专利名称：一种增加促胰岛素分泌肽融合蛋白生物活性的方法
技术领域：
本发明提供一种增加促胰岛素分泌肽融合蛋白生物活性的方法，涉及治疗非胰岛 素依赖性糖尿病及肥胖症的长效药物的制备，在药学领域有良好的应用前景，属于生物医 药技术领域。
背景技术：
1、糖尿病随着现代人类劳动强度显著下降和饮食习惯的改变，糖尿病的发病率迅速上升， 根据WHO最新统计，全世界有糖尿病患者1. 25亿，其中90%以上为II型糖尿病。糖尿病通 常分为I型糖尿病和II型糖尿病两种。I型糖尿病，约占糖尿病病人总数的10%，常发生 于儿童和青少年，病因是患者体内胰腺产生胰岛素的细胞已经彻底损坏，从而完全失去了 产生胰岛素的功能。患者需依靠外源胰岛素存活，一旦中止胰岛素治疗则威胁生命。II型 糖尿病，约占糖尿病病人总数的90%，发病年龄多数在35岁以后。II型糖尿病即非胰岛素 依赖型糖尿病的确实发生机制，目前仍无定论，但推测可能受遗传及饮食失节、缺乏运动、 形体肥胖、化学药物等的影响，逐渐形成的一种内分泌失衡之疾病。主要根源于胰岛之3 细胞受损，致胰岛素分泌不足；或是胰岛受体障碍而不能正常利用胰岛素。随着我国国民经 济的快速发展，人民生活水平不断提高，糖尿病发病率的上升及患者的低龄化现象越来越 明显。上世纪70年代末，国内糖尿病的患病率还不足1%，而目前已达3%以上，2007年统 计，中国糖尿病患者已有4000万人以上；据WHO最新数据预测，到2010年中国糖尿病人将 增加4倍，且糖尿病人群的发展正趋于低龄化。因此防治糖尿病已是一项迫不及待的紧急 任务。2、肥胖症肥胖，特别是上身肥胖，是世界上营养过剩的人群当中最常见的营养紊乱。大量研 究证实，减轻体重可大大降低慢性疾病的危险，所述慢性疾病如糖尿病、高血压、高血脂症、 冠心病和肌骨骼病。减轻体重是许多慢性疾病治疗的一个具体目标。目前帮助减轻体重的 方法均不能让人完全满意。某些肥胖症患者可通过刻意调整行为来减轻体重，如改变饮食 和增加运动；通过这些方法无法减轻体重的患者则可能是由于某些遗传因素，它们引起食 欲增加，导致偏好高脂食物或脂肪生成代谢的倾向。因此，急需帮助减轻体重的新方法和组 合物(如药物)来补充旧的方法。3、促胰岛素分泌肽-1促胰岛素分泌肽-1，也称类胰高血糖素样肽-KGlucogan Like Peptide 1，简称 GLP-1)是一个含37个氨基酸的短肽，GLP-1的成熟肽是由7-36个氨基酸组成，具有在血 糖浓度较高情况下促进胰岛素分泌的功能。因此GLP-1在调节高血糖时不会产生低血糖 副作用。又因GLP-1可以抑制食欲，减缓胃液分泌和胃排空(Nauck, 1993 ；Gutniak et al, 1992)，所以也可将其作为控制体重的药物。但GLP-1在人体内会迅速降解，在血清中的半 衰期只有1-2分钟，因此无法发挥其生物学功能。研究表明，一些GLP-1的衍生物和类似物具有更好的生物活性和稳定性。例如，Amylin公司的Exenatide/Exendin-4，在人体内的半 衰期为2-3小时，每天注射2次可改善血浆葡萄糖水平，同时在24周后体重也得到明显降 低。但是Exenatide/Exendin-4也需要每天注射两次，仍然很不方便。N Nordisk公司的 NN2211(Liraglutide)是GLP-1并连16-碳脂肪酸链，这个NN2211在体内和血浆白蛋白结 合，致使血浆半衰期超过10小时，可以实现每天注射1次。4、长效促胰岛素分泌肽融合蛋白质药物 通过将促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白(HSA)或免疫球蛋白Fc的融合，可以产 生长效促胰岛素分泌肽融合蛋白质药物。人血清白蛋白在正常生理状态下不易透过肾 小球，在血清中的半衰期达14-21天，利用基因工程技术，将人血清白蛋白与具有生物活 性的蛋白分子进行重组表达的融合蛋白，已经成为开发长效蛋白药物的一个重要手段。 HGS公司的Albugon是GLP-I和人血清白蛋白的融合蛋白，它在猴子体内的半衰期可达3 天。又如Lilly公司采用基因工程方法将GLP-I与免疫球蛋白(IgG)的Fc融合；加拿大 ConjuChem公司开发研制的Exendin-4与人血清白蛋白(Recombumin )在体外结合产 生Exendin-4-HSA(CJC-1134-PC)。这些融合蛋白虽然能具备促进胰岛素分泌肽的药理特 性，并延长其在体内的半衰期，但这些融合蛋白的生物活性仅为非融合的单体Exendin-4 或GLP-I的1/10—1/40(等摩尔数相比)。本发明中采用基因重组技术，将Exendin-4和 GLP-I串联组合后与人血清白蛋白或免疫球蛋白(IgG)的Fc进行融合，在保持Exendin-4 的药理特性的基础上延长其在体内的半衰期，同时具有比单个Exendin-4或GLP-I与 人血清白蛋白或免疫球蛋白(IgG)的Fc的融合蛋白(如Exendin-4-HSA，GLP-I-HSA, Exendin-4-Fc, GLP-I-Fc)具有更高的生物活性，在药学领域包括II型糖尿病及肥胖症治 疗将有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于开发一类具有高活性的促胰岛素分泌肽融合蛋白，使之成为新 一代治疗糖尿病和肥胖症的药物。