专利名称：用于预防和治疗败血症的方法与组合物的制作方法
技术领域：
本发明概言之涉及用于预防和治疗败血症的方法和组合物，且具体而言，本发明涉及补体抑制剂和CD14途径抑制剂的组合在预防或治疗败血症中的用途。
背景技术：
补体免疫系统可保护身体免受病原细菌、病毒、寄生虫和其他有害生物体的侵害。免疫系统分为两个部分体液系统和细胞系统。一般而言，体液系统包括补体系统和可防御病原体的抗体的产生。补体系统或简言为补体涉及可协助抗体进行宿主防御的蛋白质的产生。补体是包括至少30个表面结合可溶蛋白的一组蛋白。通过在56℃下加热血清30分钟会破坏某些可溶蛋白的活性。补体蛋白参与用于吞噬作用的微生物调理作用、通过裂解来直接杀灭微生物、白细胞对于炎症位点的趋化吸引、白细胞的激活和免疫复合体的加工。
补体蛋白可在一连锁反应中发挥作用，其中一蛋白质的结合可促进该连锁反应中下一蛋白质的结合。连锁反应的激活会引起释放可促成炎症反应的被称作过敏毒素(C3a、C4a及最有效的C5a)的生物活性小肽，并最终形成一可裂解靶细胞的膜攻击复合体(C5b-9或MAC)。不同的补体分子可由不同细胞类型合成，例如，成纤维细胞和肠上皮细胞可生成C1，而大部分组成是在肝中合成。
补体系统的组成和机制已为人们所熟知。基本上，存在三个补体途径传统途径、凝集素途径和旁路途径。传统途径主要由含有抗原和IgG或IgM的免疫复合体触发，但也可由例如C-反应性蛋白等其他作用剂触发。凝集素途径通过甘露糖结合凝集素(MBL)或纤维胶凝蛋白结合到异质表面上的碳水化合物结构(例如，甘露聚糖)上来触发。旁路途径主要由重复多糖和其他聚合体结构(诸如发现于细菌上的那些聚合体结构)来触发。
当C1q(C1qrs复合体的一部分)的球形结构域结合到IgM或多个IgG分子的Fc片段上时，传统途径得到激活。在钙离子存在下，此结合会引起两个C1r分子的自身催化激活。C1r分子可激活两个C1s分子。C1s是一可使C4a自C4b解离的丝氨酸蛋白酶。C4b立即结合到靶细胞表面上的邻近蛋白质或碳水化合物上，且随后在镁离子存在下结合到C2上。C1s可使C2b从此复合体上解离下来，生成传统途径的C3转化酶，C4b2a。C3转化酶可使许多C3分子解离成C3a和C3b。一些C3b分子返回结合到C4b2a上以生成传统途径的C5转化酶，C4b2a3b。C5转化酶可将C5解离成C5a和C5b。C5b可结合至细胞表面从而引发MAC的形成。
C3a、C4a和C5a皆是过敏毒素。C3a和C5a也是化学吸引剂。C3a和C5a具有结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞的能力。C5a也是一嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨嗜细胞的有效激活剂并可引起对血管内皮细胞上的黏附分子的诱导。C5a也可下调嗜中性粒细胞和单核细胞。当C3a和C5a将其受体结合到肥大细胞与嗜碱性粒细胞上时，这些细胞会向血液和组织中释放组胺及其他高活性肽。这些肽可增加血管壁的渗透性以使嗜中性粒细胞迁移至所述区域中。嗜中性粒细胞可进一步因C5a的有效趋化(吸引剂)作用受到激励而迁移至补体激活位点。嗜中性粒细胞可吞噬入侵的病原体，且也可释放能够将巨噬细胞吸引到感染位点的介质。这些细胞还能够吞噬入侵细胞并进一步促发炎症反应及有效消除大量感染微生物。
“凝集素途径”除了由结合到细菌表面末端甘露糖基团的钙相依凝集素MBL引发外皆与传统途径类似。MBL类似于C1q。当MBL结合到其靶标上时，其会释放并因此激活已知为MASP1、MASP2和MASP3(与甘露聚糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶)的三个相关丝氨酸蛋白酶，其类似于C1r和C1s。其中，MASP2在使C4解离成C4b和C4a及使C2解离成C2b和C2a的过程中发挥重要作用。C4和C2激活之后，凝集素途径与传统途径相同。
旁路补体途径涉及一利用由传统途径产生的C3b的放大环路。一些由传统途径C3转化酶生成的C3b分子集中到旁路途径中。表面结合的C3b可结合B因子以生成C3bB，C3bB可成为D因子的底物。D因子是一可解离Ba片段的丝氨酸蛋白酶，其中C3bBb仍结合至靶细胞表面上。C3bBb通过备解素(P)得到稳定，形成可作为旁路途径C3转化酶的复合体C3bBbP。同传统途径中一样，此C3转化酶参与一放大环路以解离许多C3分子，从而引起C3b分子在靶细胞上的沉积。一些此等C3b分子返回结合到C3bBb上从而形成C3bBb3b，即旁路途径C5转化酶。C5转化酶可将C5解离成C5a和C5b。C5b结合到细胞表面以引发膜攻击复合体的形成。
传统、凝集素和旁路途径皆随着C5转化酶的形成而结束。C5转化酶可经由裂解途径引起MAC的组装。组分C5至C8以串联形式相互连接，并促进一或多个C9单体插入至靶细胞的脂双层中。此插入会导致可引起钙流入的孔的形成及随后的有核细胞的细胞激活或者如果攻击足够强会引起细胞解离及死亡。
CD14途径CD14是一53kD的经糖磷脂酰肌醇(PI)连接的糖蛋白并可作为单核细胞、巨噬细胞和粒细胞表面上的高亲和性内毒素(LPS)受体来发挥作用。由于CD14是一经GPI连接的蛋白质，因此其不具有可传递信号的跨膜或细胞内部分。CD14也可以可溶形式存在于人类血清和其他体液中。可溶CD14(sCD14)可直接分泌或衍生自膜结合分子的蛋白酶相依性排毒。sCD14会与膜结合CD14(mCD14)竞争结合LPS，并能够中和LPS诱发的活体外和活体内反应。sCD14可调介由LPS诱发的不表达CD14的内皮、表皮和平滑肌细胞的激活。LBP(脂多糖结合蛋白)是一58kD急性期糖蛋白并可以高亲和性结合到LPS的脂质A部分，并可催化LPS导致的CD14相依性细胞激活。MD2是一分泌型附属蛋白，其很可能通过稳定TLR4二聚体来结合toll样受体TLR4的胞外结构域并可促进LPS反应性。CD14/MD2/TLR4复合体似乎是分离自大部分革兰氏阴性生物体的LPS的主要且可能是唯一的受体。
已知CD14途径在预防和治疗败血症方面起重要作用，且已知抗CD14抗体可通过CD14途径减轻败血症，例如，Leturcq DJ，J Clin Invest 1996 Oct1；98(7)1533-8和美国专利第6,495,332号与第6,297,049号中所述。CD14途径包括若干步骤。一般而言，来自革兰氏阴性细菌外膜的LPS可通过与血浆中LPS结合蛋白(LBP)形成一复合体来启动所述途径的顺序。所述LPS-LBP复合体可将LPS单体传递给吞噬细胞细胞膜中的CD14。CD14和MD2可促进LPS与可向细胞内传导信号的TLR4的结合。LPS与TLR4的结合可将衔接分子MyD88募集到受体胞质结构域上，且随后MyD88可结合至肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)。TRAF6可结合丝氨酸-苏氨酸激酶IRAK。据信，TRAF6/IRAK复合体可激活NFκB激酶(NIK)两个亚基的磷酸化，并使其形成异二聚体——IκB激酶(IKK)。随后IKK二聚体使IκB磷酸化并使其从NFκB上解离下来。随后NFκB可迁移至细胞核中、结合至DNA上并激活编码炎症介质的基因的转录。
