一种防治菌核病的噬菌核霉菌株jn-cm的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物农药【技术领域】，具体涉及一种防治菌核病的生防菌噬菌核霉JN-CM菌株。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(编号：CGMCC?No.8325)。本发明还公开了所述该菌株的生物特征及培养方法。本发明的微生物菌对菌核病具有较好的生防效果。
【专利说明】—种防治菌核病的噬菌核霉菌株JN-CM
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种防治菌核病的生防菌噬菌核霉JN-CM菌株，属生物农药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]核盘菌[Scerotiniasclerotionrum (Lib.) de Bary]是世界性的植物病原菌,可引起408种植物的菌核病。由其引发的油菜菌核病仍然是现中国农业生产中的难题。目前多采用化学农药进行控制，而核盘菌核的抗药性、化学农药对生态环境的污染以及人类身体健康的侵害是比较严重的问题。Coniothyrium minitans Campbell是1947年由美国学者Cambell首先发现并报道的一种重要的菌核寄生菌。Coniothyrium minitans被认为是一种对于核盘菌(Scerotinia sclerotionrum)很有前景的生防菌。Coniothyrium minitans的中文通用名为嗤囷核霉((2012)农标子044号)，目如嗤囷核霉广品在欧州已有两种霉制剂(K0NI和Contans)出售。国内尚没有关于噬菌核霉制剂产品上市。前期，我们从生长在江苏省大丰油菜地土壤中分离所得了噬菌核霉，在NCBI中对测定的序列进行Blast，结果显示我们分离得到高致腐力的噬菌核霉JN-CM的微生物分类学为真菌界，子囊菌门，座囊菌纲，格孢菌目，小球腔菌科，盾壳霉属，小盾壳霉种的噬菌核霉。该菌有着很强的产孢能力和抗菌核菌活性。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种分离自中国江苏省大丰油菜地土壤中具有抗菌核病活性的微生物菌株噬菌核霉菌。本发明所述的噬菌核霉菌系从中国江苏省大丰油菜地中分离获得。现在国家知识产权局认可的保藏单位保藏，保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称:CGMCC，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮政编码:100101。保藏日期为2013年10月12日，保藏编号为CGMCC No:8325。本发明所述的卩遼菌核霉菌命名为卩遼菌核`霉JN-CM(Coniothyrium minitans)。
[0004]1、噬菌核霉JN-CM的分子生物学鉴定:
[0005]采用以下引物，ITSl:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4:5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 扩增核糖体 DNA 的 ITSU5.8s 和 ITS2 区域(图 3)，对噬菌核霉JN-CM扩增产物测序结果为:
[0006]CCCCTGGGGGCTCCCCCAGGTGGTAAGGTGAAATACCCTATCGCGCCGCATACCTGCATCCTTTTTTTACGAGCACCTTTCGTTCTCCTTCGGCGGGGCAACCTGCCGCTGGAACCTGATAAACCTTTTTTGCATCTAGTATTACCTGTTCTGATACAAACAATCGTTACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATCTACACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGCGTCTGTCCCGCCTTTGCGCGCGGACTCGCCCCAAACTCATTGGCAGCGGTTTTTGCCTCCTCTCGCGCAGCACAATTGCGTCTGCGAGGGGGCGTGGCCCGCGTCCACGAAGCAACATTACCGTCTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATAATTAAAGCGGAGGAA
[0007]在NCBI中对测定的序列进行Blast，结果显示我们分离得到高致腐力的噬菌核霉JN-CM的微生物分类学为真菌界，子囊菌门，座囊菌纲，格孢菌目，小球腔菌科，盾壳霉属，小盾壳霉种的嗤囷核霉。
[0008]采用引物DAF-4:5’-CGGCAGCGCC-3，DAF-6:5’-GCCGTCGCGG-3，DAF-8:5’ -CGGCGCCGCC-3’ DAF-9:5’ -CCGACGCGGC-3’对本噬菌核霉菌与德国商品化的Contans进行随机扩增多态性DNA(RAPD)分析(图4)，结果显示本菌株与德国商品化的Contans存在
一定的差异。
[0009]2、噬菌核霉JN-CM于室内自然环境中的培养特征:
[0010]噬菌核霉在温度10°C~30°C，pH3~10范围内生长，最适生长温度和最适产孢温度均为20°C ;最适生长pH6。噬菌核霉孢子在15~25°C范围内萌发，最适萌发温度20°C，湿度对于噬菌核霉孢子萌发的影响较大，当湿度大于95%时，噬菌核霉孢子才能萌发。光照对噬菌核霉的生长和产孢影响不大，但是光照可以促进孢子的成熟和萌发。噬菌核霉JN-CM在光学显微镜及扫描电镜下显示出典型的噬菌核霉的形态特征(图1、图2)。
[0011]3、噬菌核霉JN-CM于不同固体培养基上的生长特点
[0012]卩遼菌核霉JN-CM 在 Potato dextrose agar (PDA) > Biomalt agar (BA) > Biomaltagar+yeast (BAY)以及Czapek-Dox agar (CDA)等不同固体培养基上的生长特点如下:
[0013]
【具体实施方式】
[0014]实施例1:噬菌核霉JN-CM菌株的分离、筛选及鉴定
[0015]采集江苏大丰油菜菌核病发生地5-10cm 土层的土样,利用核盘菌菌核诱捕法分离获得噬菌核霉JN-CM菌株。进一步通过稀释平板方法、核盘菌对峙培养、产孢量测定以及致腐活性测定筛选出产孢能力及致腐活性较高的噬菌核霉JN-CM菌株。通过菌落照片、显微照片、rDNA序列、随机扩增多态性DNA(RAPD)等鉴定方法对该菌株进行了鉴定。菌株于2013年10月12日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为:CGMCC N0.8325。
[0016]实施例2:高产噬菌核霉JN-CM固态发酵
[0017]1、噬菌核霉JN-CM孢子悬浮液的制备:将噬菌核霉JN-CM菌株置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上，与20°C条件下培养6~8天，用无菌水冲洗斜面孢子，利用血球计数法调整分生孢子悬浮液浓度至IO6 / ml，放入4°C冰箱内备用。
[0018]2、二级种子液的制备:取经修饰过的马铃薯葡萄糖培养基(在培养基中加入
0.7%。琼脂)，以I~1.5%的接种量想发酵种子液培养基接种孢子悬浮，于摇床中振荡培养。培养条件:20°C，150r / min，培养6~8天，获得二级菌种。
[0019]3、获得产量高的固体发酵条件:以麸皮为基质，对固体发酵产孢条件进行优化。首先，确定最佳产孢天数为8~11天，添加微量元素营养液含量为70%~80%，经过Plackett-Burman试验设计确定对孢子产量有影响的因子。之后,进行正交试验(如不同碳源、有机无机氮源)选出产孢最优组合。最后,进行Response Surface试验设计,确定添加最有影响因子的最佳含量。实验验证理论与实际的相符性，得到最优产孢量不少于IxIOki个/克干物质。
【专利附图】
【附图说明】:
[0020]图1:噬菌核霉JN-CM菌株的孢子形态[0021 ]图2:噬菌核霉JN-CM菌株的扫描电镜照片
[0022]图3:噬菌核霉JN-CM DNA采用ITSl和ITS4扩增的结果。
[0023]Lanel ~4 :JN-CM ；Lane5:Contans ；Lane6:阴性对照；Lane7: IOObp marker
[0024]图4:噬菌核霉JN-CM不同引物扩增的RAPD指纹图谱。
[0025]Linel ~2:JN-CM ；Line3 ~4:Contans0
【权利要求】
1.一种防治菌核病的生防菌菌株曬菌核霉JN_CM(Coniothyrium minitans),现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为 CGMCC N0.8325。
2.按照权利要求1所述的噬菌核霉菌，其特征是其ITSrDNA基因组由542个碱基组成，序列如下:
CCCCTGGGGGCTCCCCCAGGTGGTAAGGTGAAATACCCTATCGCGCCGCATACCTGCATCCTTTTTTTACGAGCACCTTTCGTTCTCCTTCGGCGGGGCAACCTGCCGCTGGAACCTGATAAACCTTTTTTGCATCTAGTATTACCTGTTCTGATACAAACAATCGTTACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATCTACACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGCGTCTGTCCCGCCTTTGCGCGCGGACTCGCCCCAAACTCATTGGCAGCGGTTTTTGCCTCCTCTCGCGCAGCACAATTGCGTCTGCGAGGGGGCGTGGCCCGCGTCCACGAAGCAACATTACCGTCTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATAATTAAAGCGGAGGAA·
【文档编号】C12R1/645GK103710269SQ201310692663
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】朱瑞宇, 雷楗勇, 金坚, 夏森玉, 陈蕴, 沈志松, 徐梦龙, 李红 申请人:无锡楗农生物科技有限公司