专利名称：C肽微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明公开了一种c肽微孔板式磁
颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
人C肽是由31个氨基酸组成的直链，分子量3020。 C肽是在胰岛素原形成胰 岛素过程中释放的一段连接肽。C肽与胰岛素以等分子量从B细胞分泌到血液中。 C肽无生物活性(也有少数学者认为C肽具有生物活性)，也不与细胞膜上的受体 结合且不被降解，其半衰期为胰岛素的3-5倍。对使用胰岛素治疗的糖尿病患者 测定C肽是较为理想的判断指标。
C肽不受肝脏酶灭活，仅受肾脏作用而排泄，在外周血中半衰期长，C肽与 胰岛素无交叉反应，C肽的检测不受胰岛素抗体的干扰，也不受外源胰岛素注射的 影响，能更准确地反映人胰岛P细胞的分泌功能。2003年美国糖尿病协会资助的专 家委员会的报告建议将C肽和胰岛素抗体、谷氨酸脱羧酶抗体(GADAb)等自身抗 体作为糖尿病分型的重要指标。
目前用于检测C肽的免疫分析方法主要有放射免疫分析、酶联免疫分析、时 间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析等。根据大量的试验结果及临床应用资 料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，优先顺序依次为化学发光免 疫分析、时间分辨荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。
放射免疫分析技术因其使用放射性元素作为标记物，因此对环境有放射性污 染，并存在灵敏度不高，搡作复杂，试剂保存时间短等缺点；酶免疫分析法存在 灵敏度低，信噪比不高，线性范围窄等方法学制约因素；时间分辨荧光免疫分析 对检测环境的要求较高，易受空气尘埃的干扰；化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法，可使检测灵敏度达到10—18摩尔水平，而且检测范围可达6个数 量级，其酶标记物稳定，可长期使用。化学发光免疫分析技术因其高灵敏、高特 异、快速、高通量等特点得到越来越广泛的应用，目前化学发光主要有酶促底物 化学发光和标记物直接发光两大系列，酶促化学发光所使用示踪物一般为辣根过 氧化物酶和碱性磷酸酶。而标记物直接发光分为通过改变溶液酸碱度而发光的 发光物质为吖啶酯；通过电极作用的电化学发光的发光物质是三联吡啶钌。
目前微孔板式免疫分析主要有酶联免疫分析和化学发光免疫分析，而微孔板 式化学发光一般将微孔板作为固相载体，通过抗体的物理吸附作用包被在微孔板 上如专利(中国，申请号200610107393. 1 ),也有通过将亲和素或链亲和素包被在 微孔板上，然后通过将生物素标记在抗体上，以亲和素-生物素较强的结合能力为 桥联，间接地将抗体固定到微孔板的方法。
目前磁颗粒在化学发光的应用上主要釆用单个反应杯或反应槽的形式。 本发明采用微孔板式磁颗粒整合了目前两种技术，主要体现在(l)在微孔 板上使用磁颗粒，利用磁颗粒在相同体积的情况下表面积最大的原理，较目前微 孔板式化学发光固相物理吸附或用亲和素-生物素桥联方法包被抗体方式会结合 更多的抗体，这样就会使反应的灵敏度更高，线性范围更宽。(2)较目前磁颗粒 在化学发光的应用上采用单个反应杯或反应槽的形式相比，微孔板的反应模式因 为几十或几百个反应微孔在同一块微孔板上，可以进行同时批量测量，适合大批 量血清筛査(如96孔微孔板， 一次就可以实现96个样本的测试)。
发明内容
本发明的目的是提供一种C肽微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒。
根据本发明C肽微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒，其中，所述 试剂盒包括
51) C肽校准品；
2) C肽单克隆抗体包被的磁颗粒；
3) 辣根过氧化物酶(服P)标记的另一株单克隆抗体或多克隆抗体；
4 )微孔板；
5 )洗涤液；
6)上述酶所作用的化学发光底物液。
根据本发明的试剂盒，其中，所述反应微孔板为48孔、96孔、256孔不透明 微孔板。
根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物液包含A液和B液