败血症败血症是一种其特征为对感染产生强烈全身性炎症反应的疾病。细菌性败血症是一种由血液中具侵害性细菌感染引起的复杂的全身性炎性综合症。败血症可在人类和其他动物中引起高发病率和死亡率。在美国，败血症是造成人类医院死亡(尤其在重症监护室中)和幼畜及其他动物感染死亡的主要原因。每年均可在人类中诊断出超过700,000的败血症新病例。外推至全球群体，这表明每年全世界范围有数百万例严重败血症。死亡率在自约20至30％范围内，且表明每年美国至少有150,000例死亡。
败血症可归因于许多原因，但通常由诸如肺炎、外伤、外科手术和烧伤等事件或由诸如癌症或AIDS等病症引发。败血症开始时通常伴有颤抖、发烧、血压下降(败血性休克)、呼吸急促、心率加快和皮肤损伤。数小时内，败血症可在血管内引发自发凝血、严重低血压、多器官衰竭、休克并最终导致死亡。通常，这些症状由宿主防御机制(诸如细胞因子、白细胞和补体)的过度或不受控激活所致。
败血症通常由细菌感染(革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌)引起但也可由其他病原体(诸如真菌、病毒和寄生虫)和非感染性刺激(诸如超级抗原)所引起。然而败血症最常由革兰氏阴性细菌感染引起。然而，可归因于败血症的损伤和症状不仅可由细菌引起也可由已知为内毒素或脂多糖(LPS)的细菌细胞壁组分所引起。LPS分子是普遍存在于所有革兰氏阴性细菌外膜中的糖脂。虽然已知的LPS分子化学结构是复杂并多样化的，但其共同特征是具有脂质A区。对高度保守的脂质A LPS区的识别可引发许多(如果不是全部的话)可导致败血症的事件。当免疫系统摧毁入侵细菌时会释放LPS。释放的LPS可结合单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞，并触发诸如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素(IL-1、IL-6及IL-8)等各种介质的生成。TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8的过度生成是败血症的主要原因。
用于治疗败血症的已知方法包括抗菌剂、抗体、小分子及肽、蛋白质C、使用氧气的辅助疗法、静脉输液和可提高血压的药物。例如，美国专利申请案第20030021783号中揭示使用抗IL-8抗体来治疗败血症；美国专利申请案第20030008822号中揭示使用抗IL-18抗体来治疗败血症；美国专利申请案第20020165138号中揭示在动物中使用抗C5a抗体和C-末端经平截的C5a肽来预防和治疗败血症；美国专利申请案第20020155094号中揭示使用趋化因子及趋化因子片段来治疗败血症；美国专利申请案第20020044929号中揭示使用蛋白质C和BPI蛋白质的组合来治疗败血症；美国专利申请案第20020034509号中揭示使用抗CD14抗体来治疗败血症；以及美国专利申请案第20020006915号中揭示使用COX-2抑制剂来治疗败血症。同样，美国专利第6,534,648号中揭示使用海藻脂多糖来抗击败血症；美国专利第6,495,332号和第6,297,049号中揭示使用抗CD14抗体来治疗败血症；美国专利第6,489,296号中揭示使用蛋白质C来降低患有严重败血症的人类患者中的死亡率；美国专利第6,344,197号中揭示使用组合蛋白质C和BPI的协同组合疗法来治疗败血症。所述专利并未揭示使用来自补体和CD14途径二者的化合物组合；美国专利第6,315,999号揭示使用一针对肿瘤坏死因子-α的抗体(抗TNFα)及一针对细菌脂多糖的抗体(抗LPS)共同来治疗败血症。所述专利并未揭示使用来自补体和CD14途径二者的化合物组合，美国专利第6,063,764号揭示一种使用脂蛋白相关凝血抑制剂进行败血症或败血性休克的预防性或治疗性治疗的方法；美国专利第6,042,821号中揭示一种使用趋化因子来预防和治疗败血症的方法；美国专利第5,354,771号中揭示一种使用支链氨基酸的酮类似物治疗败血症的方法，以及美国专利第5,093,117号中揭示可用来治疗或预防败血症的医药组合物，其包括针对革兰氏阴性细菌的多克隆免疫球蛋白和一血液凝块溶解有效量的蛋白质C。
然而，尽管过去数十年间已在严重感染的治疗中取得重大进展，但败血症发病率和归因于败血症的死亡率仍持续增长。因此，需要新方法和组合物来预防和治疗败血症。
发明内容
因此，本发明的一目的是提供用于预防和治疗败血症的方法与组合物。
本发明的另一目的是降低由败血症引起的发病率和死亡率。
本发明的又一目的是提供一种可用于预防和治疗败血症的试剂盒。
使用一种用于预防或治疗败血症的新颖方法可达成这些及其他目的，所述方法包括向一可能形成或正患有败血症的患者联合施用一败血症预防或治疗量的补体抑制剂和一败血症预防或治疗量的CD14途径抑制剂。所述补体抑制剂可以是任何已知的补体抑制剂，但较佳是一可结合至并抑制补体组分的抗体或其功能等效片段。所述CD14途径抑制剂可以是任何已知的CD14途径抑制剂，但较佳是一可结合至并抑制CD14的抗体或其功能等效片段。
所属技术领域的技术人员将易知本发明的其它及进一步的目的、特征及优点。
具体实施例方式
定义术语“患者”表示一可能形成或正患有败血症的人类或其他动物，包括牛、猪、犬、猫、马、禽和羊等动物。较佳地，所述患者是人类。
术语“联合”表示大约同时向一患者施用补体抑制剂和CD14途径抑制剂(1)分别使用相同或不同施用途径以相同或不同频率来施用，或(2)共同以一医药上可接受的组合物形式施用，或(3)共同作为一双特异性抗体或其片段的一部分施用，尤其是那些具有一个补体组分结合位点和另一个CD14途径组分结合位点的双特异性抗体。“大约同时”通常表示所述抑制剂可同时或彼此间隔约72小时内施用。
术语“非经肠地”表示经静脉内、皮下、肌内或腹腔内注射施用。
术语“功能等效片段”表示能够以与完整抗体实质相同的方式结合至补体系统或CD14途径组分上并抑制补体激活或CD14途径功能的抗体片段。
术语“拮抗剂”表示任何可阻断、防止、抑制或中和一补体组分或CD14途径组分正常功能的分子。一类拮抗剂是可干扰CD14与其LPS配体间相互作用的分子，包括抗体或抗体片段。
本发明并不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些皆会发生改变。此外，本文所用术语仅用于阐述具体实施例的目的而不拟对本发明范畴加以限定。除非上下文中另有明确说明，否则，本文和随附权利要求书中所用的单数形式“一”、“一个”和“所述”皆包括其复数指代，例如，当提及“一宿主细胞”时包括复数个所述宿主细胞。
除非另有定义，否则，本文所用的所有技术和科学术语以及任何简称皆具有熟习本发明领域的普通技术者所普遍理解的相同含义。本文阐述了较佳的方法、装置和材料，但亦可使用任何与本文所述者相似或等效的方法和材料来实施本发明。
