专利名称：胰岛素抗性细胞及其转变方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及胰岛素抗性细胞，特别是通过诱导将胰岛素敏感性细胞转变为胰岛素抗性的方法。本发明还涉及转变的细胞的鉴定方法及其在药物筛选中的用途。
背景技术：
糖尿病是一种常见的内分泌疾病，影响糖类代谢和血糖水平，导致高发病率和死亡率，并导致病人个人和卫生系统可观的经济消耗。该疾病有几种形式。I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病或IDDM)是一类自身免疫病，病人体内出现针对胰岛细胞的抗体，错误的将胰脏β细胞当成入侵者加以破坏和清除，从而阻止内源性胰岛素的产生，需要在病人余生中用外源性胰岛素治疗。通常发病于儿童期。用胰岛素或饮食和降血糖药物治疗可使症状减轻，但常常不能防止该病的血管并发症，如早熟性冠心病。
II型或成年发生的糖尿病可能是饮食引起的。II型糖尿病是随着年龄增长越来越普遍的疾病。其最初特征是对胰岛素敏感性的降低，和循环胰岛素浓度的代偿性上升，后者是维持正常血液糖原水平必需的。胰腺β细胞分泌的增加使胰岛素水平提高，导致的高胰岛素血症是与糖尿病的心血管并发症相关的。随着胰岛素抗性恶化，对胰腺β细胞的要求稳定提高，直到胰腺再不能提供足够水平的胰岛素，导致血糖水平提高。最终，发生明显的高血糖和高血脂，导致与糖尿病有关的破坏性的长期并发症，包括心血管疾病、肾衰竭和失明。尚未了解导致II型糖尿病的确切机制，但该机制导致糖原运输、骨骼肌肉受到损害，肝糖原生产增加和胰岛素应答不充分。膳食改善通常是无效的，因此大多数病人最终需要药物干涉，来有效防止和/或减缓疾病并发症的发展。可用一种或多种可行的口服抗-糖尿病药剂治疗病人，来提高胰岛素分泌。但是目前所用的药物可能有副作用。
目前研究和治疗糖尿病的热点主要有二一是各种低糖低脂的食物，但饮食不能根本改善或消除糖尿病的症状。另一种是各种能够降糖的药物和器具。而能够真正阐述II型糖尿病病因以及可高效筛选抗II性糖尿病药物的方法、材料和模型很少见。
II型糖尿病的治疗目前主要着重于提高人体细胞对胰岛素的敏感，而这种提高是着重于胰岛素反应的信号途径上，包括P13K和PKB。
因此，本领域迫切需要开发胰岛素抗性细胞模型，以便进行II型糖尿病的研究。
发明内容
本发明的目的就是提供一种可用于II型糖尿病的研究的胰岛素抗性细胞模型，及其在筛选药物方面的应用。
一方面，本发明提供了一种将胰岛素敏感性的胰岛素受体细胞转变成胰岛素抗性的方法，该方法包括步骤a)用糖浓度为0-0.1毫克/毫升的低糖培养液培养敏感性的胰岛素受体细胞至稳定；b)在培养液中加入胰岛素和葡萄糖，继续培养；c)2-8日后，增加培养液中葡萄糖和胰岛素的浓度，继续培养细胞20-40天。
本发明还提供了用上述方法转变的胰岛素抗性的胰岛素受体细胞。
在一个优选例中，用上述方法转变的胰岛素受体细胞是人脂肪母细胞。
在另一个优选例中，用上述方法转变的细胞用于筛选II糖尿病药物。
本发明还提供了一种筛选II型糖尿病药物的方法，该方法包括在用上述方法转变细胞的过程中，加入要检测的药物，观察待转变的细胞中糖原水平的变化；或在已转变的上述细胞中加入要检测的药物，培养一段时间，观察细胞中糖原水平的变化。
图1显示了糖原染色免疫组织化学分析图的标准。其中-，阴性，细胞结构清晰，无紫红色糖原颗粒；+，弱阳性，细胞结构清晰，紫红色糖原颗粒约占细胞面积的1/3左右。
++，中阳性，细胞结构尚可辨，紫红色糖原颗粒约占细胞面积的1/2-2/3。
+++，强阳性，细胞结构不可辨，紫红色糖原颗粒约占细胞全面积。
图2是对实施例2的细胞进行PKS活性检测的结果。
图3是对实施例3的细胞进行PKS活性检测的结果。
图4是未转化的对照组细胞和实施例2、实施例3的培养细胞糖原染色的免疫组织化学分析图。
图5是泽泄预防细胞产生胰岛素抗性的实验数据图。
图6是泽泄对逆转细胞胰岛素抗性的实验数据图。
具体实施例方式