A液是0. 2M pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，包含4. Og/L的鲁米诺和0. 2g/L 的乙二醇乙二醚二胺四乙酸(EGTA)、 2.5%丙三醇、0. 05g/L对乙酰氨基酚；
B液是0. 2M pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，包含6%过氧化氢、9g/L氯化钠的溶液。
化学发光底物液包含A液和B液使用方法A、 B液双组分试剂，在使用前根 据使用量计算完毕后A: B为l: 1混合，应保证在6h内使用。
本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的制备方法。
根据本发明C肽微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒的制备方法， 具体地，制备方法包括配制校准品；制备C肽抗体包被磁颗粒；以辣根过氧化 物酶标记C肽抗体；配制洗涤液；配制化学发光底物液。
根据本发明所述配制校准品，其中校准品基质的配方为三羟甲基氨基甲烷(Tris) 6. 06g
牛血清白蛋白(BSA) 1.5g
0. lmol/L盐酸(HCL) 3. 45ml
Proclin300 lml
甘蓝红 0. lml
双蒸水定容 1Q00ml
配制校准品基质液后，用此基质液将C肽抗原纯品稀释成系列浓度校准品， 每个浓度点，每瓶装l ml,冻干保存。其中，所述校准品的C肽抗原原料纯度应 不低于90%。
根据本发明试剂盒制备方法中C肽抗体包被磁颗粒的稀释液配方为
磷酸二氢钠(NaH2P04*2H20) 2.19 g
磷酸氢二钠(Na2HP04'12H20) 12.9 g
牛血清白蛋白(BSA) 10g
明胶 15g
乙二醇 50ml
去离子水定容 1000ml
配制完成后，应混匀，放置30分钟后用肉眼观察无晶体或沉淀析出，应采用 电子PH计或中性pH试纸进行检验pH应控制在7. 0-7. 5之间，最佳pH为7. 2。然 后分装到适当体积的聚乙烯塑料瓶中。根据本发明的制备方法，其中，所述制备C肽抗体包被磁颗粒，是将磁颗粒 通过偶联羧基和/或氨基中的至少一种活性基团后，与c肽抗体中的赖氨酸残基中 裸露氨基反应共价结合的过程，反应结東后用去离子水冲洗3次，2仰SA封闭，离 心去上清液后，用上述磁颗粒稀释液适当体积溶解，备用。
根据本发明提到的磁颗粒如果活化的为羧基基团，则与C肽抗体中的赖氨酸 残基中裸露氨基反应以共价键结合的过程；
根据本发明提到的磁颗粒如果活化的为氨基基团则通过偶联剂戊二醛、1-乙 基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺三种中的至少一种氨基 基团偶联剂与C肽抗体中的赖氨酸残基中棵露氨基反应以共价键结合的过程。
包被磁颗粒的C肽单克隆抗体应为鼠源或兔源的。
包被磁颗粒的C肽单克隆抗体在使用前应摇匀。
根据本发明提到的以辣根过氧化物酶标记C肽抗体采用过碘酸钠法进行标记。 其制备步骤为称5mgHRP溶于lml双蒸水中，加入0. 2ml新配的0. lMNal(V溶液, 室温避光20min。 lmM pH4. 4醋酸钠缓冲液透析，4'C过夜。加入20ul0.2M pH9. 6 碳酸盐缓冲液，加入lml 0. OIM碳酸盐缓冲液含5mg抗体，室温2h。再加0. lml 新配4g/L NaBH4,混匀，4'C2h。 0. 15M pH7. 4 PBS透析4'C过夜。搅拌下逐滴加 入等体积饱和硫酸铵，4'Clh。 3000rpm离心0. 5h,弃上清。沉淀物溶于lm10. 15M pH7. 4PBS。 0. 15M pH7. 4的PBS透析4'C4h, 10， OOOrpm离心30min,上清液即为 酶结合物，加入等量丙三醇，-2(TC保存。
辣根过氧化物酶标记C肽单克隆抗体或多克隆抗体应为鼠源、兔源或羊源的。
根据本发明试剂盒制备方法中洗涤液的配方为
磷酸二氣钠(NaH2P04*2H20) 1 g
8磷酸氢二钠(Na2HP04*12H20 ) 1.28 g
氯化钠(NaCL) 9g
Tween20 0. lml
去离子水定容 1000ml
根据本发明的试剂盒，其中免疫反应结束后，磁颗粒以及反应复合物是通 过在微孔板的底部安装有磁铁和/或电磁场的至少一种磁场，磁颗粒以及反应复合 物被吸附到微孔板底部后，再洗涤。
