一种全量程c反应蛋白的定量检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫检测分析技术领域，提供了一种全量程C反应蛋白定量检测试剂 盒，适用于人血清样本中全量程C反应蛋白的定量检测。
【背景技术】
[0002] 1930年，美国洛克菲勒研究院的Tillett和Francis发现急性感染病人的血清可 以和肺炎链球菌的C-多糖（C-polysaccharide)发生沉淀反应。1941年，Avery等人用硫酸 铵沉淀和C-多糖沉淀的方法粗提得到一种蛋白质，并正式命名为C-反应蛋白（C-reactive protein, CRP)。CRP的分子结构是由5个完全相同的未糖基化的多肽亚单位构成的环状五 球体，每个亚单位由206个氨基酸，23kDa分子量的多肽链组成。
[0003] 通常CRP的检测灵敏度在3mg/L，而超敏CRP则可以准确给出0. 15-8mg/L的定量 值。CRP由肝脏合成和分泌，在机体突遇紧张、组织创伤和各种炎症刺激时，CRP的合成会快 速增加，浓度水平会达到之前的几十倍甚至上百倍。在感染后的12-48小时内可以检测到 高水平的CRP，在临床上一直作为炎症性疾病的指标之一，其升高的幅度与疾病的严重程度 呈现正相关。常规CRP是观察炎症和组织损伤的敏感指标，测试范围一般为8-160mg/L。在 临床上广泛应用于感染及自身免疫性疾病等，适用于细菌或病毒的感染以及抗生素疗效的 观察。超敏CRP (hs-CRP)，炎症在心脑血管和动脉粥样硬化斑块的形成、发展过程中起着重 要作用，而动脉粥样硬化斑块的形成、发展，是发生心脑血管狭窄、破裂、血栓形成，进而导 致心肌梗死和脑血栓的病理基础。
[0004] CRP在临床上可应用于内科感染性疾病的诊断、监测和预后，外科感染疾病的诊 断、监测和预后，例如急性阑尾炎、组织损伤以及手术后感染等且CRP，特别是超敏CRP已经 成为心血管类疾病的一个有效预测的标志物。另外也可应用于类风湿性关节炎，系统性红 斑狼疮等疾病的监控以及预后。近年来，CRP也应用在恶性肿瘤的诊断和疗效监控中，因为 随着恶性肿瘤细胞中巨噬细胞释放出蛋白酶，这些恶性肿瘤合成的CRP也在随之增加，尤 其出现在肿瘤发生转移和细菌感染时。而且预后不好时，通常CRP的浓度不会降低，但在预 后较好的病人中，CRP浓度通常较低，因此CRP水平对预后有着非常重要的意义。
[0005]目前市场上常用检测全量程C反应蛋白试剂主要是采用放免法、ELISA法、化学发 光法等分析方法检测样本中全量程C反应蛋白含量。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种全量程C反应蛋白定量检测试剂盒。
[0007] 本发明提供的试剂盒，
[0008] 为 1)或 2):
[0009] 1)包括异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白单克隆抗体溶液和碱性磷酸酶标记的C 反应蛋白单克隆抗体溶液；
[0010] 所述异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白单克隆抗体溶液和所述碱性磷酸酶标记C 反应蛋白单克隆抗体溶液的溶剂均为抗试剂缓冲液；
[0011] 所述抗试剂缓冲液按照如下方法制备：将溶液A、表面活性剂、酪蛋白、牛血清白 蛋白、防腐剂和水混匀得到抗试剂缓冲液；
[0012] 所述溶液A由Trizma base、Na+和水组成；
[0013] 2)包括所述异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白单克隆抗体、所述碱性磷酸酶标记 的C反应蛋白单克隆抗体和所述抗试剂缓冲液。
[0014] 上述试剂盒中，
