专利名称：一种4－香豆酸辅酶a连接酶基因及其克隆的制作方法
技术领域：
本发明是一种4-香豆酸辅酶A连接酶基因及其克隆，属于生物工程领域，特别涉及到紫穗槐(Amorpha fruticosa)编码4-香豆酸辅酶A连接酶的基因及其克隆。
背景技术：
林业生产中树木的价值不但在于木材产量，还体现在木纤维的理化指标上。木纤维主要由木质素和纤维素组成。纤维素是主要由β-D-葡萄糖基以1-4糖苷键连接而成的复杂的高分子物质，是造纸的主要原料。造纸制浆的过程就是要从植物纤维原料中去除木质素类物质，尽量保留纤维素和半纤维素。木材与禾杆植物细胞壁中木质素含量相当高，这就是常用造纸原料在制浆造纸工业中产生污染的根本原因。为了降低污染，人们开展了多学科的广泛研究。随着植物分子生物学的飞速发展，人们开始重视从造纸原料——植物入手，试图在了解植物生长发育机理及分子调控的基础上，通过基因工程途径研究开发出立足减轻环境污染、更适合于制浆造纸工业的植物资源，从根本上解决造纸污染问题。因此涉及植物纤维素合成以及降低植物木质素含量或改变其组成的基因工程的研究、应用对纸浆工业具有非常重要的作用。本发明试图从降低植物木质素含量这个角度来研究如何改善树木材质的问题，并通过基因克隆及其在转基因植物中的表达来研究相关基因在植物体内的作用。此项研究的成功必将从根本上大大减轻乃至消除因降解木质素而对环境产生的污染，提高造纸制浆行业的生产率，保护生态环境。因此，通过基因工程技术控制木质素含量和组成，可在农林业生产中得到应用。
4-香豆酸辅酶A连接酶(4-CoumarateCoA ligases，4CL，EC 6.2.1.12)的主要功能是催化羟基苯乙酸到相应的硫酯的反应，维持苯丙酸类(如木质素和黄酮类化合物)生物合成所需新陈代谢功能，可利用香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸作为底物，催化合成木质素单体，调节木质素合成。4CL反义基因，可抑制4-香豆酸CoA连接酶在转基因植物中的表达，降低木质素含量。从降低植物木质素含量这个角度来研究如何改善树木材质的问题，可从根本上大大减轻乃至消除因降解木质素而对环境产生的污染，提高造纸制浆行业的生产率，保护生态环境。
发明内容
本发明的目的是提供一种紫穗槐(Amorpha fruticosa)编码4-香豆酸辅酶A连接酶的基因4CL序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有4CL的克隆载体pUC19/4CL和含有这种载体的E.coli细胞JM109/pUC19/4CL。利用本发明成果，可以构建4-香豆酸辅酶A连接酶基因工程菌，用于植物的基因转化，达到改善植物品质的目的。
本发明采用的技术方案是利用简并寡核苷酸PCR法结合cDNA末端快速扩增PCR法，以紫穗槐茎RNA为模板，先用简并PCR引物，通过RT-PCR的方法，得到了4CL基因片段，又据此片段设计反向嵌套引物，用RACE方法获得了未知的5’和3’端基因片段，从而克隆了紫穗槐4CL全长cDNA，并测定了核苷酸序列。将4CL和克隆载体pUC19分别用限制性内切酶切割，形成互补的粘性末端，T4DNA连接酶连接，形成4CL克隆载体pUC19/4CL。热激法将这个克隆载体导入感受态E.coli细胞JM109，成为含有pUC19/4CL的大肠杆菌细胞JM109/pUC19/4CL。
紫穗槐(Amorpha fruticosa)4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL全序列在GenBanK数据库注册，号码为AF435968。具体序列如下1 tcacaaacac aaaataccat tcccgcaatg gcatttgaga cagaagaacc aaaggaattc61 atcttcaggt caaaattacc agaaatccca atctccaaac accttcccct tcactcttac121 tgctttgaga acctctcaga attcgggtca cgtccatgct tgatcagtgc cccaacaggg181 gacgtgtaca cctactatga cgtggaactc accgctagaa gagttgcctc tggactcaac241 aaattgggtg tccaacaagg tgatgtcatc atgctccttc ttcctaattc accagaattt301 gtgttctcct tcttgggtgc ctcttaccgt ggtgccatga tcactgctgc caacccattc361 ttcacatccg ctgagattgc aaaacaggcc aaagcctcca acaccaagtt gcttataaca421 caagcttctt actacgacaa ggttaaggat ttggatgtga agttggtgtt cgtggactct481 ccccctgatg ggcacatgca ctattcagag ctgcgtgagg ctgatgagag tgacatgcct541 gaggtgaaga ccaaccctga tgatgtggtg gcacttccct attcgtcagg gacaacaggg601 ttgcccaaag gggtgatgtt atctcacaaa gggttggcga ccagcatagc acaacaagtt661 gatggggaaa accccaacct ctactttcac aatgaggatg tcatattgtg tgtgcttcca721 ctctttcata tatattctct caattctgtt ctgttgtgtg ggttgagagc caaggctgct781 attttgctga