V
[0176] 按照如下PCR扩增体系进行焦磷酸测序法鉴定VHSV的PCR扩增：步骤1的样品 总RNA2yL(每个体系中加入一个样品的总RNA)，5XPCRbuffer10yL，5U/yLTaq热 启动酶 0? 25yL，浓度为lOpmol/yL的VHSV-P-F0? 5yL，浓度为lOpmol/yL的VHSV-P-R 0. 5yL，DEPC水补足体积至50yL。
[0177] 扩增条件均为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，50 次循环；72°C延伸10min，4°C结束。PCR扩增结束后分别得到样品1-40的VHSVPCR产物。
[0178] 按照实施例3步骤1中1. 2的焦磷酸测序的方法，分别以VHSV-S为测序引物对 样品1-40的VHSVPCR产物进行测序。结果显示（表2)，样品37的VHSVPCR产物中含有 VHSV指纹序列，其余的PCR产物均不含VHSV指纹序列，表明样品37含有VHSV，其余的样品 均不含VHSV。
[0179] 2. 3焦磷酸测序法鉴定IHNV
[0180] 按照如下PCR扩增体系进行焦磷酸测序法鉴定IHNV的PCR扩增：步骤1的样品 总RNA2yL(每个体系中加入一个样品的总RNA)，5XPCRbuffer10yL，5U/yLTaq热 启动酶 0? 25yL，浓度为lOpmol/yL的IHNV-P-F0? 5yL，浓度为lOpmol/yL的IHNV-P-R 0. 5yL，DEPC水补足体积至50yL。
[0181] 扩增条件均为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，50 次循环；72°C延伸10min，4°C结束。PCR扩增结束后分别得到样品1-40的IHNVPCR产物。
[0182] 按照实施例3步骤1中1. 2的焦磷酸测序的方法，分别以IHNV-S为测序引物对样 品1-40的IHNVPCR产物进行测序。结果显示（表2)，样品17、19、27、32和34的VHSVPCR 产物中均含有IHNV指纹序列，其余的PCR产物均不含IHNV指纹序列，表明样品17、19、27、 32和34均含有IHNV，其余的样品均不含IHNV。
[0183] 3、普通PCR鉴定SVCV、VHSV和IHNV
[0184] 3. 1 普通PCR鉴定SVCV
[0185] 按照如下PCR扩增体系鉴定SVCV:步骤1的样品总RNA2yL(每个体系中加入一 个样品的总RNA)，5XPCRbuffer10yL，5U/yLTaq热启动酶 0.25yL，浓度为lOpmol/ yL的正向引物（正向引物的序列为
[0186] 5' -TCT-TGG-AGC-CAA-ATA-GCT-CAR-RTC-3'（R表示A/G)) 0? 5yL，浓度为lOpmol/ yL的反向引物（反向引物的序列为
[0187] 5' -AGA-TGG-TAT-GGA-CCC-CAA-TAC-ATH-ACN-CAY-3'（H表示A/C/T;N表示A/C/ G/T;Y表示C/T)) 0? 5yL，DEPC水补足体积至 50yL。
[0188] 扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，50次 循环；72°C延伸10min，4°C结束。PCR扩增结束后分别得到样品1-40的SVCVPCR产物。
[0189] 将样品1-40的SVCVPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，样品4、10、12、15、 21、23和39的SVCVPCR产物中均含有目的条带，表明，样品4、10、12、15、21、23和39均含 有SVCV〇
[0190] 3. 2 普通PCR鉴定VHSV
[0191] 按照如下PCR扩增体系鉴定VHSV:步骤1的样品总RNA2yL(每个体系中加入一 个样品的总RNA)，5XPCRbuffer10yL，5U/yLTaq热启动酶 0.25yL，浓度为lOpmol/ yL的正向引物（正向引物的序列为
[0192] 5' -AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3'）0? 5yL，浓度为lOpmol/yL的反向引 物（反向引物的序列为 5' -TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3'）0? 5yL，DEPC水补足体 积至50yL。
[0193] 扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，50次 循环；72°C延伸10min，4°C结束。PCR扩增结束后分别得到样品1-40的VHSVPCR产物。
[0194] 将样品1-40的VHSVPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳结果显示，样品37的VHSVPCR 产物中含有目的条带，表明，样品37含有VHSV。
[0195] 3. 3 普通PCR鉴定IHNV
[0196] 按照如下PCR扩增体系鉴定IHNV:步骤1的样品总RNA2yL(每个体系中加入一 个样品的总RNA)，5XPCRbuffer10yL，5U/yLTaq热启动酶 0.25yL，浓度为lOpmol/ yL的正向引物（正向引物的序列为5' -AGA-GAT-CCCTAC-ACC-AGA-GAC-3'）0? 5yL，浓度 为10pmol/yL的反向引物（反向引物的序列为
[0197] 5' -GGT-GGT-GTT-GTTTCC-GTG-CAA-3'）0? 5yL，DEPC水补足体积至 50yL。