[0015] 所述抗试剂缓冲液中，所述溶液A、所述表面活性剂、所述酪蛋白、所述牛血清白蛋 白和所述防腐剂的配比为 1000_1500ml :8-12ml :30-60g :200-300g :l-3ml;
[0016] 所述溶液A中，所述Trizma base的浓度为0? 05-0. 2mol/L ;所述Na+的浓度为 0. 1-0. 4mol/L。所述抗试剂缓冲液的pH值为7. 5-8. 5。
[0017] 上述试剂盒中，
[0018] 所述抗试剂缓冲液中，所述表面活性剂为吐温-20,所述防腐剂为ProcLin-300 ;
[0019] 所述抗试剂缓冲液中，所述溶液A、所述吐温-20、所述酪蛋白、所述牛血清白蛋白 和所述 ProcLin-300 所述水的配比为 1150ml :9. 2ml :46g :230g :1. 2ml :860ml;
[0020]所述溶液A中，所述Na+源于NaCl，所述NaCl在所述溶液A中浓度为0.2mol/L;
[0021] 所述Trizma base在所述溶液A中的浓度为0? lmol/L〇
[0022] 上述试剂盒中，
[0023] 所述异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白单克隆抗体溶液由异硫氰酸荧光素标记 的C反应蛋白单克隆抗体和所述抗试剂缓冲液组成，所述异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋 白单克隆抗体的浓度为〇. 1-0. 5 y g/mL;
[0024] 所述碱性磷酸酶标记C反应蛋白单克隆抗体溶液由碱性磷酸酶标记C反应蛋白单 克隆抗体和所述抗试剂缓冲液组成，所述碱性磷酸酶标记C反应蛋白单克隆抗体的浓度为 0.5-1y g/mL；
[0025] 所述异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白单克隆抗体中的C反应蛋白单克隆抗体和 所述碱性磷酸酶标记C反应蛋白单克隆抗体中C反应蛋白单克隆抗体不同。
[0026] 上述试剂盒还包括磁分离试剂；
[0027] 所述磁分离试剂为将抗异硫氰酸荧光素抗体共价连接在磁珠表面，得到磁分离试 剂；
[0028] 所述抗异硫氰酸荧光素抗体为多克隆抗体；
[0029] 所述抗异硫氰酸荧光素抗体和所述磁微粒的配比为30 y g-200 y g:lmg;
[0030] 所述磁微粒的直径为0? 5-1. 5 y m。
[0031] 上述试剂盒中，还包括校准品；
[0032] 所述校准品由n个不同浓度的校准品溶液组成，所述校准品溶液由C反应蛋白抗 原和校准品缓冲液组成，且所述C反应蛋白抗原在所述校准品中为不同浓度；
[0033] 所述校准品缓冲液由Na+、蛋白类保护剂、防腐剂、Trizma base、蛋白酶抑制剂和 水组成，所述校准品缓冲液的pH值为6. 0-9. 0,具体为7. 5 ±0. 05。
[0034] 所述Na+、蛋白类保护齐IJ、防腐齐lj、Trizma base、蛋白酶抑制剂和水组成，所述 Na+浓度为0. 1-lmol/L、所述蛋白类保护剂的质量百分含量为2-10%、所述防腐剂体积 百分含量为1-5%。、所述1^_&6&%浓度为0.01-0.5111 〇1/1、所述蛋白酶抑制剂浓度为 0.01-0. 05 y g/mL。
[0035] 上述试剂盒中，
[0036] 所述Na+源于NaCl，所述NaCl的浓度为0? 15mol/L ;
[0037] 所述蛋白类保护剂为牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白质量百分含量为5. 56 % ;
[0038] 所述防腐剂为Proclin-300,所述Proclin-300体积百分含量为1. 85%〇 ;
[0039] 所述 Trizma base 的浓度为 0? 〇55mol/L ;