胰岛素敏感性细胞的转变方法一种将胰岛素敏感性的胰岛素受体细胞转变成胰岛素抗性的方法，其特征在于，该方法包括步骤a)用糖浓度为0-0.1毫克/毫升的低糖培养液培养敏感性的胰岛素受体细胞至稳定；b)在培养液中加入胰岛素和葡萄糖，继续培养；c)2-8日后，增加培养液中葡萄糖和胰岛素的浓度，继续培养细胞20-40天。
本发明步骤b)所用的培养液中加入的起始胰岛素浓度优选为2-10国际单位/毫升，葡萄糖浓度为0.2-0.5毫克/毫升或以上，最优选的本发明步骤b)中的起始胰岛素浓度为4国际单位/毫升，葡萄糖浓度为0.25毫克/毫升。
在本发明方法中，通常通过从约第5日起每隔3-7天，较佳地每隔4-6日逐渐增加培养液中的葡萄糖和胰岛素浓度，例如每隔5天增加浓度各1倍，以便胰岛素受体细胞从敏感性转变成抗性。通常，在培养20-40天，优选25-35天后，胰岛素受体细胞就会从敏感性转变成抗性。
本发明还提供了用上述方法转变的胰岛素抗性细胞。在一个优选例中，用上述方法转变的细胞是人脂肪母细胞。
本文所用的“胰岛素敏感性细胞”是人类表达胰岛素受体细胞，包括表达胰岛素受体的脂肪细胞和肌肉细胞。本发明用于转变的优选表达胰岛素受体的细胞是胰岛素敏感型的人脂肪母细胞。
在本文中，“胰岛素抗性细胞”和“胰岛素抗性受体细胞”可互换使用，都指表达人类表达胰岛素受体，但对胰岛素不敏感的细胞，例如当胰岛素敏感性细胞对胰岛素的感受性从敏感性转变为不敏感后，就成为胰岛素抗性细胞。
胰岛素敏感性细胞可以与胰岛素结合，激活P13K(磷酸肌醇3-激酶)。P13K又通过复杂的机制激活PKB(蛋白质激酶B，又称为Aktβ)。PKB在糖代谢中起关键作用，一方面它能抑制细胞内源肝糖合成，另一方面能激活葡萄糖转运体来促使血糖向细胞内的运输，使得血糖水平迅速下降。II型糖尿病病人本身能分泌胰岛素，但是由于体内产生对胰岛素的抗性，导致血中葡萄糖水平偏高，产生糖尿病症状。一般公认这种现象与PKB功能损伤有关(Han Cho等，InsulinResistance and a Diabetes Mellitus-Like Syndrome in Mice Lacking the ProteinKinase Akt2(PKB)，Science，1999年1月)。研究人员发现，在小鼠中将PKB基因敲除，可使小鼠表现出胰岛素抗性和不可抑制的产生肝糖，出现糖尿病症状。由此可见，胰岛素抗性与PKB功能损伤有关。
胰岛素抗性细胞的检测方法在本发明中，可通过PKB活性检测和细胞内糖原含量的免疫组织化学来检测细胞的诱变转型。
1.PKB活性检测如上所述，由于胰岛素抗性与PKB功能损伤有关，因此对诱导的细胞进行PKB活性检测，可鉴定细胞是否发生了由胰岛素敏感型向胰岛素抵抗型的转变。
用商品化的磷酸激酶测试试剂盒，使用常规方法，如酶的显色反应和蛋白质印迹法进行活性分析。
2.细胞内糖原含量的测试方法细胞如在人为诱导下发生由胰岛素敏感型转变为胰岛素抵抗型，则细胞在胰岛素存在下对外周糖的敏感、摄取和利用也会大大下降，直接导致细胞内糖类和脂肪水平比未转变前的细胞下降了4-5倍，是糖尿病的表征之一，该检测方法具有直观的优点。
在本发明中，可用常规糖原染色的试剂对细胞进行常规染色(组织化学手册，人民卫生出版社，北京，1982，陈啸梅等编)，或者用显微分光光度仪对染色细胞的透光度进行扫描，计算胞内糖原的含量。
用转变的细胞筛选治疗II型糖尿病的候选药物
在另一个优选例中，用上述方法转变的细胞筛选治疗II糖尿病的候选药物。
本发明还提供了一种筛选II型糖尿病药物的方法，该方法包括a)在用上述方法转变细胞的过程中，加入要检测的药物，观察待转变的细胞中糖原水平的变化；或者b)在已转变的上述细胞中加入要检测的药物，培养一段时间，观察细胞中糖原水平的变化。
在a)中，转变过程中如上文转变方法中所述，是高糖高胰岛素环境，而且培养液组分不变，除了加入候选的药物。在培养过程中如上所述检测细胞内糖原含量。加入含有有效成分的候选药物的培养物中，细胞糖原含量未明显下降，而未加药物或加入的药物对II型糖尿病没有作用的培养物中，细胞中糖原含量下降很快，说明该候选药物使细胞很难被高糖和高胰岛素诱变成胰岛素抵抗型。