为实现上述目的，本发明提供了一种促胰岛素分泌肽融 合蛋白及其制备方法，增加该融合蛋白的生物活性。本发明的技术方案一种促胰岛素分泌肽融合蛋白，采用Exendin-4和GLP-I 串联后与HSA或人免疫球蛋白Fc连接形成融合蛋白，以增加促胰岛素分泌肽融合蛋白 的生物活性；该融合蛋白含有2个多肽区，其中第一多肽区序列由Exendin-4-GLP-l或 GLP-l-Exendin-4串联序列组成，串联方式为Exendin-4的C-末端与GLP-I的N-末端或 GLP-I的C-末端与Exendin-4的N-末端连接，上述串联序列可以以同一方向依次重复η 次，重复数η为1-5;优先重复数为1。上述的(Exendin-4-GLP-l)串联序列氨基酸具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列 或与该序列有90%以上同源性；所述的(GLP-l-Exendin-4)串联序列氨基酸具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列或与该序列有90%以上同源性。第二多肽区选自a)人血清白蛋白HSA，具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列或与该序列有90%以 上同源性；或b)人免疫球蛋白Fe，具有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列或与该序列有90%以上同源性。第一多肽区通过其C-末端与第二多肽区的N-末端，或者第二多肽区的C-末端和 第一多肽区的N-末端连接；该融合蛋白表示为(Exendin-4-GLP-l)n-HSA,(GLP-l-Exendin-4)n-HSA, (Exendin-4-GLP-l)n-Fc, (GLP-l-Exendin-4) n_Fc，上述串联序列中的n代表该串联序列 以同一方向依次排列的重复数，重复数n为1-5，优先为1。例如，一项具体的与HSA连接的融合蛋白制备步骤可以概括描述如下制备步骤为(1)人血清白蛋白HSA基因克隆，获得HSA基因； (2) Exendin-4-GLP-l 基因或 GLP-l-Exendin-4 基因合成；(3)Exendin-4-GLP-l 与 HSA 基因融合或 GLP-l-Exendin-4 与 HSA 基因融合；(4)构建 Exendin-4-GLP-l/HSA 的表达载体或 GLP-l-Exendin-4/HSA 的表达载 体；(5)含 Exendin-4-GLP-l/HSA 融合蛋白或 GLP-l-Exendin-4/HSA 融合蛋白表达工 程菌的构建；(6) Exendin-4-GLP-l/HSA 或 GLP-l-Exendin-4/HSA 融合蛋白的表达和纯化；(7) Exendin-4-GLP-l/HSA 或 GLP-l-Exendin-4/HSA 融合蛋白的活性测定。上述步骤(1)至(7)仅描述了一种具体的该融合蛋白的制备方法，不能理解为限 制本发明的范围。有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和 范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。上述Exendin-4-GLP-l串联序列氨基酸具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列或与 该序列有90%以上同源性。上述GLP-l-Exendin-4串联序列氨基酸具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或与 该序列有90%以上同源性。所述的融合蛋白的核苷酸序列为融合蛋白的氨基酸序列对应的核苷酸序列或其 互补核苷酸序列。本发明还提供了一种载体，它含有上面所述核苷酸序列，一个具体的表达载体为 Exendin-4-GLP-1 /HSA-pPIC9K 表达载体或 GLP-l-Exendin_4/HSA-pPIC9K 表达载体。本发明还提供了一种宿主细胞，它包含上述载体。在本发明中的术语及相关方法术语“蛋白质”、“肽”或“多肽”可互换使用。它们指通过肽键或酰胺键连接在一 起的两个或多个氨基酸的链，无论是否经过翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。术语“第一多肽区的C-末端或与第二多肽区的N-末端连接”是指这两种多肽/蛋 白质分子间的连接无任何连接多肽，这避免了因不必要的连接肽可能导致的免疫原性。