综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了 筛选实验和质量检定，包括包被抗体的活性、磁颗粒的吸附性能和变异大小、HRP 的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。对于HRP的标记可以有不 同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可 靠的标记方法。
本发明公开了基于上述摸索试验得到的各种试剂配方，包括化学发光底物 液配方、校准品的基质配方、洗涤液的配方、C肽抗体包被磁颗粒的稀释液配方。 进一步，公开了辣根过氧化物酶标记C肽抗体的制备过程和C肽抗体包被磁颗粒 的制备过程。
利用本发明方法进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单， 无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测及筛查实 验室。
图l为实施例7试剂盒中的校准品线性图(双对数标准曲线)。图2为实施例9本发明的试剂盒同国外试剂盒(M0N0BIND公司CLIA试剂盒) 临床血样测值比对的相关曲线。
具体实施例方式
实施例1 C肽微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒发光底物液的制
备
按照化学发光底物液A液配方
磷酸二氢钠(NaH2P04'2H20) 2. 19 g
磷酸氢二钠(Na2HP04*12H20) 12. 9 g
鲁米诺(luminol ) 4g
乙二醇乙二醚二胺四乙酸(EGTA) 0.2g
丙三醇 25ml
对乙酰氨基酚 0. 05g
双蒸水定容 1000ml
配制完成后用聚乙烯塑料瓶，每瓶分装10ml。 按照化学发光底物液B液配方
磷酸二氢钠(NaH2P04*2H20) 2. 19 g
磷酸氢二钠(Na2HP04'12H20) 12.9 g
30%过氧化氢(H202 ) 200ml
氯化钠(NaCL) 9g
10双蒸水定容 1000ml 配制完成后用聚乙烯塑料瓶，每瓶分装10ml。 实施例2 C肽校准品的制备 根据本发明校准品的基质液配方
三羟甲基氨基甲烷(Tris) 6. 06g
牛血清白蛋白(BSA) 1. 5g
0, 1mol/L盐酸(HCL) 3. 45ml
Proclin300 lml
甘蓝红 0. lml
双蒸水 1000ml
配制校准品基质液，用此基质液将C肽抗原纯品(〉90%)稀释成校准品，浓 度分别为0. 2ng/ml、 0. 6ng/ml、 2ng/ml、 6ng/ml、 15ng/ml,另加基质液Ong/ml， 共6瓶，每瓶装l ml,冻干保存。
实施例3 C肽抗体磁颗粒的制备
根据本发明试剂盒制备方法中C肽抗体包被磁颗粒的稀释液配方进行配制
磷酸二氢钠(NaH2P04'2H20) 2. 19 g
磷酸氢二钠(Na2HP04*12H20) 12. 9 g
牛血清白蛋白(BSA) 10g
明胶 15g乙二醇 50ml 去离子水定容 1000ml
配制完成后，应混匀，放置30分钟后用肉眼观察无晶体或沉淀析出，应采用 电子PH计或中性pH试纸进行检验pH应控制在7. 0-7. 5之间，最佳pH为7. 2。然 后分装到适当体积的聚乙烯塑料瓶中。
当粒径为1~2 ia m磁颗粒表面附有氨基基团时，将此磁颗粒在碱性条件下用 1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺进行活化，室温搅拌，混匀3小时后， 加磁场，静置20 25min,倒出上清，用pH值为7. 4的0. Olmol/L磷酸盐缓冲液将 磁颗粒进行悬浮，浓度为50~100g/L;每毫升悬浮液中加入C肽单克隆抗体20 50 Hg,在4'C下搅拌过夜后，反应结東后加电磁场，用去离子水冲洗3次，2%BSA 封闭，离心去上清液后，用磁颗粒稀释液适当体积溶解，备用。
实施例4 C肽试剂盒中洗涤液的制备
根据本发明试剂盒制备方法中洗涤液的配方进行配制
磷酸二氢钠(NaH2P04'2H20) 1 g
磷酸氢二钠(Na2HP04*12H20 ) 1.28 g
氯化钠(NaCL) 9g
Tween20 0. lml
去离子水定容 1000ml