在b)中，在加入或不加待检测药物的培养液中培养已诱变成胰岛素抗性的细胞一段时间，在药物存在下，胰岛素抗性细胞内部糖原水平上升很快，逐渐恢复成胰岛素敏感状态，而未加药物的细胞中胞内糖原含量基本不变，保持低于正常细胞的水平。
发明效果使用本发明的转变方法，可方便的得到转变为胰岛素抗性的细胞，并用其快速直观的检测出对II型糖尿病有疗效的药物。
实施例实施例1胰岛素敏感性原代细胞的培养原代细胞的取材组织块的处理a.取人的大网膜脂肪组织，切成小块。
b.挑去明显的脂肪，用Hanks培养液洗涤。
c.转移入离心管中200转至1000转/分低速离心5到10分钟，吸去上清液。重新加入培养液，并添加胰蛋白酶和胶原蛋白酶至终浓度0.2-0.5％左右，37℃保温15分钟到40分钟，吸取上清液。连续重复三到五次，合并上清液。
用常规方法对上清液进行混合计数，对细胞进行单集落培养。
依照细胞能否长期存活进行分选，进行细胞接种。
细胞的传代原代细胞接种后，用加入10％BSA的无糖或低糖培养液连续传代2到3代，以使细胞稳定，减少出现死细胞的情况。
实施例2 胰岛素敏感性细胞的转变用加入起始浓度为2国际单位/毫升的胰岛素，起始浓度为0.20毫克/毫升的葡萄糖的培养液继续培养细胞，每五天两个浓度各增加一倍。15天后观察细胞形态以及进行细胞检测，每五天一次，34天后出现明显特征。
实施例3 用高浓度的胰岛素和葡萄糖浓度对胰岛素敏感性细胞进行转变用实施例2所述的相同方法转变细胞，除了起始胰岛素浓度4国际单位/ml，葡萄糖浓度0.25mg/ml，每五天两个浓度各增加一倍。10天后观察细胞形态以及进行细胞检测，每五天一次，26天后出现明显特征。
实施例4 转变细胞的保存分别用液氮将未转变与已转变的细胞保存在-196℃下，遵循使用一管，保存一管的原则，以保证细胞的一惯性。
实施例5 转变细胞的检测在本实施例中，用PKB活性检测和糖原和脂肪含量检测鉴定细胞的转化。
1.PKB活性的检测使用CEll Signaling Tech.(Berverly，MA)的Akt Assay Kit试剂盒(商品目录号9840)，在常规方法中(Livingstone，C.等(1995)EMBO J.14(8)，1785-1797)通过辣根过氧化物酶的显色反应，用蛋白质印迹法检测底物的磷酸化程度，测试PKB磷酸激酶的活性。用未转变的细胞作为对照，培养的细胞重复两次试验。
实验结果图2显示了用实施例2转变的细胞PKB活性检测的结果，可见Akt活性正常的细胞具有阴性条带，样品1和样品2处条带几乎不可辨。说明其PKB活性大大下降，出现转变特征。
图3显示了用实施例3转变的细胞PKB活性检测的结果，可见Akt活性正常的细胞具有阴性条带，样品1和样品2处条带几乎不可辨。说明其PKB活性大大下降，出现转变特征。
2.糖原免疫组织化学检测的结果用发明描述中所述的方法，用Schiff试剂对实施例2和实施例3的培养细胞进行糖原染色，进行免疫组织化学分析。
未转化的对照组细胞和实施例2、实施例3的培养细胞的免疫组织化学分析结果如图4所示。
表1糖原染色阳性比例对照组范例一范例二+ 14％ 3％ 4％++18％ 12％ 13％+++ 52％ 2％ 2％总计 84％ 17％ 19％注+是指糖原染色的阳性程度。每组细胞随机观察10个视野，每个视野点数30个细胞，每组共300个细胞。
从检测结果也可看出对照组细胞内糖原阳性染色比实施例2和3的细胞组不但多，而且强阳性含量更高。这说明了实施例2和3的细胞内糖原含量大大下降，发生了从胰岛素敏感性诱导转变为胰岛素抗性的转变。
实施例6 用转变成胰岛素抗性的细胞筛选药物在本实施例中，用实施例2中获得的细胞模型筛选中药泽泄和中药茯苓，结果表明它们具有治疗II型糖尿病的作用。
