一种胰岛β细胞内胰岛素原正确折叠率的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于糖尿病研究的技术领域，尤其是有关胰岛β细胞内胰岛素原正确折叠率的检测方法。
【背景技术】
[0002]糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病，其发病率逐年上升，严重威胁了人类的健康。高血糖是由于胰岛β细胞功能降低或胰岛素抵抗所致，胰岛β细胞功能为糖尿病研究热点，也可能是治疗的有效靶点。
[0003]胰岛β细胞功能降低表现在胰岛β细胞胰岛素的合成和分泌量的减少，胰岛素合成和分泌是否减少和胰岛素前体一一胰岛素原是否正确折叠密切相关。胰岛素由胰岛素原正确折叠并剪切产生，胰岛素原正确折叠与胰岛素的合成和分泌密切相关。如果胰岛素原无法正确折叠，错误折叠的胰岛素原会形成多聚体形式，无法转化为有功能的胰岛素，只有当胰岛素原正确折叠了才可以被剪切为具有生物功能的胰岛素单体。
[0004]在国内外的研究中，有学者利用放射自显影免疫印记技术研究了胰岛素原在胰岛β细胞内的折叠率，但是放射自显影免疫印记技术存在放射性污染、仪器设备昂贵等问题，因此无法进行普及。
【发明内容】
[0005]解决的技术问题
对于胰岛素原正确折叠率的研究国内现在仍是空白，本发明给出了科学合理的检测胰岛素原正确折叠率的方法。
[0006]采用的技术方案
胰岛β细胞内胰岛素原正确折叠率的检测方法包括如下步骤:
a、胰岛β细胞的培养(以小鼠胰岛瘤细胞ΜΙΝ6为例，购自美国ATCC):
复苏冻存细胞，用含10%(ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM高糖培养基，在37°C、5%(v/v)C02的恒温培养箱中培养，每1~3天换液一次，常规传代；
b、胰岛β细胞的处理:
待步骤a后MIN6分为4组继续培养，分组后细胞贴壁良好、密度适中时，分别换成含环孢素A (环孢素A可以干扰胰岛素原的正确折叠)的DMEM高糖培养基，药物浓度分别为Oymol/L、0.1 ymol/L、l ymol/L 和 10 μ mol/L，干预 MIN6 细胞 48 小时；
C、膜岛β细胞内蛋白的提取:
将步骤b处理后的细胞用细胞裂解液裂解，12000rpm离心30min后提取上清，得到胰岛β细胞胞浆蛋白，将提取的蛋白进行蛋白定量(BCA蛋白定量法)，把不同组蛋白溶液调整成同一浓度；
d、胰岛β细胞胞楽蛋白的还原性western blotting实验:
取调整好浓度的蛋白溶液16ul，加入4ul 5X还原性蛋白质电泳缓冲液(含巯基乙醇)，沸水中煮沸5min，进行SDS-PAGE蛋白质电泳(12%分离胶，5%浓缩胶)，电泳后将胶中蛋白转移到5 X 8cm大小的PVDF膜，转膜完成后用含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭2h，4°C过夜孵胰岛素一抗(CST#8138)，孵完一抗用PBST洗膜3次，每次lOmin，室温2h孵鼠抗二抗(CST#7076)，孵完二抗用PBST洗膜3次，每次lOmin，再用PBS洗膜一次，洗后曝光显影，得到胰岛素western blotting结果；
e、胰岛β细胞胞楽蛋白的非还原性westernblotting实验:
取调整好浓度的蛋白溶液16ul，加入4ul 5X非还原性蛋白质电泳缓冲液(不含巯基乙醇)，不煮沸直接进行SDS-PAGE蛋白质电泳(12%分离胶，5%浓缩胶)，电泳后将胶中蛋白转移到5 X 8cm大小的PVDF膜，转膜完成后用含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭2h，4°C过夜孵C肽一抗(abeam 14181)，孵完一抗用PBST洗膜3次，每次lOmin，室温2h孵兔抗二抗(CST#7074)，孵完二抗用PBST洗膜3次，每次lOmin，再用PBS洗膜一次，洗后曝光显影，得到胰岛素原western blotting结果；
f、胰岛β细胞内胰岛素原正确折叠率的检测:
利用Quantity One软件对western blotting结果进行灰度分析，计算胰岛素原正确折置率。
[0007]有益效果
本发明利用辣根过氧化物酶标记抗体代替放射自显影抗体，同样可以检测到正确折叠和错误折叠的胰岛素原，同时避免了放射性污染，降低了设备所需价格，增加了实验室研究的普及性，为学者进行糖尿病的研究铺平了道路。
【附图说明】
[0008]图1为胰岛素还原性western blotting结果。
[0009]图2为胰岛素原非还原性western blotting结果。
[0010]图3为胰岛素原正确折叠率结果。
具体实施例
[0011]以下为完整的实施例第一步:MIN6细胞的培养
MIN6细胞，购自美国ATCC。复苏冻存细胞，用含10%(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM高糖培养基，在37°C、5%(v/v) 0)2的恒温培养箱中培养，每1~3天换液一次，常规传代。
[0012]第二步:MIN6细胞的处理
待6孔板中细胞贴壁良好、密度适中时，分别换成含环孢素A (环孢素A可以干扰胰岛素原的正确折叠)的DMEM高糖培养基，药物浓度分别为O ymol/U0.1 ymol/LU ymol/L和10 ymol/L，干预MIN6细胞48小时。
[0013]第二步:膜岛β细胞内蛋白的提取
药物处理细胞48h后，提取胞浆蛋白。具体步骤如下:
I)倒去细胞培养基，用预冷的PBS清洗细胞表面2次，洗净残留液体，加入10ul细胞裂解液，冰上放置半小时； 2)将步骤I)放置后的细胞用细胞刮刀轻轻刮下，收集在1.5ml离心管中，高速离心12000rpm，4°C 离心 30min ；
3)将步骤2)离心后的上清吸取到一个新的1.5ml离心管中，离心管中上清为MIN6胞浆蛋白。
[0014]MIN6胞浆蛋白浓度的测定(BCA法)
O完全溶解蛋白标准品(0.5 μ g/ μ 1)，并按AB液比50:1配制BCA工作液；
2)将标准品按0、l、2、4、8、12、16、20ml分别加到96孔板中，加灭菌水补足到20ml；
3)将适量体积样本加到96孔板中，每组设置2个复孔，加灭菌水补足到20ml；
4)各孔加入200mlBCA工作液，放入37°C摇床10rpm混匀30min ；
5)用酶标仪测定各孔572nm吸光度；
6 )绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度，每次提取蛋白浓度为3mg/ml左右。将所有分组调整为同样浓度蛋白溶液，并加入还原性蛋白上样缓冲液(进行还原性电泳)或非还原性蛋白上样缓冲液(进行非还原性电泳)准备电泳。
[0015]第四步:胰岛β细胞胞楽蛋白的还原性western blotting实验 Western blotting实验检测还原性胰岛素。
[0016]I)制备分离胶和浓缩胶:
A分离胶(12%)制备:
蒸馏水1.0 ml
30%Arc-Bis (29:1)2.0 ml
IM Tris, pH 8.81.9 ml
10%SDS50 μ I
10%过硫酸铵50 μ I
TEMED0.2 μ I
总体积:5 ml