本文提及的所有专利案及公开案皆在法律允许的范围内以引用方式并入本文中，以便于阐述并揭示其中报告的可用于本发明的化合物和方法。然而，不应将本文所述理解为认可本发明无权早于先前发明所揭示的此等揭示内容。
本发明一方面，本发明提供一种用于预防和治疗败血症的方法。所述方法包括联合向一患者施用一或多种败血症预防或治疗量的补体抑制剂和一或多种败血症预防或治疗量的CD14途径抑制剂。本发明基于下述新颖发现，即免疫系统补体组分和CD14途径二者在败血症形成过程中发挥重要作用以及用来抑制或防止补体激活的方法和组合物必须与用来抑制CD14途径的方法和组合物联合使用从而有效预防或治疗败血症。单独使用补体抑制剂或CD14途径抑制剂不会有效预防或治疗所述疾病。所述方法和组合物可用于降低易患或正患有败血症的患者的发病率和死亡率。
本发明补体抑制剂是已知可于一患者中抑制补体激活的任何分子。一般而言，补体抑制剂是有机小分子、肽、蛋白质、抗体、抗体片段或可作为补体抑制剂发挥作用的其他分子。可用补体抑制剂包括补体抑制素及其功能类似物(可抑制C3)、C1q抑制剂、C1抑制剂(可共价结合C1r和C1s)、C1r抑制剂(可结合并抑制C1r)、C1s抑制剂(可结合并抑制C1s)、sCR1及其类似物(可解离所有C3转化酶)、抗C5抗体(可阻断C5激活)、抗C5a和抗C5a受体的抗体及小分子药物(可抑制C5a信号传导途径)、抗C3a和抗C3a受体的抗体及小分子药物(可抑制C3a信号传导途径)、抗C6、7、8或9抗体(可抑制MAC的形成或功能)、抗D因子抗体(可抑制D因子与B因子的解离)、抗备解素抗体(使旁路途径中的C3和C5转化酶去稳定)、膜辅因子蛋白(MCP)(I因子调介的C3b和C4b解离的辅因子)、衰变加速因子(DAF)(加速所有C3转化酶的衰变)和MCP-DAF融合蛋白(CAB-2)。其他可用抑制剂包括C4bp(可加速传统途径C3转化酶(C4b2a)的衰变)、H因子(可加速旁路途径C3转化酶(C3bBb)的衰变)、I因子(可以蛋白水解万式使C4b和C3b解离并失活(需要辅因子))、羧肽酶N(从C3a、C4a及C5a上去除末端精氨酸残基)、玻璃粘连蛋白(S蛋白)和群集素(可结合C5b-7复合体并可防止膜插入)以及CD59(可抑制旁观者细胞的裂解)。
较佳地，所述补体抑制剂是可结合至或抑制一或多种在补体连锁反应中发挥作用的蛋白质(例如C1、C2、C4、C3、C3a、C5、C5a、D因子、B因子、备解素、MBL或其组分、MASP或其组分、蛋白酶解离产物和受体)的抗体或其功能等效片段。当一患者处于形成败血症的风险中时所述抗体可结合至该补体连锁反应中的所选补体蛋白质且可抑制或防止补体激活。在一实施例中，所述补体抑制剂是一可结合到C5上并在补体连锁反应中抑制C5a和C5b形成的抗C5抗体或其功能等效片段。所述抗体还可以是一可结合到这些蛋白质上并抑制其在补体连锁反应中的作用的抗C5a或抗C5b抗体。所述补体抑制剂最佳是一可结合到C5a上并抑制其在补体连锁反应中的作用的抗C5a抗体或其功能等效片段。所述抗体可以是多克隆或单克隆抗体，但较佳是单克隆抗体。
在该较佳实施例中，补体抑制剂是可抑制补体连锁反应中过敏毒素(尤其为C5a)的化合物。所述抑制剂包括抗C3a抗体及其功能等效片段、抗C4a抗体及其功能等效片段和抗C5a抗体及其功能等效片段。
在另一实施例中，补体抑制剂是C5a受体拮抗剂。这些拮抗剂会干扰C5a与其受体间的相互作用并抑制补体途径功能。C5a受体拮抗剂包括但不限于F-[oPdChaWR](Haynes DR 等人，Biochem Pharmacol 2000；60729-33；Huber-Lang MS等人，FASEB J 2002；161567-74)和那些于WO0249993A2和WO0249993A3中阐述者。
本发明CD14途径抑制剂是已知可在一患者中抑制CD14途径的任何分子。一般而言，CD14途径抑制剂是有机小分子、肽、蛋白质、抗体、抗体片段或可作为CD14途径抑制剂发挥作用的其他分子。可用CD14途径抑制剂包括可干扰CD14途径功能和炎症介质编码基因转录的CD14途径拮抗剂。所述抑制剂包括但不限于可抑制CD14途径组分作用的抗CD14途径组分抗体(诸如抗CD14抗体和抗LPS抗体)、可结合至LPS并干扰其结合至CD14的LPS拮抗剂、可结合至LBP并干扰其将LPS转移至CD14的能力的LBP拮抗剂、可干扰CD14产生的CD14反义核苷酸、可干扰CD14产生的CD14 siRNA以及可干扰CD14产生的CD14 RNAi。
在一实施例中，CD14途径抑制剂是可结合至并抑制一或多种在CD14途径中发挥作用的蛋白质(例如，LPS、脂多糖结合蛋白质(LBP)、CD14、TLR4和MD2(对于革兰氏阴性败血症)及CD14、TLR2和TLR6(对于革兰氏阳性败血症))的抗体或其功能等效片段。抗CD14中和单克隆抗体包括但不限于由Tasaka SI(Am J Respir Cell Mol Biol；2003 Mar 14，在印刷之前在线公布)阐述的抗体4C1和由Axtelle T(J Endotoxin Res 2001；7310-4)阐述的抗体IC14。所述抗体可结合至该途径中一所选蛋白质并抑制或防止可导致产生不期望细胞因子的膜信号传导和基因激活。较佳地，所述抗体选自由抗LPS抗体、抗LPB抗体、抗CD14抗体、抗TLR4抗体、抗MD2抗体、抗TLR2抗体、抗TLR6抗体及其功能等效片段所组成的群组。最佳地，所述CD14途径抑制剂是一可结合至CD14并抑制膜信号传导和细胞因子基因激活的抗CD14抗体或其功能等效片段，或一可结合至LPS并防止LPS结合CD14的抗LPS抗体。所述抗体可以是一多克隆或单克隆抗体，但较佳是单克隆抗体。
在另一实施例中，所述CD14途径抑制剂是在抗CD14抗体恒定区、较佳在CH2和CH3区且最佳在Fc区中具有氨基酸序列改变的抗CD14抗体。这些“变体”抗CD14抗体的氨基酸序列中有一或多个氨基酸不同于其天然对应物，包括修饰、取代、插入和删除。这些变体具有可改变抗体Fc区效应器功能(例如，结合补体、结合到巨噬细胞和单核细胞上的细胞受体，及诸如此类)的经改变氨基酸序列。较佳地，所述变体抗体具有降低的结合Fc受体及/或激活补体的能力。
所属技术领域的技术人员已熟知用于产生抗体(包括多克隆抗体、单克隆抗体、单价抗体、人源化抗体、人类抗体、双特异性抗体和杂共轭抗体)及其功能等效片段的方法。
多克隆抗体可在一哺乳动物中通过单独注射一免疫原或注射一免疫原与一佐剂的组合来产生多克隆抗体。通常，使用一或多次皮下或腹腔内注射将免疫原注射于所述哺乳动物中。免疫原可包括感兴趣的多肽或一包含所述多肽和另一已知可在所述接受免疫的哺乳动物中产生免疫作用的多肽的融合蛋白。所述免疫原也可包括表达一重组受体或表达一含有所述受体基因的DNA表达载体的细胞。所述免疫原蛋白的实例包括但不限于钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。佐剂实例包括但不限于弗氏(Freund′s)完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A、合成的海藻糖二棒分枝菌酸酯)。所属技术领域的技术人员无需进行过多实验即可选择出免疫方案。