连 接方式可以是以第一多肽区的C-末端直接连接在第二多肽区的N-末端上，也可以是第一 多肽区的N-末端直接连接在第二多肽区的C-末端上。优选连接方式是第一多肽区的C-末 端直接连接在第二多肽区的N-末端。术语“单个Exendin-4或GLP-1 ”。是相对于“串联序列”而言，其指单个Exendin-4 或GLP-1多肽。术语“串联序列”指每个Exendin-4单体C-末端与GLP-1单体的N-末端直接连接，或者是每一个GLP-I单体的C-末端与Exendin-4单体的N-末端直接连接，串联 序列可以以同一方向依次重复，重复数为1-5，优先重复数为1。在本发明的一个较佳实施例中，本发明的所述融合蛋白具有选自氨基酸序列SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列；
本发明另一方面提供了核酸序列，它具有编码上述融合蛋白的核酸序列或其互补 序列。另外，本发明的核酸序列的范围内还涵盖了与相同或基本上相同的核酸序列，如有至 少90 %、甚至95 %以上的同源性或相同性的核酸序列。本发明的核酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。并用 商品化的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得 到有关序列，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起，将其克隆入载体，再转入 细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明的融合蛋白用重组方法来制备。具体地说，将编码Exendin-4-GLP-l串 联序列与HSA多肽的核酸序列直接连接，形成Exendin-4-GLP-l-HSA重组融合基因，将编 码GLP-l-Exendin-4串联序列与HSA多肽的核酸序列直接连接，构成(GLP-1-Exendin_4) n-HSA重组融合基因；采用类似方法，将编码Exendin-4-GLP-l串联序列与人免疫球 蛋白Fc多肽的核酸序列直接连接，构成(Exendin-4-GLP-l)n-FC重组融合基因，或将 编码GLP-l-Exendin-4串联序列与人免疫球蛋白Fc多肽的核酸序列直接连接，构成 (GLP-l-Exendin-4)n-Fc重组融合基因。上述串联序列中的η代表该串联序列以同一方向 依次排列的重复数，重复数η为1-5，优先重复数为1。然后，上述重组核酸序列被克隆到表达载体质粒中，选用的表达质粒载 体包括适合在不同细胞宿主中表达融合蛋白的各种质粒，例如采用表达载体质粒 pPIC9K (Invitrogen)，可以在市场上获得。然后，将上述表达质粒转化到重组工程细胞宿主内，从而构建表达本发明融合蛋 白的重组工程细胞宿主。这些重组工程细胞可以是来源于动物，植物，昆虫，真菌，酵母，细 菌等。质粒PPIC9K适合在酵母工程菌中表达融合蛋白，因此优选的重组工程细胞宿主为酵 母工程菌，例如采用毕赤酵母工程菌ΚΜ71。本文所用的术语“转化”是指用本领域技术人员熟知的方法将含有感兴趣核酸的 表达载体直接导入宿主细胞内。转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括电转化；采用氯 化钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；感染和其它方法(见Sambrook 等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。较佳的方法是电转化方法。随后，在适合本发明融合蛋白表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。本领域技 术人员根据常规试验就能选择和确定培养基、培养温度、时间等条件。采用本领域常规检测 手段，如SDS-PAGE，Western印迹等，可以检测出本发明融合蛋白的表达。最后，可用常规的 蛋白分离纯化技术，进行融合蛋白的纯化，其包括离心，沉淀，过滤，层析等手段。具体地，层 析方法又包括亲和法，凝胶过滤，离子交换，疏水层析，以及反向层析等。本发明提供的本发 明的融合蛋白的分离纯化方法也包括上述各种方法的适当组合。本发明也提供了一种鉴定促胰岛素分泌肽融合蛋白的生物活性的方法。具体而 言，采用子HEK-293/GLP-1R细胞，GLP-I及激动剂可诱导该细胞系产生cAMP，cAMP产生量与 活性呈正相关。该方法是测定融合蛋白激活GLP-I受体的能力，并与Exendin-4激活GLP-I受体的能力进行比较，从而计算出融合蛋白生物活性。本发明的有益效果本发明提供了一种产生本发明所述融合蛋白的方法，该方法 包括提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含表达载体，在适合蛋白表达的条件下由宿主细胞 产生并经分离获得融合蛋白，该融合蛋白不仅具备促胰岛素分泌肽的药理特性、延长其在 体内的半衰期，同时具有比 Exendin-4-HSA，GLP-1-HSA，Exendin-4-Fc，GLP-1-Fc 融合蛋白 具有更高的生物活性，在药学领域包括II型糖尿病及肥胖症治疗将有良好的应用前景。