tgccaaagtt tgagatcaat gccttgttgg gtctcattca gaaacaccga841 gtaacaattg cccctattgt cccacccatt gttttggcca ttgccaagtc accggatctt901 gaaaagtatg atctctcttc cattagggtg ttgaaatctg gaggggcttc tctgggcaaa961 gaactcgaag acactgtgag ggctaaattc cccaaggcca aacttggaca gggatacgga1021 atgactgagg cagggccagt gctaacaatg tgcttagcat ttgctaagga accgatagat1081 gtaaaaccag gtgcatgtgg aaccgttgta agaaatgcag agatgaagat tgtggatcct1141 gaaactggta attcgttgcc acgaaaccag tccggtgaaa tttgcataag aggcgaccag1201 atcatgaaag gttatctaaa tgatcaagag gctacgcaga gaaccataga caaagaaggg1261 tggttgcata caggtgacat cggctacatc gacgatgacg atgagttatt catcgttgac1321 aggcttaagg aattgatcaa atacaaagga tttcaggtgg ctcctgctga actcgaagcc1381 cttcttctct ctcatcccaa gatcaccgat gctgctgtgg ttccaatgaa ggatgaagca1441 gctggagagg tacctgttgc atttgtggtg agatcaaatg gtcacacaga cacaaccgag1501 gatgaaatta agcagtttat ctccaaacag gtggtgtttt ataaaagaat aagcagagta1561 ttcttcattg atgcaattcc caagtcaccg tcaggtaaaa tcttacgaaa ggatctaaga1621 gcaaagcttg cagcaggtgt tccaaattga aaattctaat tccaagatat atgatattac1681 cattatcata cgatgcccgc acaaagctcc ataaaccttg aaggccagag tgcggacgcg1741 tgcttggagc ttgaccgcat tacttatatt cacacgaggg cagacatgat taccttaaaa1801 gggggggttg ctaattatat tttaaaacta tattgggtaa aatttgattc gatcaaggac1861 tttcatatta tataatatcg aagtataatt tttcaaaaaa aaaaaaaaaa a其中ATG为转录起始密码，TAG为转录终止密码。根据以上核苷酸序列，推测紫穗槐(Amorpha fruticosa)4-香豆酸辅酶A连接酶氨基酸序列如下1 MAFET EEPKE FIFRS KLPEI PISKH LPLHS YCFEN LSEFG41 SRPCL ISAPT GDVYT YYDVE LTARR VASGL NKLGV QQGDV81 IMLLL PNSPE FVFSF LGASY RGAMI TAANP FFTSA EIAKQ
121 AKASN TKLLI TQASY YDKVK DLDVK LVFVD SPPDG HMHYS161 ELREA DESDM PEVKT NPDDV VAL VMLSH201 KGLAT SIAQQ VDGEN PNLYF HNEDV ILCVL PLFHI YSLNS241 VLLCG LRAKA AILLM PKFEI NALLG LIQKH RVTIA PIVPP281 IVLAI AKSPD LEKYD LSSIR VLKSG GASLG KELED TVRAK321 FPKAK LGQGY GMTEA GPVLT MCLAF AKEPI DVKPG ACGTV361 VRNAE MKIVD PETGN SLPRN QS D QIMKG YLNDQ401 EATQR TIDKE GWLHT GDIGY IDDDD ELFIV DRLKE LIKYK441 GFQVA PAELE ALLLS HPKIT DAAVV MKDEA AGEVP VAFVV481 RSNGH TDTTE DEIKQ FISKQ VVFYK RISRV FFIDA IPKSP521 SGKIL RKDLR AKLAA GVPN紫穗槐(Amorpha fruticosa)4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL全长1911bp，28-1650为编码区，共编码540个氨基酸。蛋白质结构域预测表明紫穗槐4CL全长cDNA编码的4-香豆酸CoA连接酶，含有预计的AMP-binding位点PYSSG TTG LPKG，催化活性反应区GEICIRG和保守的Cys残基，是典型的4CL蛋白。
本发明的效果和益处在于4CL是首次被提取、测序和克隆的紫穗槐(Amorpha fruticosa)4-香豆酸辅酶A连接酶基因。因其所编码的4-香豆酸辅酶A连接酶参与植物木质素合成代谢过程，所以该基因的克隆可用于构建表达4-香豆酸辅酶A连接酶的基因工程菌，用于植物的基因转化，达到改善植物品质的目的。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明给予进一步说明。