[0040] 所述蛋白酶抑制剂为抑肽酶，所述抑肽酶浓度为0. 01 y g/mL。
[0041] 上述试剂盒中，
[0042] 所述校准品由n个不同浓度的校准品溶液组成，n小于等于6 ;所述校准品为浓度 为 0 y g/mL、5 y g/mL、15 y g/mL、30 y g/mL、60 y g/mL、200 y g/mL C 反应蛋白抗原溶液。
[0043] 所述试剂盒还包括质控品、样本稀释液、清洗液和底物溶液；
[0044] 所述质控品为2个不同浓度的校准品；所述质控品为浓度为5±1 yg/mL和 60±12yg/mL的校准品。
[0045] 所述清洗液由吐温-20、氯化钠和浓度为0? 15M、pH为8. 0±0. 05的Tris-HCl缓冲 液组成，其中，所述吐温-20的体积百分含量为0. 04%，所述氯化钠的浓度为0. 25mol/L ;
[0046] 所述底物溶液由二氢吖啶和浓度为0. 25M、pH为8. 0±0. 05的Tris-HCl缓冲液组 成，其中，所述二氢吖啶终浓度为〇. 25g/mL ;
[0047] 所述样本稀释液由牛血清白蛋白、trizma base和水组成，其中，所述牛血清白蛋 白的质量百分含量为〇? 2% -5%，所述trizma base的浓度为0? 02mol/L〇
[0048] 本发明另一个目的是提供一种制备上述的试剂盒的方法。
[0049] 本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述试剂盒中8种组分均独立包装；再整体 包装为试剂盒。
[0050] 上述的试剂盒在C反应蛋白定量检测中的应用也是本发明保护的范围；
[0051] 或上述的试剂盒在制备C反应蛋白定量检测产品中的应用也是本发明保护的范 围；
[0052] 或上述的试剂盒中8种组分在制备C反应蛋白定量检测产品中的应用也是本发明 保护的范围；
[0053] 或一种待测样本中C反应蛋白定量检测方法包括如下步骤：
[0054] 1)用上述的试剂盒中的样本稀释液稀释待测样本，得到稀释样本；
[0055] 2)将上述的试剂盒中的校准品、质控品和所述稀释样本分别与上述的试剂盒中的 异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白单克隆抗体溶液混匀，反应，得到一次免疫反应产物；
[0056] 3)将所述一次免疫反应产物与上述的试剂盒中的磁分离试剂混匀，反应，得到反 应产物，将所述反应产物中的沉淀与磁珠清洗液混悬，收集沉淀，即为一次磁分离产物；
[0057] 4)将所述一次磁分离产物与上述的试剂盒中的碱性磷酸酶标记的C反应蛋白单 克隆抗体溶液混匀，反应，得到再次免疫反应产物；
[0058] 5)将所述再次免疫反应产物与上述的试剂盒中的磁分离试剂混匀，反应，得到二 次反应产物，将所述二次反应产物中的沉淀与磁珠清洗液混悬，收集沉淀，即为二次磁分离 产物；
[0059] 6)将所述二次磁分离产物和上述的试剂盒中的底物溶液混匀，得到混合产物，用 化学发光仪检测所述混合产物的发光强度，通过发光强度计算待测样本中全量程C反应蛋 白定量；
[0060] 所述磁珠清洗液为将上述的试剂盒中清洗液与水按1:7混匀，得到溶液；
[0061] 或上述的试剂盒中磁分离试剂在C反应蛋白定量检测中的应用也是本发明保护 的范围。
[0062] 所述异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白单克隆抗体为用异硫氰酸荧光素标记C反 应蛋白单克隆抗体A得到的产物；
[0063] 所述碱性磷酸酶标记C反应蛋白单克隆抗体为用碱性磷酸酶标记C反应蛋白的单 克隆抗体B得到的产物。
[0064] 本发明具有以下优点：
[0065] 本发明利用磁微粒子与化学发光技术相结合，通过对试剂盒中校准品缓冲体系筛