图lExendin-4-GLP-l-HSA融合蛋白表达质粒构建策略图。图2Exendin-4-GLP-l_HSA融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳结果。1、蛋白质分子量 标志物，2、3、4为Exendin-4-GLP-l-HSA融合蛋白表达上清液。图3Exendin-4-GLP-l_HSA融合蛋白表达的Western印迹结果。1、蛋白质 分子量标志物，2、与抗Exendin-4抗体的Western-blotting，3、与抗GLP-1抗体的 Western-blotting, 4、与抗 HSA 抗体的 Western-blotting。图 4HEK-293/GLP-1R 细胞经 Exendin-4-GLP-l-HSA、Exendin-4-HSA、Exendin-4, HSA刺激后生物活性测定。表明Exendin-4-GLP-l-HSA融合蛋白具有激活人GLP-1受体的 生物活性，显示其生物活性高于Exendin-4-HSA。图5小鼠糖耐量试验。显示Exendin-4-GLP-l-HSA生物活性高于Exendin-4-HSA。
具体实施例方式下面以Exendin-4-GLP-l/HSA为例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用 于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物 学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术 在下列文献或其它已经公开发表的文献中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆实验指 南》第2版(1989)；《蛋白质纯化原理和实践》第2版(Springer-Verlag,N. Y.)，以及《实 验免疫学手册》I-IV卷(D. C. Weir和C. C. Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商 所提供的说明书进行。实施例1 人血清白蛋白HSA基因克隆，获得HSA基因人血清白蛋白HSA基因可以通过RT-PCR获得。通过以人胚胎cDNA为模板，用PCR 方法扩增HSA基因。根据HSA基因序列SEQ ID NO 5设计PCR扩增引物HSA引物1和HSA 引物2。其序列如下HSA 引物 1 :5’ -GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3’HSA 引物 2 5，-GCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3，。划线部分为NotI酶切点。PCR 反应体系为人胚胎 cDNA :liiL ;HSA 引物 1 :50 y M、1 y L ;HSA 引物 2 :50 y M、 1 u L ；lOXpfu 聚合酶缓冲液 5ii L ；MgCl2 :25mM、5ii L ；dNTP :2mM、4ii L ；pfu 聚合酶 1 u L ； ddH20 补足到总的反应体系为50 ii L。PCR 反应条件为94°C、2min ；然后，94°C、30sec ；55°C、30sec ；72°C、90sec，共进行 30个循环。用的琼脂糖胶对PCR产物进行凝胶电泳，在紫外灯下切下1800bp左右的目的DNA条带，再用PR0MEGA公司的PCR产物胶回收试剂盒回收HSA基因片段。采用紫外分 光光度法测定回收产物的浓度后，-20°C保存。实施例2 :Exendin-4-GLP-l 基因合成按照SEQ ID NO 6的要求，由上海英俊生物技术有限公司合成Exendin-4-GLP-l 的基因序列，并使其3'端带上一段HSA基因的5'端序列。实施例3 :Exendin-4-GLP-l 与 HSA 基因融合本实施例以Exendin-4-GLP-l基因和HSA基因融合形成Exendin-4-GLP-l/HSA融 合基因为例，说明融合基因的克隆方法。本方法也适合HSA基因与其它基因形成融合基因 的克隆。根据SEQ ID NO :6，设计合成一条引物EXT 1 5' -TTTACGTACACGGTGA AGGTACTTTCACT-3‘划线部分为SnaBl酶切点。融合蛋白基因的制备使用Overlap PCR的反应方法获得。具体如下。