肽存在 合成反应步骤多，总收率低，并有价格高昂以及环境污染的弊端，因而化学 合成法不可取。虽然人的血液中含有人胰岛素原C肽，但含量极微，从人的 血液提取C肽不可能用于大规^莫生产。
对于人胰岛素原C肽的生产来说，最有效和最直接的解决方法就是利用 基因工程的方法，通过构建表iiA胰岛素原C肽的基因工程菌株，釆用微生 物发酵法生产。但由于人胰岛素原C肽是一种小肽，利用基因工程来生产小 肽一直是一个难题，最主要体现在(1)在发酵表达方面，分子量小造成表 达量低(与相同摩尔数的大的蛋白质相比)，另外，分子量小还容易被宿主 细胞降解，从而造成多肽表达量进一步降低；(2)在分离纯化方面，多tt 于分离纯化，收率远低于分子量大的蛋白质；(3)在电泳检测方面，小肽的 分子量小容易扩散，用常规的蛋白质电泳不利于检测分析。在这三个难题中， 小肽的分析检测可以采用色谱和多肽电泳来弥补；小肽的分离纯化工艺可以
通过不同的纯化方法的优化，其收率一般可控制在30-40%;而难度最大的是 如何获得高表达人胰岛素原C肽的工程菌林。
目前，国内外提高C肽表达量的主要方式是将人胰岛素原C肽基因进行 串联表达。其基本原理由于人胰岛素原C肽不含精氨酸和赖氨酸，先可用 这两种碱性M酸将单拷贝的人胰岛素原C肽基因串l沐来表达，然后通过 高纯度的胰蛋白酶和羧肽酶B进行双酶切，去除C肽之间的连接氨基酸，释 放出天然的人胰岛素原C肽。该方法的优点是可以在大肠杆菌或酵母中获得 多聚(个)人胰岛素原C肽串联的融合蛋白的高表达工程菌抹，缺点是需要 昂贵的双蛋白酶(胰蛋白酶和羧肽酶B)切割，同时增加了分离纯化的步骤 以及受双蛋白酶切效率的影响，最终降低了人胰岛素原C肽的产率。该方法 已经分别由瑞典创新肽有限公司(中国专利申请公开CN1268141 )和上海新 药研究开发中心(中国专利申请公开CN1606570 )各自申请了专利。
发明内容
本发明目的之一是提供一种胞内高表达人胰岛素原C肽的方法。
本发明的另一目的是提供有关的人工合成的核酸分子、载体和宿主细胞。
本发明采用基因工程的方法，以毕赤酵母为宿主细胞，构建能高效胞内 表达人胰岛素原c肽的工程菌林。
该工程菌主要由三个部分构成毕赤酵母宿主细胞GS115,毕赤酵母胞 内表达型栽体pPIC3K， 一种能够编码人胰岛素原C肽的核酸分子。酵母宿主 细胞GS115以及毕赤酵母表达载体pPIC3K均购自美国Introgen Corporation (Carlsbad, CA， USA)，能够编码人胰岛素原C肽的核酸分子是人工设计并 用化学法合成。
该工程菌的主要特点如下
(1) .宿主细胞选用的毕赤酵母宿主细胞是GS115， GS115可高密度 发酵，因而适合于外源蛋白表达。
(2) 表达载体选用的酵母表达载体是pPIC3K,可有效地胞内表iiA 胰岛素原C肽。
(3).人胰岛素原C肽的核酸序列根据人胰岛素原C肽的氨基酸序列， 人工设计并化学合成一种能编码人胰岛素原C肽的核酸分子，其序列见SEQ ID NO: 1。
本发明研究人员按照本发明工程菌构建方法已经获得高效胞内表达人胰 岛素原C肽的工程菌林，并将其2008年10月6日保藏到中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号是No.2686,分类命名为巴氏 毕赤酵母(Pichia pastoris)。
本发明的实验技术路线 (1)目的基因的合成
根据人胰岛素原C肽的氨基酸序列，采用化学合成的方法，合成人胰岛 素原C肽基因。人胰岛素原C肽含有31个氨基酸，用化学合成法合成人胰岛 素原C肽全长基因序列，并在目的基因的两端引入限制性酶切位点。
(2 )获得正确构建的重组表达载体
在DM连接酶作用下，将化学合成的人胰岛素原C肽基因与表达载体 pPIC3K进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5oc感受态细胞，最后将该感 受态细胞涂布于含氨千青霉素的LB平板上，获得大量单菌落。用PCR方法初 步筛选阳性克隆，将阳性克隆进行DM测序，从而获得含人胰岛素原C肽基 因的重组表达载体。
(3 )将上述重组载体导入酵母菌
提取该重组栽体并进行线性化处理，用电穿孔将该线性化的重组载体导 入毕赤酵母中，将菌液涂布于MD选择性培养基上，获得了大量的转化子，并 对转化子进行PCR鉴定。
(4)高产菌抹的获得
将上述(3)获得的转化子涂布在含不同浓度的G418平板上进行筛选。 利用蛋白质电泳检测人胰岛素原C肽的表达量，经过大规模筛选，已经获得 了高表达人胰岛素原C肽的工程菌抹。同时确定了摇瓶试验的培养和诱导表 达条件，包括可能的最优的培养基、培养温度、无机盐的种类和浓度、诱导 表达时间等。在摇瓶培养条件下，重组人胰岛素原C肽的表达水平达到 100mg/L。