实施例14CL cDNA全长目的片段的克隆和测序取春季萌发的紫穗槐枝条，剥去外皮，用清洁刀片刮取次生分生组织，液氮研磨成粉，加入TRIzol试剂，提取RNA。按照BcabESTTMRNA PCR KitVer.1.1(TAKALA)方法，以Oligo dT为引物，以提取的总RNA为模板，进行反转录反应，合成cDNA。根据GenBank上编码4CL蛋白保守区序列设计简并引物4CLF1和4CLR1(表1)，以上述合成的cDNA为模板，进行PCR反应。用TaKaRa Ex TaqTM试剂盒，调制反应液，PCR反应物组成如下(50μl体系)5μl dNTP，5μl ExTag buffer，0.25μl(5U/μl)ExTag，RT反应产物1μl，引物4CLF1和4CLR1各1μl。反应条件为94℃预变性5min，然后98℃10s，55℃30s，72℃55s，共30个循环，反应结束时72℃继续延伸7min。将PCR产物回收片段4CL1克隆，测序并分析。
根据已获得的紫穗槐4CL1 cDNA部分序列，设计一条5′末端磷酸化的反转录引物ART1。在反转录引物内侧设计两对反向嵌套PCR引物AF1\AR1和AF2\AR2，扩增包括5′末端的cDNA片段。引物序列如下4CLF1 AAGGAATTNATNAAATACAAN4CLR1 AANACNACNAGTTTNGAGATAAART1 (P)-CCACCTGTTTGGAGAF1 ACACAGACACAACCGAGGATAR1 GCTGCTTCATCCTTCATTGGAF2 CATCCCAAGATCACCGATGCTAR2 CGAGTTCAGCAGGAGCCACAF3 TCACAAACACAAAATACCATAFATGGCATTTGAGACAGAAGAAARTCAATTTGGAACACCTGCTGC反应按照5′-Full RACE Core Set(TAKARA)的方法进行。
PCR反应条件94℃预变性5min，94℃1min，55℃30s，72℃60s，重复30个循环，反应结束时72℃继续延伸7分钟。将PCR产物回收测序。
按照3′-FULL RACE Core Set(TAKARA)方法，用OligodT-3sitesAdaptor引物进行反转录反应。再用OligodT-3sites Adaptor引物和AF1引物扩增含3′末端的cDNA片段4CL3。PCR反应条件94℃预变性5min，94℃1min，55℃30s，72℃60s，重复30个循环，反应结束时72℃继续延伸7分钟。将PCR产物回收测序。
依据5′RACE和3′RACE扩增产物的核苷酸序列设计特异引物AF3，按照BcaBESTTMRNA PCR Kit Ver.1.1(TAKALA)方法，以Oligo dT为下游引物，扩增4CL全长cDNA并测序，得到紫穗槐(Amorpha fruticosa)4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL。
实施例24CL与克隆载体pUC19的重组4CL和克隆载体pUC19分别用EcoRI/SphI双酶切。酶切条件如下Eppendorf AddH2O11μl1×H 2μlPCR片段(1μg/μl)5μlEcoRI1μlSphI 1μlEppendorf BddH2O15μl1×H 2μl质粒(1μg/μl)1μlEcoRI 1μlSphI 1μl37℃酶切3小时，电泳后分别回收两个目的片段，用T4DNA连接酶连接。连接条件如下ddH2O 6μlPCR片段(0.1μg/μl) 1μl质粒(0.05μg/μl) 1μl10×T4DNA连接酶Buffer 1μlT4DNA连接酶(1U/μl) 1μl16℃连接1小时，电泳检测连接产物，回收其中约3.5kb片段为含有4CL的克隆载体pUC19/4CL，用于转化大肠杆菌。
实施例3克隆载体pUC19/4CL转化大肠杆菌JM109加入60μl解冻的感受态E.coli JM109和10μl连接液至Eppendorf中，冰上30秒，42℃50秒，冰上2分钟，加入37℃的LB培养基930μl，37℃震荡培养1小时。菌液与4μl IPTG及40μl X-gal混合后涂含有50mg/Ap的LB平板上，37℃培养过夜。挑选白色菌落做PCR检测，琼脂糖凝胶电泳中呈现1.5kb特异带者为阳性转化菌落，为含有pUC19/4CL的大肠杆菌JM109/pUC19/4CL。从JM109/pUC19/4CL中提取质粒，以pUC19的测序通用引物测定外源插入序列4CL的核苷酸序列，与实施例1中所述PCR测序结果一致。
权利要求
1.一种4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL，其特征在于它是紫穗槐(Amorphafruticosa)编码4-香豆酸辅酶A连接酶(4-CoumarateCoA ligases)的基因。
2.根据权利要求1所述4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL的核苷酸序列SEQ IDNo.1，具体序列如下1 tcacaaacac aaaataccat tcccgcaatg gcatttgaga cagaagaacc aaaggaattc61 atcttcaggt caaaattacc agaaatccca atctccaaac accttcccct tcactcttac121 tgctttgaga acctctcaga attcgggtca cgtccatgct tgatcagtgc cccaacaggg181 gacgtgtaca cctactatga cgtggaactc accgctagaa gagttgcctc tggactcaac241 aaattgggtg tccaacaagg