单克隆抗体使用杂交瘤方法(例如，Kohler和Milstein阐述于Nature，256495(1975)中的那些方法)可产生单克隆抗体。在一杂交瘤方法中，使用一免疫原免疫一小鼠、大鼠或其他适宜宿主哺乳动物来诱发出可产生或能够产生特异性结合于所述免疫原上的抗体的淋巴细胞。或者，可在活体外对淋巴细胞进行免疫。免疫原通常包括感兴趣的多肽或一含这种多肽的融合蛋白。一般而言，如果需要人类来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)。如果需要非人类哺乳动物来源的细胞，则使用脾细胞或淋巴结细胞。随后使用一适宜融合剂(例如，聚乙二醇)使淋巴细胞与一永久细胞系融合，以形成一杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，第59页-第103页(Academic Press，1986))。永久细胞系通常是经转化的哺乳动物细胞，尤其为啮齿类动物、牛或人类的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在一适宜培养基中培养，该培养基中较佳包含一或多种可抑制未融合永久细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，则用于所述杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)。所述HAT培养基可防止HGPRT缺陷细胞的生长。
较佳的永久细胞系是那些可有效融合、支持所选抗体产生细胞对抗体的稳定高水平表达且对诸如HAT培养基等培养基敏感的细胞系。更佳的永久细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，诸如那些可从沙克学院细胞分配中心(Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，Calif.USA)购得的衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系，和可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Rockville，Md.USA.)获得的SP2/0或X63-Ag8-653细胞。有人也已阐述了可使用人类骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系来产生人类单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，第51页-第63页(Marcel Dekker公司，New York，1987))。也可使用小鼠骨髓瘤细胞系NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures，Salisbury，Wiltshire UK)。另外，也可使用业内熟知的人类骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系来产生人类单克隆抗体。
然后，可分析用于培养杂交瘤细胞的培养基是否存在针对感兴趣多肽的单克隆抗体。较佳地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或通过活体外结合分析(例如，放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA))来测定。这些技术和分析为业内熟知。例如，单克隆抗体的结合亲和力可通过Munson和Pollard，Anal.Biochem.，107220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴别所需杂交瘤细胞后，所述细胞纯系可通过有限稀释法来进一步亚克隆并可通过标准方法使其生长。适用于此目的的适宜培养基包括杜贝克氏改良鹰氏培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可在诸如一哺乳动物体内的腹水中于活体内生长。
亚克隆细胞系所分泌的单克隆抗体可通过常规的免疫球蛋白纯化方法(诸如蛋白质G-琼脂糖凝胶、蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析法、凝胶电泳、透析或亲和层析法)自培养基或腹水液体中进行分离或纯化。
单克隆抗体也可通过重组DNA方法来产生，例如，美国专利第4,816,567号中所述的方法。编码本发明的单克隆抗体的DNA易于使用常规方法分离和测序，例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针(Innis M.等人，″PCR Protocols.A Guide to Methods and Apd Appcations″，Academic，San Diego，CA(1990)；Sanger，F.S等人，Proc.Nat.Acad.Sci.745463-5467(1977))。本文所述的杂交瘤细胞可作为这种DNA的较佳来源。一旦得到分离，就可将所述DNA置于表达载体中。然后，将该等载体转染至不会以其他方式产生免疫球蛋白的宿主细胞中，例如，猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。所述重组宿主细胞可用于产生所需的单克隆抗体。也可通过(例如)用人类重链及轻链恒定结构域的编码序列来代替同源鼠类序列，或通过将免疫球蛋白编码序列共价结合于一非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列，来对DNA进行修饰。此一非免疫球蛋白多肽可替代一抗体的恒定结构域，或可替代一抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生一嵌合双价抗体。
单价抗体可使用免疫球蛋白轻链和经修饰重链的重组表达来产生。一般而言，可在Fc区域的任何一点将重链切断，以防止重链交联。或者，以另一氨基酸残基来替代相关的半胱氨酸残基或删除相关的半胱氨酸残基以防止交联。同样，亦可使用活体外方法来产生单价抗体。可使用已知方法利用抗体消化来产生抗体片段，较佳为Fab片段。