配制完成后，应混匀，放置30分钟后用肉J艮观察无晶体或沉淀析出，应采用 电子pH计或中性pH试纸进行检验pH应控制在7. 0-7. 5之间，最佳pH为7. 2。然 后分装洗涤液到适当规格的聚乙烯塑料瓶中。实施例5 C肽抗体磁颗粒和辣根过氧化物酶标记的C肽抗体的浓度选定标准
釆用方阵法将c肽抗体磁颗粒和辣根过氧化物酶标记抗体以不同稀释度进行 配比，以最高信噪比大于1200,最低信噪比大于5为基准，优化选择成本最低的 配比关系。
采用，将C肽抗体磁颗粒以1/1000、 1/2000、 1/4000、 1/8000、 1/16000、 1/32000、 1/64000、 1/128000的不同稀释度，与辣根过氧化物酶标记抗体1/1000、 1/2000、 1/4000、 1/8000、 1/16000、 1/32000、 1/64000、 1/128000的不同稀释度进行方阵 法，两组比例交叉配比，发现满足最高信噪比大于1200,最低信噪比大于5的组 合中，将C肽抗体磁颗粒以1/16000和辣根过氧化物酶标记抗体1/64000的配比 比例所用成本最低。故选择这个合适的配比比例。
实施例6 C肽微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒半成品及成品组
成
上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度 及稳定性检定合格才能组装成C肽微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒， 组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。
实施例7本发明的试剂盒的使用方法
一、 样品前处理
取人的空腹及口服75g葡萄糖lh、 2h、 3h晨血清样品,3000rpm离心15min, 取上层液50ul进行分析。
二、 检测方法
使用本试剂盒进行实验前，需先取出辣根过氧化物酶标记的C肽抗体、校准 品/待测样品、C肽抗体磁颗粒、发光底物液和洗涤液，在室温放置15~30分钟， 使它们平衡到室温；之后，将恒温温箱或者水洛锅调至37°C;准备好合适的微量 加样器及对应吸头并且检査化学发光仪是否正常工作。使用本试剂盒实验的具体搡作步骤如下
首先，根据试验需求设计好分布图，然后向微孔中加入50yl血清样品或系 列校准品溶液，校准品每孔加Ong/ml、 0.2ng/tnl、 0.6ng/ml、 2ng/ral、 6ng/ral、 15ng/ml各50m 1,再加入C肽抗体包被的磁颗粒溶液100 )a 1,加入辣根过氧化物 酶标记C肽抗体50iu1, 37。C振荡反应30min。之后，将微孔板置于带有磁分离器 的微孔板洗板机上洗涤5次。将化学发光底物液A、 b等体积混合摇勻后，每孔加 入化学发光底物200]ul，充分混匀，暗处放置5min，而后在化学发光测量仪上依 序测量各孔的发光强度(RLU)。以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Log值为 纵坐标绘出标准曲线(双对数曲线)，以各待测血清RUJ值在标准曲线上查出该血 清的C肽的浓度，见附图l，其中，纵坐标为发光强度，横坐标为C肽浓度(单位 为ng/ml )，相关系数r = 0. 9992， Log (Y) =0. 5834Log (X) +5. 1424
实施例8本发明的试剂盒的方法学检定
按照本领域中常规的制造及检定规程对通过实施例1~6中制备成的试剂盒进 行检定，结果如下
1) 准确性
试剂盒校准品与国家标准品同时测定，两条剂量-反应曲线不显著偏离平行。 以国家标准品为对照品，试剂盒校准品的实测值与标示值之比应在0.90-1.10的 范围内。
2) 剂量-反应曲线的线性
用双对数数学模型拟合，在0.2 ng/m卜15 ng/ml浓度范围内，剂量-反应曲 线相关系数(r)的绝对值应不低于0.9900
3) 精密性
CV(%)应小于15. 0%(n = 10)
4) 最低检出量
14应不高于0. 1 ng/ml5) 质控血清测定值 各质控测值应在质控范围内。6) 特异性与胰岛素原交叉反应率应小于2. 5% 与胰岛素的交叉反应率应小于0. 1%7) 稳定性将试剂盒37'C放置7天，测定结果应符合上述1)- 5)项要求。 实施例9本发明的试剂盒同国外试剂盒临床血样测值比对用本发明的试剂盒和M0N0BIND公司的试剂盒对50份正常人(经过传染病四 项HBsAg、 HIV、 HCV、 TP、肝功能、血常规、尿常规、血糖检测正常)血清样品同 时进行检测。其检测结果见附图2，以本发明方法测定的血样C肽浓度结果为纵坐 标，以MONOBIND测定的浓度结果为横坐标作回归分析，相关方程为Y = 1. 1657 X-0.0236,相关系数r = 0.9692。经统计学处理结果表明，本发明方法同国外试 剂盒临床血样测值相关性良好。
