替换为SEQIDNo. 9 所示的核苷酸序列（即IHNVN基因），保持pMD18-Tsimple载体的其他序列不变，得到重 组载体，将该重载载体命名为PMD18-T-IHNV。
[0083] 2、SVCV-P扩增条件的优化
[0084] 以下述PCR扩增体系对SVCV-P的扩增条件进行优化：浓度为50ng/y1的 PMD18-T-SVCV载体 2yL，5XPCRbuffer10yL，5U/ylTaq热启动酶 0.25yL，浓度为 lOpmol/y1 的SVCV-P-F0? 5yL，浓度为lOpmol/y1 的SVCV-P-R0? 5yL，DEPC水补足体 积至50yL。
[0085] 优化的SVCV-P扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C 延伸30s，50次循环；72°C延伸10min，4°C结束。
[0086] 3、VHSV-P扩增条件的优化
[0087] 以下述PCR扩增体系对VHSV-P的扩增条件进行优化：浓度为50ng/yL的 PMD18-T-VHSV载体 2yL，5XPCRbuffer10yL，5U/yLTaq热启动酶 0.25yL，浓度为 50ng/yL的VHSV-P-F0? 5yL，浓度为 50ng/yL的VHSV-P-R0? 5yL，DEPC水补足体积至 50uL〇
[0088] 优化的VHSV-P扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C 延伸30s，50次循环；72°C延伸10min，4°C结束。
[0089]4、IHNV-P扩增条件的优化
[0090] 以下述PCR扩增体系对IHNV-P的扩增条件进行优化：浓度为50ng/yL的 PMD18-T-IHNV载体 2yL，5XPCRbuffer10yL，5U/yLTaq热启动酶 0.25yL，浓度为 50ng/yL的IHNV-P-F0? 5yL，浓度为 50ng/yL的IHNV-P-R0? 5yL，DEPC水补足体积至 50uL〇
[0091] 优化的IHNV-P扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，54°C退火30s，72°C 延伸30s，50次循环；72°C延伸10min，4°C结束。
[0092] 实施例3、焦磷酸测序法鉴定SVCV、VHSV和IHNV
[0093] 提取SVCV、VHSV和IHNV的RNA，分别得到浓度均为40ng/yL的SVCV总RNA、VHSV 总RNA和IHNV总RNA〇
[0094] 1、焦磷酸测序法鉴定SVCV
[0095] 1.1PCR扩增
[0096] 50yLPCR扩增体系：浓度为 40ng/yL的SVCV总RNA2yL，5XPCRbuffer 10yL，5U/yLTaq热启动酶 0.25yL，浓度为 10pmol/yL的SVCV-P-F0.5yL，浓度为 lOpmol/yL的SVCV-P-R0? 5yL，DEPC水补足体积至 50yL。
[0097] 扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，50次 循环；72°C延伸10min，4°C结束。
[0098] 将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（图1)，结果表明，PCR扩增得到了 138bp 的PCR产物。
[0099] 1. 2焦磷酸测序
[0100] 将50yL步骤1. 1的PCR产物与200yg的链霉亲和素包被的磁珠混合后，在室温 (25°C)下孵育20分钟。用真空吸附栗（vacuumpreptool)将与磁珠结合后的PCR产物 吸起，然后依次在70%乙醇中清洗5s，在变性缓冲液（denatureationbuffer)中清洗5s， 在冲洗缓冲液（washingbuffer)中清洗10s，最后放入含有测序引物SVCV-S的板中，摇动， 释放磁珠。将样品放入80 °C烘箱2分钟，再冷却到室温。
[0101] 测序反应在28°C下自动在PYR0MARKID仪器上检测，加样使用600mbar/8msec 的加样压力和时间，每轮反应时间65秒。引物链随着不同dNTP的加入而延伸。随着核 酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列（图2)。经PyrosequencingTM IdentifireSoftware分析，所测序列包含SVCV指纹序列 "TGGGGGCGAATGCAGA"
[0102] 结果表明，SVCV指纹序列、SVCV-P及SVCV-S可用来鉴定SVCV。
[0103] 2、焦磷酸测序法鉴定VHSV
[0104] 2.1PCR扩增
[0105] 50yLPCR扩增体系：浓度为 40ng/yL的VHSV总RNA2yL，5XPCRbuffer 10yL，5U/yLTaq热启动酶 0.25yL，浓度为 10pmol/yL的VHSV-P-F0.5yL，浓度为 lOpmol/yL的VHSV-P-R0? 5yL，DEPC水补足体积至 50yL。
[0106] 扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，50次 循环；72°C延伸10min，4°C结束。
[0107] 将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（图1)，结果表明，PCR扩增得到了 205bp 的PCR产物。
[0108] 2. 2焦磷酸测序