Overlap PCR的反应体系为Exendin-4_GLP-lDNA :2u L ；HSA DNA :2u L ；lOXpfu 聚合酶缓冲液5u L ； 25mM的MgCl25 y L ;2mM的dNTP 4u L ；pfu聚合酶1 u L ； ddH20补足到 总的反应体系为50iiL。PCR 条件为开始，94°C、2min ；然后，94°C、30sec ；55°C、30sec ；72°C、2min ；—共 5个循环。然后，加入50iiM引物EXT1 :2u L^P 50uM HSA引物2:2yL。进入下个程序 94°C、30sec ；55°C、30sec ；72°C、2min ；—共 30 个循环。然后用常用的分子生物学方法，分离获得融合基因克隆。采用的琼脂糖凝胶 对PCR产物进行电泳，从电泳胶上切下分子量在1900bp左右的DNA条带，再用PR0MEGA公 司的PCR产物胶回收试剂盒回收Exendin-4-GLP-l/HSA融合基因片段。实施例4 :Exendin-4-GLP-l/HSA 融合蛋白表达载体 Exendin-4-GLP_l/ HSA-pPIC9K 的构建以下以Exendin-4-GLP-l/HSA融合基因为例，说明表达载体的构建。本实验采用pPIC9K为表达质粒，其构建方法为常用分子生物学方法。即，通过培 养含有表达载体的菌种，提取获得该质粒。制备好的质粒-20°C保存待用。为了将Exendin-4-GLP-l/HSA融合基因连接到pPIC9K表达质粒中，先用SnaBl和 Notl限制性内切酶对表达质粒PPIC9K和Exendin-4-GLP-l/HSA融合基因进行双酶切。具 体条件如下。37°C恒温水浴锅内反应3小时，酶切体系如下Exendin-4-GLP-l/HSA 融合基因的酶切体系Exendin-4_GLP-l/HSA DNA :10u L ； SnaBl 1 u L ；Notl 1 u L ； NEBuffer2 :5u L ； ddH20 补足到总反应体积 50 u L。pPIC9K 的酶切体系表达质粒 pPIC9K DNA :10u L ； SnaBl :luL ；Notl, 1 u L ； NEBuffer2 :5u L ； ddH20 补足到总反应体积 50 ii L。然后用常用的分子生物学方法，分离获得经双酶切的Exendin-4-GLP-l/HSA融 合基因以及经双酶切的PPIC9K质粒DNA。具体是用的琼脂糖凝胶对酶切产物进 行电泳，切下目的条带，再用PR0MEGA公司的PCR产物胶回收试剂盒回收经双酶切的 Exendin-4-GLP-l/HSA融合基因片段，以及pPIC9K质粒DNA片段。
然后，对酶切产物进行连接，获得Exendin-4-GLP-l/HSA融合基因表达载体 Exendin-4-GLP-1 /HSA-pPIC9K 具体如下总的连接体系为10 μ L，包括T4DNA连接酶缓 冲液1 μ L,双酶切的Exendin-4-GLP-l/HSA基因DNA 2 μ L,双酶切表达质粒pPIC9K DNA 2 μ L，T4DNA连接酶1 μ L，无菌水补足至10 μ L0 16°C恒温水浴保温过夜。连接产物转化感受态DH5 α细胞。取一管感受态DH5 α细胞加入连接产物，轻柔混 勻后冰上放置30min，再在42°C水浴放置2min。加入500 μ L LB液体培养基在37°C 180r/ min摇4 0min。取100 μ L转化液涂于卡那抗性的LB固体培养基，37°C倒置培养12-16小时。阳性克隆的鉴定是通过挑取单个转化子菌落，抽提质粒，进行酶切分析和测序结 果来确定。实施例5 含Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白表达工程菌的构建本实施例利用电转化方法和融合表达载体(Exendin-4-GLP-l/HSA-pPIC9K)为 例，构建表达Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白的工程菌。具体方法如下。首先挑选含有EXendin-4-GLP-l/HSA-pPIC9K表达载体的细菌进行克隆，提取表 达载体DNA，提取方法为常用的分子生物学方法。然后，用电转化的方法把质粒转入毕赤酵 母KM27。电转化方法具体如下先进行菌体的准备。挑取毕赤酵母KM27单菌落，接种至含 有5mLYPD培养基的50mL三角瓶中，30°C、250-300r/min培养过夜。然后取100-500 μ L的 培养物接种至含有500mL新鲜YPD培养基的2L三角摇瓶中，28 30°C、250-300r/min培养 过夜，至OD6tltl达到11.5。再将细胞培养物于4°C，1500g离心5min，用500mL的冰预冷的无 菌水将菌体沉淀重悬。离心后，再用250mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。