tgatgtcatc atgctccttc ttcctaattc accagaattt301 gtgttctcct tcttgggtgc ctcttaccgt ggtgccatga tcactgctgc caacccattc361 ttcacatccg ctgagattgc aaaacaggcc aaagcctcca acaccaagtt gcttataaca421 caagcttctt actacgacaa ggttaaggat ttggatgtga agttggtgtt cgtggactct481 ccccctgatg ggcacatgca ctattcagag ctgcgtgagg ctgatgagag tgacatgcct541 gaggtgaaga ccaaccctga tgatgtggtg gcacttccct attcgtcagg gacaacaggg601 ttgcccaaag gggtgatgtt atctcacaaa gggttggcga ccagcatagc acaacaagtt661 gatggggaaa accccaacct ctactttcac aatgaggatg tcatattgtg tgtgcttcca721 ctctttcata tatattctct caattctgtt ctgttgtgtg ggttgagagc caaggctgct781 attttgctga tgccaaagtt tgagatcaat gccttgttgg gtctcattca gaaacaccga841 gtaacaattg cccctattgt cccacccatt gttttggcca ttgccaagtc accggatctt901 gaaaagtatg atctctcttc cattagggtg ttgaaatctg gaggggcttc tctgggcaaa961 gaactcgaag acactgtgag ggctaaattc cccaaggcca aacttggaca gggatacgga1021 atgactgagg cagggccagt gctaacaatg tgcttagcat ttgctaagga accgatagat1081 gtaaaaccag gtgcatgtgg aaccgttgta agaaatgcag agatgaagat tgtggatcct1141 gaaactggta attcgttgcc acgaaaccag tccggtgaaa tttgcataag aggcgaccag1201 atcatgaaag gttatctaaa tgatcaagag gctacgcaga gaaccataga caaagaaggg1261 tggttgcata caggtgacat cggctacatc gacgatgacg atgagttatt catcgttgac1321 aggcttaagg aattgatcaa atacaaagga tttcaggtgg ctcctgctga actcgaagcc1381 cttcttctct ctcatcccaa gatcaccgat gctgctgtgg ttccaatgaa ggatgaagca1441 gctggagagg tacctgttgc atttgtggtg agatcaaatg gtcacacaga cacaaccgag1501 gatgaaatta agcagtttat ctccaaacag gtggtgtttt ataaaagaat aagcagagta1561 ttcttcattg atgcaattcc caagtcaccg tcaggtaaaa tcttacgaaa ggatctaaga1621 gcaaagcttg cagcaggtgt tccaaattga aaattctaat tccaagatat atgatattac1681 cattatcata cgatgcccgc acaaagctcc ataaaccttg aaggccagag tgcggacgcg1741 tgcttggagc ttgaccgcat tacttatatt cacacgaggg cagacatgat taccttaaaa1801 gggggggttg ctaattatat tttaaaacta tattgggtaa aatttgattc gatcaaggac1861 tttcatatta tataatatcg aagtataatt tttcaaaaaa aaaaaaaaaa a
3.根据权利要求1所述含有4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL的核苷酸序列的重组载体pUC19/4CL。
4.根据权利要求3所述含有4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL的核苷酸序列的重组载体的宿主细胞JM109/pUC19/4CL。
全文摘要
本发明是一种4－香豆酸辅酶A连接酶基因及其克隆，属于生物工程领域。本发明提供了一种来自于紫穗槐(Amorpha fruticosa)编码4－香豆酸辅酶A连接酶的基因4CL，提供了4CL序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有4CL的克隆载体pUC 19/4CL和含有这种载体的E.coli细胞JM109/pUC19/4CL。本发明可用于构建4－香豆酸辅酶A连接酶基因工程菌，用于植物的基因转化，达到改善植物品质的目的。
文档编号C07H21/00GK1390940SQ0213263
公开日2003年1月15日 申请日期2002年7月19日 优先权日2002年7月19日
发明者安利佳, 刘文哲, 苏乔, 高晓蓉, 杨君 申请人:大连理工大学