(2 )建立了高密度和高表达的小试发酵工艺。在摇瓶的培养和诱导表达 条件基础上，将酵母工程菌在5L Minifors(瑞士 INFORS公司)全自动发酵罐 进行培养，对发酵过程中的溶氧量、pH值、温度、搅拌转速等参数进行测定 和控制，优化和量化了 pH值、溶氧量、搅拌速度等参数，酵母工程菌获得高 密度发酵，人胰岛素原C肽获得稳定高效表达。
本发明采用基因工程的方法来生产人胰島素原C肽，可以大规4莫生产， 成本低廉。
图1是含人胰岛素原C肽基因工程菌的PCR产物的核酸电泳图，从左到右 电泳泳道-M:是核酸分子量标准Lamda DNA/HindlH; 电泳泳道-工程菌含人胰岛素原C肽的工程菌林做冲莫板，出现人胰岛 素原C肽的重组载体的PCR产物以及宿主菌体染色体的特异产物。
图2是含人胰岛素原C肽基因工程菌的SDS-PAGE电泳图，从左到右 电泳泳道1:工程菌破碎样品，在3KDa附近有人胰岛素原C肽条带； 电泳泳道M : 蛋白质分子量标准，从上往下，分别是
2. 5KDa， 6. 5KDa， 10KDa， 16KDa。
具体实施例方式
本发明设计的实验操作和相关试剂的配方主要参考毕赤酵母操作手册 (the/7c力/a expression Kit Instruction Manual , Introgen Corporation, Carlsbad, CA， USA)，分子克隆实验指南(第三版，黄培堂翻译，科学出版 社)，以及试剂厂家的说明书。
本发明主要涉及的培养基成分如下(除另有说明外均为质量分数)
LB培养基蛋白胨1%，酵母提取物0.5 %,氯化钠O. 5 °/。；
种子培养基(YPD):蛋白胨2 %，酵母提取物l %，葡萄糖2 %;固体培养 基中加入l. 5%的琼脂粉。
生长培养基(BMGY):酵母氮源威基l. 34 %，生物素(4 x10 - 5) %，蛋 白胨2 %,酵母提取物l %， 0.1 mo1/ L磷酸盐緩沖液pH 6.0, 1%甘油；
诱导培养基(B固Y):酵母氮源碱基l. 34 %，生物素(4 x 10 -%，蛋 白胨2 %,酵母提取物l %， 0.1 mo1/ L磷酸盐緩冲液pH 6.0， 1 % (v/v)曱 醇；
实例1含人胰岛素原C肽的重组表达载体的构建过程
人胰岛素原C肽基因的化学合成根据人胰岛素原C肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)，合成两个互补的核普酸序列。
正向的核苷酸序列含有下列序列(5 ' —3 ' ): gaggccgaagattta cag gta ggacaagttgagttgggaggaggcccaggggcaggctcgctacagcccttggccttggaaggc tcactgcag.，
反向的核苷酸序列含有下列序列(5 ' — 3 '):
ctgcagtgagccttccaaggccaagggctgtagcgagcctgcccctgggcctcctccc aaxtcaacttgtcctacctgtaaatcttcggcctCo 正向和反向的核苷酸序列的5 '端均设计了限制性内切酶EcoR I。 两个互补的核苷酸序列通过退火即得到人胰岛素原C肽基因。将上述核酸 产物和表达栽体pPIC3K分别用EcoR I酶切后，用DNA连接酶进行连接，并转化 大肠杆菌DH5oc，在含氨千青霧素的LB培养基中培养，筛选转化子，最后通过 测序鉴定获得含人胰岛素原C肽基因的正确连接的重组表达载体。
提取上述重组表达载体，用Sal I酶切后，酶切产物转化酵母受体菌 GS115，涂布于MD平板上。培养48小时后，将一定的转化子细胞涂布于 YPD-G418平板上，G418浓度梯度是0. 25mg/mL， 0. 50mg/mL, 0. 75mg/ mL, 1. Omg/ mL， 1.5mg/mL， 2. 0mg/ mL， 4. 0mg/mL，在30° C培养,2-5天后长 出G418抗性菌落。将此抗性菌落用PCR方法进行DM鉴定，引物用pPIC3K 的通用测序引物A0X1，结果如图l所示。
结果表明人胰岛素原C肽^皮转化到酵母受体菌GS115中。
实例2摇瓶表达人胰岛素原C肽情况
从固体平板上挑选一个单菌落，接种到装有25 mL BMGY的250 mL摇并瓦中， 30。 C, 220 rpm，过夜培养至0D咖-4。
将上述25mL培养液接种到lL BMGY中，继续扩增至菌体浓度006。。=6。