权利要求
1、C肽微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)C肽校准品；2)C肽单克隆抗体包被的磁颗粒；3)辣根过氧化物酶(HRP)标记的另一株单克隆抗体或多克隆抗体；4)微孔板；5)洗涤液；6)上述酶所作用的化学发光底物液。
2、 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述微孔板为48孔、96孔、 256孔不透明微孔板。
3、 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液包含A液 和B液，其中，A液是O. 05MpH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，包含4. Og/L的鲁米诺 和0. 2g/L的乙二醇乙二醚二胺四乙酸(EGTA)、 2. 5%丙三醇、0. 05g/L对乙酰氨基 酚；B液是O. 05M pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，包含6%过氧化氢、9g/L氯化钠。
4、 C肽微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒的制备方法，其特征在 于制备方法包括配制校准品；制备C肽抗体包被磁颗粒；以辣根过氧化物酶标 记C肽抗体；配制洗涤液；配制化学发光底物液。
5、 如权利要求4所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述配制校准品的 基质配方为含1.5 g/L BSA， 0. l%Procl in300 , 0. 05mol/L PH 7.8 Tris-HCL, 0. 01%甘蓝红。
6、 如权利要求4所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述以C肽抗体包 被磁颗粒，是将磁颗粒通过偶联羧基和/或氨基中的至少一种活性基团后，与C肽 抗体中的赖氨酸残基中裸露氨基反应共价结合的过程，反应结東后用去离子水冲 洗3次，2仰SA封闭，离心去上清液后，用磁颗粒稀释液溶解，备用。
7、 如权利要求6所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述用磁颗粒稀释液 溶解，稀释液配方为0. 05MpH值为7. 2的磷酸盐缓冲液，1. 5%明胶、1%BSA, 5% 乙二醇。
8、 如权利要求4所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述以辣根过氧化物酶标记C肽抗体采用过碘酸钠法进行标记。
9、如权利要求4所述的试剂盒制备方法，其特征在于，所述配制洗涤液，配 方为0.01M pH值为7. 2的磷酸盐缓冲液，0. 01订ween20， 9g/L NaCl。
全文摘要
本发明公开了一种C肽微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明试剂盒包括1)C肽校准品；2)C肽单克隆抗体包被的磁颗粒；3)辣根过氧化物酶(HRP)标记的另一株单克隆抗体或多克隆抗体；4)微孔板；5)洗涤液；6)上述酶所作用的化学发光底物液。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的制备方法包括配制校准品；制备C肽抗体包被磁颗粒；以辣根过氧化物酶标记C肽抗体；配制洗涤液；配制化学发光底物液。本发明试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。
文档编号G01N33/577GK101545909SQ20081010266
公开日2009年9月30日 申请日期2008年3月25日 优先权日2008年3月25日
发明者唐宝军, 宋胜利, 应希堂, 坤 张, 王宏锐, 胡国茂, 郑金来 申请人:北京科美东雅生物技术有限公司