抗体及抗体片段可使用采用McCafferty等人在Nature 348552-554(1990)中阐述的技术生成的抗体噬菌体文库产生。Clackson等人及Marks等人分别在Nature 352624-628(1991)中和J.Mol.Biol.222581-597(1991)中阐述了使用噬菌体文库进行鼠类及人类抗体的分离。随后的出版物阐述了通过链改组(Marks等人，Bio/Technology 10779-783(1992))以及作为一用于构建相当大的噬菌体文库的策略的组合感染和活体内重组(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.212265-2266(1993))来产生高亲和性(nM范围)人类抗体。因此，这些技术相对于用来分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术而言是更具优势的替代方案。此外，也可通过(例如)用人类重链及轻链恒定结构域的编码序列来替代同源鼠类序列(美国专利第4,816,567号；Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 816851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列共价结合于一非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列，来对DNA进行修饰。通常，这些非免疫球蛋白多肽可替代一抗体的恒定结构域，或其可替代一抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生一嵌合双价抗体，所述双价抗体包括一个对一抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对一不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
也可使用电融合而非化学融合的方法来形成杂交瘤进而产生抗体。这种技术已得到良好发展。人们也可不采用融合而使用(例如)EB病毒或转化基因来转化B-细胞以使其成为永久细胞(“Continuously Proliferating Human Cell LinesSynthesizing Antibody of Predetermined Specificity，”Zurawaki，V.R.等人，于Kennett R.H.等人编辑的“Monoclonal Antibodies，”Plenum Press，N.Y.1980，第19页-第33页中)。
人源化抗体人源化抗体可使用Winter in Jones等人在Nature，321522-525(1986)中、Riechmann等人在Nature，332323-327(1988)中以及Verhoeyen等人在Science，2391534-1536(1988)中所述的方法来产生。人源化过程通过以啮齿类互补决定区(“CDR”)或CDR序列来代替相应的人类抗体序列来完成。一般而言，一人源化抗体具有从一非人类来源引入其内的一或多个氨基酸。这些“人源化”抗体为嵌合抗体，其中，实质上少于一个完好人类可变结构域的部分已由来自一非人类物种的相应序列替代。实际上，人源化抗体通常为人类抗体，其中某些CDR残基及可能某些构架(“FR”)残基被来自啮齿类动物抗体中类似位点的残基取代。非人类(例如，鼠类或牛类)抗体的人源化形式可为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2等免疫球蛋白片段、或含衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列的抗体的其它抗原结合子序列。人源化抗体包括人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自所述受体的一互补决定区域(CDR)的残基由来自一诸如小鼠、大鼠或兔等非人类物种(供体抗体)的CDR且具有期望特异性、亲和性及能力的残基所替代。有时，人类免疫球蛋白的Fv骨架残基由对应的非人类残基所替代。人源化抗体也包含既未见于受体抗体亦未见于引入CDR或骨架序列中的残基。一般而言，人源化抗体包含至少一个且通常为两个可变结构域的实质全部部分，其中CDR区域的全部或实质全部部分对应于一非人类免疫球蛋白的那些部分，且FR区域的全部或实质全部部分为一人类免疫球蛋白一致序列的那些部分。人源化抗体最优至少包括一免疫球蛋白恒定区域(Fc)(通常为一人类免疫球蛋白恒定区域)的一部分。
人类抗体人类抗体可使用业内已知的各种技术来产生，例如，Hoogenboom和Winter在J.Mo1.Bio1.，227381(1991)中及Marks等人在J.Mol.Biol.，222581(1991)中所阐述的噬菌体展示文库。人类单克隆抗体可使用Cole等人在MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)中及Boemer等人在J.Immunol.，147(1)86-95(1991)中阐述的技术来产生。或者，可使用在免疫后可于不产生内源免疫球蛋白的情况下产生整组人类抗体的转基因动物(例如，小鼠)。这些转基因小鼠可自Abgenix公司(Fremont，California)及Medarex公司(Annandale，New Jersey)购得。有人曾阐述，嵌合和种系突变小鼠中抗体重链结合区域(JH)基因的纯合缺失会引起对内源抗体产生的完全抑制。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转入这些种系突变小鼠中可在受到抗原攻击后引起人类抗体的产生。参见(例如)Jakobovits等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551(1993)中、Jakobovits等人在Nature 362255-258(1993)中、Bruggermann等人在Year in Immunol.733(1993)中以及Duchosal等人在Nature355258(1992)中的阐述。人类抗体也可衍生自噬菌体展示文库(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.227381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597(1991)；Vaughan等人，Nature Biotech 14309(1996))。
双特异性抗体双特异性抗体可由两个免疫球蛋白重链/轻链对的重组共表达产生，其中所述两个重链具有不同的特异性。双特异性抗体是单克隆抗体，较佳为对至少两种不同抗原具有结合特异性的人类或人源化抗体。在本发明中，一种结合特异性是针对补体组分的结合特异性，而另一种结合特异性是针对CD14途径组分的结合特异性。一般而言，本发明的补体抑制剂是一双特异性抗体上的一抗补体组分结合位点，而本发明的CD14途径抑制剂是一双特异性抗体上的一抗CD14组分结合位点。较佳地，双特异性抗体具有一种对C5a的结合特异性及另一种对CD14的结合特异性，但多种其他组合也涵盖作为本发明的一部分。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，因此，这些杂交瘤会产生一由10种不同抗体构成的潜在混合物。然而，这些抗体中仅有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的回收和纯化通常通过亲和层析法来完成。