5000 rpm，室温离心5min，收获菌体。用新鲜的无菌B固Y悬浮菌体，至 菌液OD柳-l. 0， 30° C， 220 rpm诱导表达人胰烏素原C肽。每隔24h取样，并 补充100%曱醇至终浓度1.5%。诱导培养120h结束，离心收获菌体。将菌体通 过蛋白质电泳分析，结果如图2所示，结果表明人胰岛素原C肽在毕赤酵母 中获得表达。
摇瓶培养，分析人胰岛素原C肽表达情况。通过大量篩选转化子，获得 高表达人胰岛素原C肽的工程菌抹。本发明获得的人胰岛素原C肽工程菌林 的摇瓶表达量可达200mg/L以上。
实例3发酵表达人胰岛素原C肽情况
从固体平板上挑选一个单菌落，接种到装有25 mL BMGY的250 mL摇瓶中， 30° C， 220 rpm，过夜培养至0D柳-4。
将上述25mL培养液接种到250mL BMGY中，继续扩增至菌体浓度006。。=6， 将培养液接种到2L BSM发酵培养基中，调整pH-4. 0-7. 5，温度在28° C， DO=40%，转速500rpm，培养一段时间后，DO迅速升到100y。以上，表明培养基 中甘油消耗完毕，开始緩慢加入50°/。甘油，甘油流加速度30 mL/h，并维持DO 在35°/。以上，甘油补充时间4 h。
甲醇诱导阶段停止补充甘油后，DO迅速升到100%以上，饥饿一段时间 后，开始緩慢补充曱醇，曱醇流加速度3-7 mL/h，随着DO值上升，可将甲 醇流加速度加快。如果DO值低于35%,停止加入曱醇，待DO值持续升到35%, 才补充甲醇。每隔4 h，取菌体进行检测人胰岛素原C肽的含量，发酵持续 96 h，收获发酵菌体。在整个发酵过程中，DO值应控制在20%-40%。酵母湿 菌体达到300g/L以上，C肽的含量达到1000mg/L以上。SEQUENCE LISTING
< 110〉 西藏射果科技有限公司 北京航空航天大学
西藏自治区特色农牧业工程技术研究开发中心
<120>人胰岛素原C肽高产菌林的构建 <130>没有案巻参考号
<160> 2
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 93
<212> DM
<213> Artificial
<220>
<223> 编码人胰岛素原C肽 <220>
<221> CDS <222> (l)..(")
<400> 1
gag gcc gaa gat tta cag gta gga caa gtt gag ttg gga gga ggc cca 48 Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 15 10 15
ggg gca ggc teg cU cag ccc Ug gcc Ug gaa ggc tea ctg cag 93 Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin 20 25 30
<210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct <400> 2
Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 15 10 15
Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin 20 25 30
权利要求
1. 一种能够表达人胰岛素原C肽的核酸分子，其序列为SEQ ID NO:1。
2. —种能胞内表达人胰岛素原C肽的重组载体，其特征为选用的表达 载体是毕赤酵母胞内表达载体pPIC3K, pPIC3K与权利要求1所述的人胰岛素 原C肽的核酸分子形成重组栽体。
3. —种能高效胞内表达人胰岛素原C肽的毕赤酵母菌林，其含有权利要 求2所述的重组栽体。
4. 如权利要求3所述的毕赤酵母菌林，其特征在于选用的毕赤酵母宿主 细胞是GS115。
5. —种能够高效胞内表达人胰岛素原C肽的毕赤酵母菌林，其保藏编号 为CGMCC No.2686。
6. —种胞内表达人胰岛素原C肽的方法，其特征在于采用权利要求3-5 中任一毕赤酵母菌林胞内表达获得。
全文摘要
本发明公开了一种用毕赤酵母表达人胰岛素原C肽的方法，该方法首先合成人胰岛素原C肽基因，然后将该基因与毕赤酵母表达载体进行重组，获得的重组表达载体转入到毕赤酵母中，最后通过大量筛选转化子并获得高效胞内表达人胰岛素原C肽的工程菌株。
文档编号C12R1/84GK101381727SQ200810167200
公开日2009年3月11日 申请日期2008年10月8日 优先权日2008年10月8日
发明者王福清, 王秀云, 权 郑 申请人:西藏金稞科技有限公司;北京航空航天大学;西藏自治区特色农牧业工程技术研究开发中心