再离心，用 20mL的冰预冷的Imol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用ImL的冰预冷的Imol的 山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1. 5mL。然后用电击方法进行转化。具体如下将5 20 μ g表达质粒Exendin-4-GLP-l/ HSA-pPIC9K的DNA溶解于5 10μ L Tris缓冲液中，与80 μ L的上述步骤所得的菌体混勻， 转至0.2cm冰预冷的电转化杯中。将电转化杯冰浴5min。然后根据相应的电转化仪，采用 优化的电压、电流、电容等参数，进行电击。电击完毕后，加入ImL冰预冷的山梨醇溶液将菌 体混勻，转至1. 5mL的Eppendorf管中，将菌体悬液涂布于山梨醇平板上，每200 600 μ L 涂布一块平板。将平板置于30°C培养，直至单个菌落出现。实施例6 :Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白的表达和纯化实施例5中构建的Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白表达工程菌，可以用以下的方 法表达融合蛋白将Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白表达酵母菌种接种于500mL的BMGY培 养基(蛋白胨2%，酵母提取物1%，甘油1%，YNB 1.34%,D-biotin 4X10_5%，用0. IM的 磷酸钾缓冲液调PH至6)中，摇床30°C、180r/min,培养48小时。然后，5升YP (蛋白胨2%， 酵母提取物1%)的发酵罐中，高压灭菌30min，冷却后加入除菌后的YNB 1. 34%,D-biotin 4X10_5%和甲醇配成BMMY培养基。将预培养的菌液接种至BMMY中，发酵过程控温在 300C，溶氧始终大于20%的饱和度，pH控制在5. 5-6左右，每24h补加1 %甲醇，连续发酵5 天。利用常用的重组蛋白分离方法，获得以上酵母所表达的融合蛋白初提物。具体地，可以 利用离心，超滤浓缩等方法。然后，可以利用层析方法，进一步纯化融合蛋白。具体地，可以 采用S印harose SP XL层析柱用于融合蛋白的捕获，再利用Butyl Sepharose FF层析柱， 以及DEAE Sepharose FF层析柱，进行更高的纯化。
融合蛋白表达和纯化结果通过常用的蛋白分析方法进行鉴定，包括但不限制 于SDS-PAGE，Western印迹等方法。图2为Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白表达产物的 SDS-PAGE电泳，结果显示71KDa左右的蛋白质条带，Western印迹方法证明该蛋白质条带具 有Exendin-4，GLP-1，HSA抗原性，证明表达的蛋白质为Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白，如 图3所示。实施例7 :Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白的活性本实施例中采用HEK-293/GLP-1R细胞体外测定方法对HSA/GLP-1融合蛋白进行 活性测定，GLP-1及激动剂可诱导该细胞系产生cAMP，cAMP产生量与活性呈正相关。具体 是测定Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白激活GLP-1受体的能力，并与Exendin-4-HSA激活 GLP-1受体的能力进行比较。具体方法如下按20，000至40，000细胞/孔(96孔黑亮底 平板)的量，接种HEK-293/GLP-1R细胞，培养1天后换用无血浆培养15-20小时后分别加 人不同浓度的Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白，Exendin-4或HSA，培育2h后测定每孔细胞 的 cAMP 含量(AB 公司 cAMP-Screen system, ELISA Kit)，结果表明 Exendin-4-GLP-l/HSA 融合蛋白比Exendin-4-HSA融合蛋白具有更高的生物活性，结果见图4。 实施例8 小鼠耐糖试验C57BL/6J小鼠禁食过夜(15小时)后按每公斤小鼠体重腹腔内分别注射 Exendin-4-GLP-l/HSA 融合蛋白 0. 2mg，或 Exendin-4-HSA 融合蛋白 0. 2mg。lh 后再在小鼠 腹腔内按每公斤小鼠体重注射葡萄糖2mg/kg小鼠体重，在不同的时间段取血样测定其葡 萄糖含量，结果显示Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白比Exendin-4-HSA融合蛋白具有更明 显降低小鼠血糖的效果，如图5所示。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的， 即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利 要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均 纳入本文作参考。