具有期望结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)可融合到免疫球蛋白恒定结构域序列中。所述融合体较佳具有一包含铰合区域、CH2区域和CH3区域中至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域。较佳地，至少所述融合体之一中具有包含轻链结合所需位点的第一重链恒定区域(CHI)。将编码免疫球蛋白重链及(若需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入到单独表达载体中，并共转染至一适宜宿主生物体中。Suresh等人在Methods in Enzymology，121210(1986)中阐述了用于产生双特异性抗体的适宜技术。
杂共轭抗体杂共轭抗体可使用已知的蛋白融合方法(例如，通过将一抗体的胺基偶接至另一抗体或其他多肽的一硫醇基上)来产生。若需要，可使用已知方法引入一硫醇基。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成一硫醚键来产生包含一抗体或抗体片段和一多肽毒素的免疫毒素。适用于此目的的适宜试剂实例包括亚胺基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚胺酯(mercaptobutyrimidate)。这些抗体可用来靶向免疫补体组分并用来预防或治疗败血症。
可通过能够使抑制剂到达靶细胞的任何方法将补体抑制剂和CDl4途径抑制剂施用给患者。这些方法包括但不限于经口、直肠、经鼻、外敷、皮内、皮下、静脉内、肌内、气管内和腹腔内施用方式。在一实施例中，可通过将抑制剂直接置于肺中(通常通过吸入或气管滴注)来施用所述抑制剂。较佳采用非经肠注射，这是由于非经肠注射可允许精确控制投药所用时间和剂量水平。对于非经肠施用而言，可将补体抑制剂与一生理上可接受的非经肠媒剂一起调配成(例如)溶液、悬浮液、乳剂或冻干粉剂。这些媒剂的实例为水、盐水、林格氏(Ringer’s)溶液、葡萄糖溶液和5％人体血清白蛋白。也可使用脂质体和诸如固定油等非水性媒剂。媒剂或冻干粉剂可包含维持等渗性的添加剂(例如，氯化钠、甘露醇)和维持化学稳定性的添加剂(例如，缓冲剂和防腐剂)。所述调配物可使用常用技术灭菌。例如，通过将1.5重量％的有效成分溶于0.9％的氯化钠溶液中可制备一适于经注射施用的非经肠组合物。
另一方面，本发明提供一种可用来预防和治疗败血症的组合物，所述组合物包括一或多种补体抑制剂、一或多种CDl4途径抑制剂，且较佳还包括一或多种医药上可接受的佐剂、载剂、赋形剂及/或稀释剂。用于制造医药组合物的可接受佐剂、载剂、赋形剂及/或稀释剂为所属技术领域的技术人员所熟知，例如，Hoover，John E.，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing公司，Easton，Pennsylvania 1975。药物调配物的另一论述可参见Liberman，H.A.和Lachman，L.编辑的Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980。最佳地，所述抑制剂与医药上可接受的载剂混合以形成一可使得剂量制备和施用容易进行的组合物。由不含非挥发性致热原的水、无菌水以及抑菌水制备而成且含至少0.025M诸如磷酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠等缓冲盐的水性媒剂也适合于形成可注射的补体抑制剂溶液。除了这些缓冲液外，也可使用若干其他水性媒剂。这些水性媒剂包括能够灭菌的等渗注射组合物，诸如氯化钠、林格氏溶液、葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、以及乳酸林格氏溶液。添加诸如甲醇、乙醇或丙二醇等与水混溶的溶剂通常会增加所述抑制剂在这些媒剂中的溶解度和稳定性。此外，亦可采用诸如棉籽油、芝麻油或花生油和酯类(例如，肉豆蔻酸异丙酯)等非水性媒剂作为所述抑制剂的悬浮媒剂。另外，还可添加各种能够增强组合物的稳定性、无菌性和等渗性的添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂以及缓冲剂。然而，所用的任何媒剂、稀释剂或添加剂皆必须具有生物相容性并可与本发明的抑制剂相容。
当补体抑制剂或CD14途径抑制剂是抗体或抗体片段时，所述调配物是任何已知适合用于向患者施用抗体的调配物，例如，诸如于美国专利申请案第20020136719号中所揭示的那些固体抗体调配物、诸如于美国专利第6,267,958号中所揭示的那些重构成冻干调配物、或诸如于美国专利第6,171,586号中所揭示的水性调配物。
施用给患者的补体抑制剂或CD14途径抑制剂的数量或剂量根据患者类型、患者年龄、患者个头、抑制剂类型、治疗频率、施用目的(治疗或预防)以及败血症严重程度而有所变化。一般而言，补体抑制剂按每天每公斤体重约1至50毫克的剂量(mg/kg)施用给患者，较佳约5至30mg/kg/天。当通过吸入或气管滴注施用时，补体抑制剂按约0.5至20mg/kg的剂量每天2次施用给患者。一般而言，CD14途径抑制剂按每天每公斤体重约10至200毫克的剂量(mg/kg)施用给患者，较佳约25至100mg/kg/天。当通过吸入或气管滴注施用时，CD14途径抑制剂按约1至40mg/kg的剂量每天2次施用给患者。所述补体抑制剂可按一次剂量施用，或可将该剂量分成较小剂量以更频繁的频次施用。
在一较佳实施例中，每天向患者施用抗C5a抗体和抗CD14抗体的混合物(含约25mg/kg抗C5a抗体和约40mg/kg抗CD14抗体)以预防或治疗败血症。同样，此混合物可包含约40mg/kg抗LPS抗体来代替抗CD14抗体。
由于补体抑制剂和CD14途径抑制剂可分开施用，因此本发明另一方面还提供一种用于向患者施用败血症预防或治疗用组合物的呈试剂盒形式的制造物件，其包括置于单独容器中呈单一包装形式的补体抑制剂和CD14途径抑制剂。所述试剂盒包含当施用给患者时足以提供约25mg/kg/天补体抑制剂的补体抑制剂量和足以提供约40mg/kg/天CD14途径抑制剂的CD14途径抑制剂量。
实例可通过本发明较佳实施例的下述实例来进一步阐明本发明，但应了解，除非特别说明，否则，提供这些实例仅为阐明目的而并非意欲限制本发明范围。
材料与方法设备根据制造商提供的信息，所有使用的设备和溶液均无内毒素。使用聚丙烯管以得到补体的低背景激活。