[0198] 扩增条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，50次 循环；72°C延伸10min，4°C结束。PCR扩增结束后分别得到样品1-40的IHNVPCR产物。
[0199] 将样品1-40的IHNVPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，样品17、19、27、32 和34的IHNVPCR产物中均含有目的条带，表明，样品17、19、27、32和34均含有IHNV。
[0200] 表2、焦磷酸测序法与普通PCR鉴定SVCV、VHSV和IHNV的结果比较
[0201]
[0202] 注：表2中，"一"表示待测样品不含SVCV、VHSV和IHNV。
[0203]实验结果表明，依赖于SVCV-P与SVCV-S、VHSV-P与VHSV-S、IHNV-P与IHNV-S鉴定 SVCV、VHSV、IHNV的焦磷酸测序法与普通PCR鉴定SVCV、VHSV、IHNV的结果是一致的。普通 PCR鉴定SVCV时样品10的条带较弱，普通PCR鉴定IHNV时样品17的条带较弱，普通PCR 鉴定IHNV时样品37的条带较弱，较难辨别，而本发明的依赖于SVCV-P与SVCV-S、VHSV-P 与VHSV-S、IHNV-P与IHNV-S鉴定SVCV、VHSV、IHNV的焦磷酸测序法则可以避免这一问题。
【主权项】
1. 检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的物质在制备基于焦磷酸测序的病毒性出 血性败血症病毒检测试剂或试剂盒中的应用；所述病毒性出血性败血症病毒指纹序列为序 列表中SEQ ID No. 5的第451-467位核苷酸。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测病毒性出血性败血症病毒指纹 序列的物质包括病毒性出血性败血症病毒指纹序列的测序引物和/或扩增病毒性出血性 败血症病毒指纹序列的引物对。3. 基于焦磷酸测序的病毒性出血性败血症病毒检测试剂或试剂盒，包括检测病毒性出 血性败血症病毒指纹序列的物质；所述病毒性出血性败血症病毒指纹序列为序列表中SEQ ID No. 5的第451-467位核苷酸。4. 根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述检测病毒性出血性败血症 病毒指纹序列的物质包括病毒性出血性败血症病毒指纹序列的测序引物和/或扩增病毒 性出血性败血症病毒指纹序列的引物对。5. 根据权利要求2所述的应用或权利要求4所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述 测序引物为名称为VHSV-S的序列表中SEQ ID No. 8所示的单链DNA ;所述扩增病毒性出血 性败血症病毒指纹序列的引物对为名称为VHSV-P的由序列表中SEQ ID No. 6所示的单链 DNA和SEQ ID No. 7所示的单链DNA组成的引物对。6. 权利要求4或5所述的试剂或试剂盒的制备方法，包括将所述测序引物和/或所述 扩增病毒性出血性败血症病毒指纹序列的引物对的两条单链DNA独立包装的步骤。7. 权利要求1-5中任一所述的检测病毒性出血性败血症病毒指纹序列的物质。8. 病毒性出血性败血症病毒的检测方法，包括下述Hl)和H2)的步骤： Hl)以待测生物样品的核酸为模板，选用58°C的退火温度，用权利要求5所述VHSV-P 进行PCR扩增得到PCR产物； H2)检测步骤Hl)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有205bp的DNA片 段，所述待测样品含有病毒性出血性败血症病毒或候选含有病毒性出血性败血症病毒；如 果所述PCR产物中不含205bp的DNA片段，所述待测样品不含病毒性出血性败血症病毒或 候选不含病毒性出血性败血症病毒。9. 病毒性出血性败血症病毒的检测方法，包括下述H3)和H4)的步骤： H3)以待测生物样品的核酸为模板，选用58°C的退火温度，用权利要求5所述VHSV-P 进行PCR扩增得到PCR产物； H4)检测步骤H3)得到的PCR产物，如果所述PCR产物中含有权利要求1或3所述病毒 性出血性败血症病毒指纹序列，所述待测样品含有病毒性出血性败血症病毒或候选含有病 毒性出血性败血症病毒；如果所述PCR产物中不含权利要求1或3所述病毒性出血性败血 症病毒指纹序列，所述待测样品不含病毒性出血性败血症病毒或候选不含病毒性出血性败 血症病毒。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述检测步骤H3)得到的PCR产物为以 权利要求5所述VHSV-S为测序引物进行焦磷酸测序。
【专利摘要】本发明公开了基于焦磷酸测序的病毒性出血性败血症病毒检测试剂盒。本发明所提供的基于焦磷酸测序的病毒性出血性败血症病毒检测试剂盒，依赖于病毒性出血性败血症病毒指纹序列，所述病毒性出血性败血症病毒指纹序列为序列表中SEQ？ID？No.5的第451-467位核苷酸；所述试剂盒包括病毒性出血性败血症病毒指纹序列的测序引物和扩增病毒性出血性败血症病毒指纹序列的引物对；所述测序引物为名称为VHSV-S的序列表中SEQ？ID？No.8所示的单链DNA；所述扩增病毒性出血性败血症病毒指纹序列的引物对为名称为VHSV-P的由序列表中SEQ？ID？No.6所示的单链DNA和SEQ？ID？No.7所示的单链DNA组成的引物对。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105112567
【申请号】CN201510581530
【发明人】岳志芹, 尹伟力, 孙明君, 梁君妮, 任彤, 张利峰
【申请人】山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月14日