一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高危型HPV荧光检测试剂盒，特别涉及一种运用连接酶检测高危 型HPVE6/E7mRNA的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30~35岁，浸润癌为45~ 55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。宫颈癌的早期发现和治疗是有效治疗宫颈癌的关键。
[0003] 现有研究表明，宫颈癌的主要病因是由高危型人乳头瘤病毒（Humanpapilloma virus，HPV)的持续感染或反复感染所致。人乳头瘤病毒检测在世界范围内多个国家已经 成为宫颈癌筛查和健康管理的一个重要部分。人乳头瘤病毒属于乳头瘤病毒科的乳头瘤 病毒属，为球形无包膜的双链DNA病毒，直径为52~55nm。病毒基因组为双链环状DNA，约 7. 8~8. 0kb，其中包括8个早期开放读码框架（El-E8)、2个晚期读码框架和1个非编码 长控区。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要，E6、E7基因编码 的E6、E7蛋白分别与人体细胞基因组中抑癌基因p53和Rb结合，引起细胞增殖失控，抑癌 基因对DNA的损伤修复功能丧失，导致癌前病变及癌症的发生。而晚期读码框架L1和L2 基因分别编码HPV的主要和次要衣壳蛋白，组装成HPV的衣壳。
[0004] 人乳头瘤病毒有多种基因型，依据不同型别致宫颈癌发生危险性的高低可将其分 为低危型和高危型HPV。99. 7%的宫颈癌与高危型HPV感染有关，其中80%的高危型HPV感 染为无致癌风险的一过性感染，两年内将自行消退；20%高危型HPV感染为有潜在致癌风险 的持续性/整合感染，但只有伴随持续性E6、E7mRNA转录，产生E6、E7癌蛋白，才会最终致 癌。E6、E7mRNA是目前宫颈癌最佳的风险评估指标。检测高危型HPVE6/E7mRNA的意义 在于：1)高危型HPV病毒癌基因E6、E7mRNA转录和表达是宫颈癌的关键病因。2)筛查出 因高危型HPV感染而可能发生细胞学异常的人群。有E6、E7mRNA转录的就是高危人群，无 E6、E7mRNA转录的如果细胞学检测结果正常就不是高危人群。通过E6、E7mRNA转录筛查 可以筛查出已经发生HPV感染人群中的高危群体，进而筛查出将来可能进一步进展的宫颈 癌高危人群，对细胞学检测结果进行补充更为特异。
[0005] 现有的运用荧光PCR方法进行高危型人乳头瘤病毒基因分型检测的技术的缺点 有：①一般是针对HPV基因组的L1基因进行检测，检测结果不如E6/E7基因的检测结果有 临床诊断意义。②前期一般都需要经过步骤繁琐的HPV核酸提取；③核酸提取完成后运用 普通Taqman探针的方法进行多重PCR扩增，意味着一个反应管含有多条引物，引物间的相 互干扰导致扩增灵敏度低且耗时长；④一般都是FAM和HEX两个荧光通道检测，无法具体区 分高危HPV型别，难以满足实际使用的需要。
[0006] 开发出可以快速、高效检测高危型HPVE6/E7mRNA的方法及试剂盒，具有非常实 际的意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试 剂盒。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的技术包括如下步骤： 1)针对需要检测的每个高危型HPV E6/E7 mRNA序列设计其相应的上下游连接引物、特 异性荧光探针及一对荧光PCR通用引物，上游连接引物为普通引物，下游连接引物为5'磷 酸化标记引物； 2)上下游连接引物与样本提取后的RNA靶片段互补配对，在连接酶的作用下，上下游 连接引物连接成与靶片段完全互补配对的cDNA序列； 3)将连接后的cDNA序列作为荧光PCR反应的模板，仅一对通用引物即可扩增所有型别 连接后的cDNA序列，检测反应体系的荧光变化，达到对样本高危型HPV基因检测的目的。
[0009] 运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的试剂盒，包括连接反应管、荧光PCR反 应管、阴性对照和阳性对照，其中，连接反应管含连接体系(含连接酶系统和上下游连接引 物)，荧光PCR反应管含荧光PCR体系(含热启动Taq酶系统、通用引物及各型别对应的荧光 探针)，荧光PCR体系中的荧光探针为HPV特异性MGB探针。