[0109] 按照步骤1的1. 2的焦磷酸测序，将步骤1. 1的PCR产物替换为步骤2. 1的PCR产 物，其他步骤不变，得到VHSV的焦磷酸测序结果（图3)。经PyrosequencingTMIdentifire Software分析，所测序列包含VHSV指纹序列"TCCTGCATTTGGATGAA"。
[0110] 结果表明，VHSV指纹序列、VHSV-P及VHSV-S可用来鉴定VHSV。
[0111] 3、焦磷酸测序法鉴定IHNV
[0112] 3.1PCR扩增
[0113] 50yLPCR扩增体系：浓度为 40ng/yL的IHNV总RNA2yL，5XPCRbuffer 10yL，5U/yLTaq热启动酶 0.25yL，浓度为 10pmol/yL的IHNV-P-F0.5yL，浓度为 lOpmol/yL的IHNV-P-R0? 5yL，DEPC水补足体积至 50yL。
[0114] 扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，50次 循环；72°C延伸10min，4°C结束。
[0115] 将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（图1)，结果表明，PCR扩增得到了 61bp 的PCR产物。
[0116] 3. 2焦磷酸测序
[0117] 按照步骤1的1. 2的焦磷酸测序，将步骤1. 1的PCR产物替换为步骤3. 1的PCR产 物，其他步骤不变，得到IHNV的焦磷酸测序结果（图4)。经PyrosequencingTMIdentifire Software分析，所测序列包含IHNV指纹序列"GGACAGAAGCTCA"。
[0118] 结果表明，IHNV指纹序列、IHNV-P及IHNV-S可用来鉴定IHNV。
[0119] 实施例 4、SVCV-P与SVCV-S、VHSV-P与VHSV-S、IHNV-P与IHNV-S的特异性实验
[0120] 提取流行性造血器官坏死病毒（EHNV)和锦鲤疱疹病毒（KHV)的DNA，得到浓度均 为40ng/yL的EHNV总DNA和KHV总DNA，提取传染性胰脏坏死病毒（IPNV)、牙鲆弹状病毒 (HRV)和病毒性神经坏死病毒（VNNV)的RNA，分别得到浓度均为40ng/yL的IPNV总RNA、 HRV总RNA和VNNV总RNA〇
[0121] 1、SVCV-P与SVCV-S的特异性
[0122] 1.1PCR扩增
[0123] 50yLPCR扩增体系：实施例 3 的SVCV总RNA2yL，5XPCRbuffer10yL，5U/ yLTaq热启动酶 0? 25yL，浓度为lOpmol/yL的SVCV-P-F0? 5yL，浓度为lOpmol/yL的 SVCV-P-R0? 5yL，DEPC水补足体积至 50yL。
[0124] 扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，50次 循环；72°C延伸10min，4°C结束。PCR扩增结束后得到SVCV的PCR产物。
[0125] 按照上述方法，将实施例3的SVCV总RNA分别替换为实施例3的VHSV总RNA、 IHNV总RNA及上述EHNV总DNA、IPNV总RNA、HRV总RNA、VNNV总RNA和KHV总DNA，其他 步骤均不变，分别得到VHSV的PCR产物、IHNV的PCR产物、EHNV的PCR产物、IPNV的PCR 产物、HRV的PCR产物、VNNV的PCR产物和KHV的PCR产物。
[0126] 将上述PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳（图5)，结果表明，只有SVCV的PCR产 物中有138bp的条带，表明SVCV-P只有以SVCV的RNA为模板才能扩出目的条带。
[0127] 1.2焦磷酸测序
[0128] 按照实施例3步骤1中1. 2的焦磷酸测序的方法，分别以SVCV-S为测序引物对本 实施例步骤1的1. 1得到的SVCV的PCR产物、VHSV的PCR产物、IHNV的PCR产物、EHNV的 PCR产物、IPNV的PCR产物、HRV的PCR产物、VNNV的PCR产物和KHV的PCR产物进行测序。 结果显示，只有SVCV的PCR产物的测序结果有如图2所示的测序峰型，其余的PCR产物均 没有图2所示的测序峰型，表明只有SVCV的PCR产物含有SVCV指纹序列，其余的PCR产物 均不含SVCV指纹序列。
[0129] 结果表明，SVCV-P及SVCV-S可特异识别SVCV。
[0130]2、VHSV-P与VHSV-S的特异性
[0131] 2.1PCR扩增
[0132] 50yLPCR扩增体系：实施例 3 的VHSV总RNA2yL，5XPCRbuffer10yL，5U/ yLTaq热启动酶 0? 25yL，浓度为lOpmol/yL的VHSV-P-F0? 5yL，浓度为lOpmol/yL的 VHSV-P-R0? 5yL，DEPC水补足体积至 50yL。
[0133] 扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，50次 循环；72°C延伸10min，4°C结束。PCR扩增结束后得到VHSV的PCR产物。
[0134] 按照上述方法，将实施例3的VHSV总RNA分别替换为实施例3的SVCV总RNA、 IHNV总RNA及上述EHNV总DNA、IPNV总RNA、HRV总RNA、VNNV总RNA和KHV总DNA，其他 步骤均不变，分别得到SVCV的PCR产物、IHNV的PCR产物、EHNV的PCR产物、IPNV的PCR 产物、HRV的PCR产物、VNNV的P