试剂无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)从Life Technologies(Paisley，UK)购得，Lepirudin(Refludan)从Hoechst(Frankfurt am Main，Germany)购得。经调理的大肠杆菌(1×109个细菌/mL)从ORPEGEN Pharma(Heidelberg，Germany)购得；当使用鲎鱼阿米巴状细胞裂解物分析(limulus amebocyte lysateassay)进行分析时，大肠杆菌悬浮液中内毒素总浓度是7μg/mL。小鼠抗人类C5/C5a mAb 137-26(纯化的IgGl)由Tanox公司(Houston，TX)生产。小鼠抗人类CD14mAb 18D11(纯化的IgGl)从Diatec AS(Oslo，Norway)购得且通过胃蛋白酶消化来制备其F(ab′)2。眼镜蛇毒因子(CVF)从Quidel购得。细菌脂多糖(LPS)从Hoechst购得。小鼠抗人类CDllb PE共轭物从Becton Dickinson(San Jose，CA)购得。细胞核染料LDS-751从Molecular Probes(Eugene，OR)购得。
实例1人类全血炎症模型中由大肠杆菌而非LPS诱发的补体激活本研究使用人类全血模型，如先前在(Mollnes TE等人，Blood 2002；1001869-1877)中的详述。从健康志愿者采集血液并用来匹卢定(lepirudin)作抗凝处理。经测试来匹卢定并不干扰补体激活。测试本系统中大肠杆菌(1×108/mL)、经超声波处理的大肠杆菌(1×108/mL)和LPS(0.5μg/mL)对补体激活的影响。使用CVF(5U/mL)作为流体相补体激活的对照。所有培育皆在37℃下进行。通过酶联免疫分析(ELISA)来测定由补体激活形成的血浆末端sC5b-9复合体(TCC)，如在(Mollnes TE等人，Scand.J.Immunol.1985；22197-202)中详述者。在本分析中，将对TCC具有特异性的mAb涂布于微量测试板中各孔表面上。样品经培育后，通过针对人类C6的生物素化小鼠mAb来检测固定化的TCC。然后添加结合有链霉抗生物素的辣根过氧化物酶以对底物显色。用ELISA板读数器在450nm处读取反应产物的光密度(OD)。结果示于表1中。
表1由大肠杆菌而非LPS诱发的TCC在人类全血中的形成(任意单位/mL)
参阅表1，数据显示，大肠杆菌可诱发补体激活和TCC形成，而LPS不能。mAb 137-26并不抑制由大肠杆菌诱发的流体相TCC形成。CVF可诱发流体相TCC形成(经由激活旁路补体途径)。总之，结果表明，完整细菌(诸如大肠杆菌)可激活补体，而源自完整细菌的内毒素(LPS)则不能激活。因此，在败血症中存在由菌血症和内毒素血症触发的两种不同的发炎机制。
实例2
暴露于大肠杆菌或LPS的粒细胞和单核细胞的不同激活途径同样使用实例1中所述的全血系统来研究由大肠杆菌(通过经由补体激活形成的C5a)和LPS(通过CD14途径激活)对粒细胞和单核细胞的激活。用CD11b的上调量作为粒细胞和单核细胞的激活指标。将血样与抗C5/C5a mAb137-26、抗CD14 18D11 F(ab′)2、mAb 137-26和抗CD14 18D11 F(ab′)2的组合或PBS一起预先培育4分钟。向测试样品中添加大肠杆菌(1×107个细菌/mL)或经超声波处理的大肠杆菌(1×107个细菌/mL)、LPS(0.5μg/mL)或CVF(5U/mL)。改为使用PBS作为阴性对照。恰在添加激活剂之前处理基线样品。在37℃下培育10分钟之后，使用100μL血液来进行流式细胞分析。用低聚甲醛固定全血样品且随后用抗CD11b PE和细胞核染料LDS-751(Molecular Probes公司，Eugene，OR)染色。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)测量CD11b表达，以中值荧光强度(MFI)表示。所有试验进行3至5次。结果示于表2和表3中。
表2人类全血模型中抗C5/C5a mAb 137-26对由C5a诱发的CD11b上调的抑制(以中值荧光强度表示)
表3人类全血模型中抗C5/C5a mAb 137-26和抗CD14 18D11 F(ab′)2对CD11b上调的抑制(以中值荧光强度表示)
参阅表2和表3，数据显示，大肠杆菌可激活粒细胞和单核细胞，而LPS仅激活单核细胞。抗C5/C5a mAb 137-26可以一剂量相依方式有效抑制由大肠杆菌诱发的粒细胞激活，但其对单核细胞激活仅具有中等抑制效应。mAb 137-26对由LPS诱发的单核细胞激活不具有任何显著抑制效应。可激活补体的对照CVF可诱发嗜中性粒细胞和单核细胞二者的激活。mAb 137-26可有效抑制所述激活。抗CD14F(ab′)2对由大肠杆菌诱发的粒细胞和单核细胞激活影响最小(表3)。相反，其可有效抑制由LPS诱发的单核细胞激活。抗CD14 F(ab′)2和抗C5/C5amAb 137-26的组合可达成对由大肠杆菌或LPS诱发的嗜中性粒细胞和单核细胞激活的完全抑制。
总之，来自表2和表3的结果表明，大肠杆菌(菌血症)可通过补体激活诱发C5a的产生，并因此主要激活粒细胞而对单核细胞的激活程度较低，而细菌LPS则主要通过CD14相依途径(不依赖于补体)激活单核细胞。因此，将补体抑制剂和CD14途径抑制剂的组合施用给患者可用作一种预防或治疗败血症的方法。
在本说明书中，已揭示本发明的典型较佳实施例，尽管采用了特定术语，但这些术语仅以普通和描述意义使用而非用于限制本发明，本发明的范围在随附权利要求书中界定。显然，借助于上述教示内容可对本发明实施多种修改和改变。因此，应了解，可在随附权利要求书的范围内以不同于具体描述内容的方式实施本发明。
权利要求
1.一种用于预防或治疗败血症的方法，其包括向一患者联合施用败血症预防或治疗量的一或多种补体抑制剂和败血症预防或治疗量的一或多种CD14途径抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述补体抑制剂选自由下列各物组成的群组补体抑制素及其功能类似物、C1q抑制剂、C1抑制剂、C1r抑制剂、C1s抑制剂、sCR1及其类似物、抗C5抗体及其功能等效片段、抗C5a抗体及其功能等效片段、抗C5a受体抗体及其功能等效片段、抗C3a抗体及其功能等效片段、抗C3a受体抗体及其功能等效片段、抗C6抗体及其功能等效片段、抗C7抗体及其功能等效片段、抗C8抗体及其功能等效片段、抗C9抗体及其功能等效片段、抗备解素抗体及其功能等效片段、抗D因子抗体及其功能等效片段、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、MCP-DAF融合蛋白(CAB-2)、C4bp、H因子、I因子、羧肽酶N、玻璃粘连蛋白(S蛋白)、群集素和CD59。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述补体抑制剂是抗体或其功能等效片段。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述抗体选自由抗C5抗体、抗C5a抗体及抗C3a抗体组成的群组。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述抗体是抗C5a抗体。