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权利要求
一种促胰岛素分泌肽融合蛋白，其特征在于采用Exendin-4和GLP-1串联后与人血清白蛋白HSA或人免疫球蛋白Fc连接形成融合蛋白，以增加促胰岛素分泌肽融合蛋白的生物活性；该融合蛋白含有2个多肽区，其中第一多肽区序列由Exendin-4-GLP-1或GLP-1-Exendin-4串联序列组成，串联方式为Exendin-4的C-末端与GLP-1的N-末端或GLP-1的C-末端与Exendin-4的N-末端连接，上述串联序列以同一方向依次重复n次，重复数n为1-5；第二多肽区选自人血清白蛋白HSA，或人免疫球蛋白Fc；第一多肽区通过其C-末端与第二多肽区的N-末端，或者第二多肽区的C-末端和第一多肽区的N-末端连接；该融合蛋白表示为(Exendin-4-GLP-1)n-HSA，(GLP-1-Exendin-4)n-HSA，(Exendin-4-GLP-1)n-Fc，(GLP-1-Exendin-4)n-Fc，n为1-5。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于Exendin-4-GLP-l串联序列氨基酸具 有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列或与该序列有90%以上同源性。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于GLP-l-Exendin-4串联序列氨基酸具 有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或与该序列有90%以上同源性。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于第二多肽区选自a)人血清白蛋白HSA，具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列或与该序列有90%以上同 源性；或b)人免疫球蛋白Fe，具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列或与该序列有90%以上 同源性。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的核苷酸序列为融合 蛋白的氨基酸序列对应的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
6.一种权利要求1所述的促胰岛素分泌肽融合蛋白的制备方法，其特征在于制备步骤为(1)人血清白蛋白HSA基因克隆，获得HSA基因；(2)Exendin-4-GLP-l基因或 GLP-l-Exendin-4 基因合成；(3)Exendin-4-GLP-l与 HSA 基因融合或 GLP-l-Exendin-4 与 HSA 基因融合；(4)构建Exendin-4-GLP-l/HSA 的表达载体或 GLP-l-Exendin-4/HSA 的表达载体；(5)含Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白或GLP-l-Exendin-4/HSA融合蛋白表达工程菌 的构建；(6)Exendin-4-GLP-l/HSA 或 GLP-l-Exendin-4/HSA 融合蛋白的表达和纯化；(7)Exendin-4-GLP-l/HSA 或 GLP-l-Exendin-4/HSA 融合蛋白的活性测定。
全文摘要
一种增加促胰岛素分泌肽融合蛋白生物活性的方法，属于生物医药技术领域。本发明采用Exendin-4和GLP-1串联后与人血清白蛋白HSA或人免疫球蛋白Fc连接形成融合蛋白，以增加促胰岛素分泌肽融合蛋白的生物活性；该融合蛋白表示为(Exendin-4-GLP-1)n-HSA，(GLP-1-Exendin-4)n-HSA，(Exendin-4-GLP-1)n-Fc，(GLP-1-Exendin-4)n-Fc，n为1-5。本发明制备的融合蛋白比Exendin-4-HSA或GLP-1-HSA融合蛋白具有更高的生物活性。本发明的融合蛋白可用于制备非胰岛素依赖性糖尿病及各种症状和肥胖症的治疗药物。
文档编号C12N1/19GK101875700SQ20101014243
公开日2010年11月3日 申请日期2010年4月9日 优先权日2010年4月9日
发明者余传信, 杨建良, 王斯靖, 高琪 申请人:无锡和邦生物科技有限公司;江苏省血吸虫病防治研究所