[0010] 连接引物的序列如下_1
优选的，通用引物序列的特征表现为：
1条与上游连接引物的5'_端部分序列完全一 致，另一条与下游连接引物的3'端部分序列互补配对，通用引物的长度在20~30bp。
[0011]HPV特异性MGB探针的序列如下:_
上述探针的3'端连接有MGB，5'端连接有荧光基团，其中，探针1用于检测常见高危型HPV基因型16型；探针2用于检测常见高危型HPV基因型18型；探针3~18分别用于检 测另外13种常见高危型HPV基因型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82和3种少 见高危型HPV基因型26、53、73。
[0012] 优选的，上述连接酶系统中的连接酶仅能以RNA为模板进行连接反应，且每人份 连接体系中连接酶用量为1U。
[0013] 优选的，上述运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒中所使用的热启动 Taq酶系统中添加有UDG酶，能有效防污染，使得本发明试剂盒的灵敏度更高，最低检出量 为1. 0E+03拷贝/反应。
[0014] 优选的，上述运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒中所使用的热启动 Taq酶系统含有经过化学修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中热启动 Taq酶为 5U，dNTPs为 0? 2mmol/L，UDG酶为 0? 3U。
[0015] 优选的，上述运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒还设有RNA提取 液，RNA提取液的组成成分为EDTA的浓度为0?OOlmol/L、Tris的浓度为0?Olm〇l/L〇
[0016] 优选的，上述运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒中所使用的探针1 连接的荧光基团不同于探针2,3~18连接的荧光基团。
[0017] 优选的，上述运用连接酶检测高危型HPVE6/E7mRNA的试剂盒中所使用的探针2 连接的荧光基团不同于探针1，3~18连接的荧光基团。
[0018] 本发明的有益效果是： 1)本发明的试剂盒适用于定性检测宫颈脱落细胞和生殖泌尿道分泌物样本中18种可 引起宫颈癌的高危型HPVE6/E7mRNA。
[0019] 2)应用本发明的试剂盒中的RNA提取液可省去前期对样本进行提取的繁琐步骤。
[0020] 3)本发明应用单重荧光PCR技术实现了在同一管扩增体系中检测18种HPV基因 型。在同时检测13种常见高危型HPV基因型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、 82)和三种少见高风险HPV基因型（26、53、73)之外，同时还能具体分型高危型HPV基因型 16型和18型。
[0021] 4)本发明中的荧光PCR体系只有一对通用引物，即可扩增在连接酶系统中成功连 接的18种高危型HPV基因型的cDNA靶片段，有效解决了引物过多导致的扩增效率低下及 灵敏度低等问题。
[0022] 5)本发明的检测试剂盒，检测通量高，大大降低了筛查成本。
【附图说明】
[0023] 图1~3为本发明技术的反应原理图，图4~7为本试剂盒检测范围内的HPV型 别检测结果示意图： 图1为连接引物与通用引物示意图，如图所示：上游通用引物序列与上游连接引物的 5'端部分序列完全一致，而下游通用引物序列则与下游连接引物的3'端部分序列完全反向 互补配对； 图2为连接反应示意图，如图所示：上游连接引物的部分序列（非与上游通用引物序列 一致的部分)与靶片段mRNA(targetmRNA)互补配对，下游连接引物的部分序列(非与下游 通用引物序列反向互补配对的部分）与靶片段mRNA互补配对，上下游连接引物在连接酶作 用下连接成与祀片段mRNA完全互补配对的cDNA序列，S卩连接产物（ligatedproduct); 图3为通用引物PCR反应示意图，如图所示：首先，下游通用引物与连接产物3 '端反向 互补配对结合，在Taq酶作用下，下游通用引物PCR扩增产生双链