实验描述a)在细胞转变培养过程中加入泽泄在如上文所述的诱导转变的高糖高胰岛素培养液中加入或不加入泽泄提取物，继续培养，用实施例5中所述的相同方法分别检测细胞内糖原含量。用显微分光光度仪测量细胞的透光度。用透光度表示细胞中糖原含量。正常细胞一般为0.3-0.4左右，而转变为胰岛素抗性的细胞下降到0.02-0.03。根据下面的公式将其表示为相对糖原含量，对时间作图糖原含量＝1/透光度相对糖原含量＝糖原含量培养的细胞/糖原含量正常细胞×100％
实验结果如图5所示，不加泽泄的对照组中相对糖原含量在第5天开始从约95％下降，在第30天时仅为正常细胞的30％左右，而加入泽泄的细胞内糖原下降程度很小，在第30天仍保持在85％以上。说明泽泄能预防细胞胰岛素抗性表型的出现。
b)泽泄对逆转细胞胰岛素抗性的作用如发明描述中所述，在正常的培养液中加入或不加入泽泄，培养已转变为胰岛素抗性的细胞一段时间，分别检测细胞内的糖原含量，用上式计算相对糖原含量，对时间作图。
实验结果图6是泽泄对逆转细胞胰岛素抗性的实验数据图。可见加入泽泄的实验组中相对糖原含量从第5日起开始上升，至第30日已恢复到正常含量的约90％左右，而未加泽泄的对照组相对糖原含量几乎保持不变，维持在正常水平约20％的低水平，说明泽泄能逆转胰岛素抗性表型，将其转变为对胰岛素敏感的状态，因此对II型糖尿病具有治疗作用。
用本实施例的方法还筛选出茯苓，具有对II型糖尿病的预防和治疗作用(数据未显示)。
所有在本文中引用的文献，包括专利、专利申请和出版物，在此全文引入以供参考。虽然本发明已着重于优选例进行了描述，但本领域普通技术人员显然将明白，可在优选例中制备和使用各种变化，而且除了本文中特别描述的以外，可用其它方式实施本发明。本发明将包括这些变化和其它实施方式。
权利要求
1.一种将胰岛素敏感性的胰岛素受体细胞转变成胰岛素抗性的方法，其特征在于，该方法包括步骤a)用糖浓度为0-0.1毫克/毫升的低糖培养液培养敏感性的胰岛素受体细胞至稳定；b)在培养液中加入胰岛素和葡萄糖，继续培养；c)2-8日后，增加培养液中葡萄糖和胰岛素的浓度，继续培养细胞20-40天。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法中步骤b)中起始胰岛素浓度为2-10国际单位/毫升，葡萄糖浓度为0.2-0.5毫克/毫升。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法中培养的起始胰岛素浓度为4国际单位/毫升，葡萄糖浓度为0.25毫克/毫升。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法通过从第5日起每隔3-7日增加培养液中的葡萄糖和胰岛素浓度各1倍。
5.用如权利要求1所述的方法转变的胰岛素抗性的胰岛素受体细胞。
6.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，该细胞是人脂肪母细胞。
7.如权利要求5所述的细胞的用途，其特征在于，该细胞用于筛选II型糖尿病药物。
8.一种筛选II型糖尿病药物的方法，其特征在于，该方法包括在如权利要求1所述的转变方法中，在待转变的细胞中加入要检测的药物，观察细胞糖原水平的变化；或在已转变的如权利要求5所述的细胞中，加入要检测的药物，培养一段时间，观察细胞中糖原水平的变化。
全文摘要
本发明提供了一种将胰岛素敏感性细胞转变为胰岛素抗性细胞的方法，包括步骤a)用糖浓度为0－0.1毫克/毫升的低糖培养液培养敏感性的胰岛素受体细胞至稳定；b)在培养液中加入胰岛素和葡萄糖，继续培养；c)2－8日后，增加培养液中葡萄糖和胰岛素的浓度，继续培养细胞20－40天。本发明还提供了用这种方法转变的细胞及其应用。运用本发明可以简便迅速的筛选对II型糖尿病具有疗效的药物。
文档编号C12N5/08GK1436844SQ0211083
公开日2003年8月20日 申请日期2002年2月9日 优先权日2002年2月9日
发明者吴超群, 高瑞兰, 钟翠平, 郭红卫 申请人:上海复旦金科生物技术有限公司