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述补体抑制剂是C5a受体拮抗剂。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述CD14途径抑制剂选自由LPS拮抗剂、LBP拮抗剂、CD14反义核苷酸、CD14 siRNA及CD14 RNAi组成的群组。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述CD14途径抑制剂是抗体或其功能等效片段。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述抗体选自由抗LPS抗体、抗LBP抗体、抗CD14抗体、抗TLR4抗体、抗MD2抗体、抗TLR2抗体和抗TLR6抗体组成的群组。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述抗体是抗CD14抗体。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述抗CD14抗体是在所述抗CD14抗体恒定区中氨基酸序列有所改变的抗体。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述抗CD14抗体是在Fc区中氨基酸序列有所变化而可改变抗体效应器功能的抗体。
13.如权利要求8所述的方法，其中所述抗体是抗LPS抗体。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述补体抑制剂是抗C5a抗体，且所述CD14途径抑制剂是抗CD14抗体。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述补体抑制剂是抗C5a抗体，且所述CD14途径抑制剂是抗LPS抗体。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述补体抑制剂是一双特异性抗体上的一抗补体组分结合位点，且所述CD14途径抑制剂是一双特异性抗体上的一抗CD14组分结合位点。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述补体抑制剂是一双特异性抗体上的一抗C5a结合位点，且所述CD14途径抑制剂是所述双特异性抗体上的一抗CD14结合位点。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述补体抑制剂以每天每公斤体重约1至50毫克的剂量施用给所述患者。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述CD14途径抑制剂以每天每公斤体重约10至200毫克的剂量施用给所述患者。
20.一种可用于预防和治疗败血症的组合物，其包括一或多种补体抑制剂和一或多种CD14途径抑制剂。
21.如权利要求20所述的组合物，其进一步包括一或多种医药上可接受的佐剂、载剂、赋形剂和稀释剂。
22.如权利要求20所述的组合物，其中所述补体抑制剂选自由下列各物组成的群组补体抑制素及其功能类似物、C1q抑制剂、C1抑制剂、C1r抑制剂、C1s抑制剂、sCR1及其类似物、抗C5抗体及其功能等效片段、抗C5a抗体及其功能等效片段、抗C5a受体抗体及其功能等效片段、抗C3a抗体及其功能等效片段、抗C3a受体抗体及其功能等效片段、抗C6抗体及其功能等效片段、抗C7抗体及其功能等效片段、抗C8抗体及其功能等效片段、抗C9抗体及其功能等效片段、抗备解素抗体及其功能等效片段、抗D因子抗体及其功能等效片段、融合蛋白膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、MCP-DAF融合蛋白(CAB-2)、C4bp、H因子、I因子、羧肽酶N、玻璃粘连蛋白(S蛋白)、群集素和CD59。
23.如权利要求20所述的组合物，其中所述补体抑制剂是抗体或其功能等效片段。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述抗体选自由抗C5抗体、抗C5a抗体及抗C3a抗体组成的群组。
25.如权利要求23所述的组合物，其中所述抗体是抗C5a抗体。
26.如权利要求20所述的组合物，其中所述补体抑制剂是C5a受体拮抗剂。
27.如权利要求20所述的组合物，其中所述CD14途径抑制剂选自由LPS拮抗剂、LBP拮抗剂、CD14反义核苷酸、CD14 siRNAs和CD14 RNAi组成的群组。
28.如权利要求20所述的组合物，其中所述CD14途径抑制剂是抗体或其功能等效片段。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述抗体选自由抗LPS抗体、抗LPB抗体、抗CD14抗体、抗TLR4抗体、抗MD2抗体、抗TLR2抗体和抗TLR6抗体组成的群组。
30.如权利要求28所述的组合物，其中所述抗体是抗CD14抗体。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述抗CD14抗体是在所述抗CD14抗体恒定区中氨基酸序列有所改变的抗体。
32.如权利要求30所述的组合物，其中所述抗CD14抗体是在Fc区中氨基酸序列有所变化而可改变抗体效应器功能的抗体。
33.如权利要求28所述的组合物，其中所述抗体是抗LPS抗体。
34.如权利要求20所述的组合物，其中所述补体抑制剂是抗C5a抗体，且所述CD14途径抑制剂是抗CD14抗体。
35.如权利要求20所述的组合物，其中所述补体抑制剂是抗C5a抗体，且所述CD14途径抑制剂是抗LPS抗体。
36.如权利要求20所述的组合物，其中所述补体抑制剂是一双特异性抗体上的一抗补体组分结合位点，且所述CD14途径抑制剂是一双特异性抗体上的一抗CD14组分结合位点。
37.如权利要求36所述的组合物，其中所述补体抑制剂是一双特异性抗体上的一抗C5a结合位点，且所述CD14途径抑制剂是所述双特异性抗体上的一抗CD14结合位点。
38.一种用于将一败血症预防或治疗组合物施用给一患者的试剂盒，其包括置于单独容器中呈单一包装形式的一补体抑制剂和一CD14途径抑制剂。
39.如权利要求38所述的试剂盒，其包含当施用给所述患者时足以提供约1至50mg/kg/天补体抑制剂的补体抑制剂量和足以提供约10至200mg/kg/天CD14途径抑制剂的CD14途径抑制剂量。
全文摘要
本发明涉及一种通过向患者联合施用败血症预防或治疗量的一或多种补体抑制剂和败血症预防或治疗量的一或多种CD14途径抑制剂来预防或治疗败血症的方法。所述补体抑制剂较佳是可结合至并抑制诸如C5a等补体蛋白的抗体，且所述CD14途径抑制剂较佳是可结合至并抑制诸如CD14和LPS等CD14途径组分的抗体。
文档编号A61K38/00GK1787741SQ200480012684
公开日2006年6月14日 申请日期2004年5月14日 优先权日2003年5月15日
发明者丰锡中, 汤姆·埃里克·莫尔内斯 申请人:唐纳士公司