选、抗试剂缓冲体系筛选，最终提供了一种检测范围宽、灵敏度高、精密度好、检测用时少的 定量检测试剂盒，并适用于全自动化学发光仪，操作简单，满足临床大量检测样本的需求。
[0066] 本发明所采用的检测方法是磁微粒分离化学发光免疫检测，是将酶标记技术，磁 分离技术和化学发光技术相结合，其操作方便、简单，反应条件温和，发光值稳定且受外界 条件影响较小。相比于现有检测方法，本发明具有样本处理过程简单，检测成本低，检测快 速，测试结果准确、重复性好等优点。
【附图说明】
[0067] 图1为磁微粒分离化学发光免疫法检测全量程C反应蛋白示意图。
[0068] 图2为ROCHE公司的检测试剂盒测定C反应蛋白。
【具体实施方式】
[0069] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0070] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0071] 本发明检测试剂盒中的所有组分均能通过商业途径从生物试剂或化学试剂公司 购买得到。本发明中所用标记异硫氰酸荧光素抗体为美国Fitzgerald公司生产，货号： 10-7893 ;标记碱性磷酸酶抗体为美国Fitzgerald公司生产，货号：10-7894 ;抗原为美国 Fitzgerald公司生产，货号：30R-AC001x ;碱性磷酸酶购自英国BBI公司，批号：1693AA ;羧 基磁珠胶体溶液购自merck公司，货号为EM1-100/40 ;羊抗异硫氰酸焚光素抗体血清购自 解放军总医院第一附属医院实验动物科，货号：Y11005 ;异硫氰酸荧光素（FITC)购自SIGMA 公司，CAT :3326-32-7,货号：F7250 ;SMCC 购自 thermo fisher scientific 公司，货号： 22360 ;2-IT 购自 thermo fisher scientific 公司，CAS :4781-83-3 ;货号：26101 ;NHS 购自 S頂GA 公司，CAS:6066-82-6,货号：130672;EDC 购自 S頂GA 公司，CAS:25952-53-8,货号： E7750 ;磁微粒试剂、底物溶液、清洗液均来自博奥生物集团有限公司成品试剂盒。
[0072] 实施例1、全量程C反应蛋白（CRP)定量检测试剂盒组分及其方法
[0073] -、全量程C反应蛋白定量检测试剂盒的制备
[0074] 将如下8种组分独立包装后再整体包装为试剂盒，即为全量程C反应蛋白定量检 测试剂盒：1、校准品（含一系列浓度的C反应蛋白，用于建立标准曲线）；2、质控品（含一定 浓度的C反应蛋白）；3、试剂A(含一定浓度的异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白单克隆抗 体溶液）；4、试剂B (含一定浓度的碱性磷酸酶标记的C反应蛋白单克隆抗体）5、样本稀释 液（含〇.2_1.0%牛血清白蛋白（1^厶）的1：1^21]^匕386(1：1^8)缓冲液） ；6、磁分离试剂（结 合有抗异硫氰酸荧光素抗体的磁微粒混悬液）；7、清洗液（用于配制磁珠清洗液）；8、底物 溶液。试剂盒中1、2、3、4、5、6、8为必备试剂，7可通过购买其他公司类似产品代替使用。上 述试剂盒置于冰箱中4度保存。
[0075] 具体如下：
[0076] 1、校准品
[0077] 1)校准品缓冲液的配制
[0078] 校准品缓冲液由Na+、蛋白类保护剂、防腐剂、Trizma base、蛋白酶抑制剂和水组 成，各组分的终浓度如下：Na+源于NaCl，其浓度为0. 15mol/L;蛋白类保护剂为牛血清白蛋 白，其浓度为5.56% (质量百分含量）；防腐剂为Proclin-300,其浓度为1.85%。（体积百 分含量）；Trizma base浓度为0? 055mol/L ;蛋白酶抑制剂为抑肽酶，其浓度为0? 01 y g/mL ; 校准品缓冲液的pH值为7. 5 ±0. 05。
[0079] 校准品缓冲液的配置方法具体如下：
[0080] a)取一干燥洁净的试剂瓶，加入纯化水600mL ;
[0081] b)加入 Trizma base 6. 68g，NaCl 8. 67g，牛血清白蛋白 55. 55g ;
[0082] c)加入 Proclin-300(厂家：SIGMA，货号：48914-U) 1.848mL，充分混匀 lh ;
[0083] d)加入抑肽酶溶液lmL (抑肽酶为固体粉末，先用纯化水溶解，使其浓度为0. lmg/ mL，抑肽酶厂家：SIGMA，货号：A6106)，调节PH至7. 5±0. 05,充分混匀lh ;
[0084] e)加入纯化水定重至1000g，验证PH至为7. 5±0. 05 ;
[0085] f)使用0. 22 y m滤膜过滤并收集滤液，贴好标签，2~8°C保存。
[0086] 2)校准品的制备
[0087] 将C反应蛋白抗原（厂家：Fitzgerald，货号：30R_AC001x)用上述1)中校准品缓 冲液稀释成200 y g/mL、60 y g/mL、30 y g/mL、15 y g/mL、5 y g/mL的校准品，并等量分装成 浓度为 〇 y g/mL、5 y g/mL、15 y g/mL、30 y g/mL、60 y g/mL、200 y g/mL 的校准品。
[0088] 2、质控品（含一定浓度的C反应蛋白）
[0089] 以上述浓度为5 y g/mL和60 y g/mL的校准品作为质控品。
[0090] 3、试剂A(异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白单克隆抗体溶液）
[0091] 1)、抗试剂缓冲液的配制
[0092] 抗试剂缓冲液的pH值为7. 5-8. 5。
[0093] 抗试剂缓冲液由溶液A、蛋白类保护剂、防腐剂、表面活性剂、和水组成，溶液A 由Na +、Trizma base和水组成。溶液A中各组分的终浓度如下：Na+源于NaCl，其浓度为 0. 2mol/L ;Trizma base浓度为0. lmol/L ;抗试剂缓冲液中的蛋白类保护剂为牛血清白蛋 白，表面活性剂为吐温-20。溶液A、吐温-20、酪蛋白、牛血清白蛋白和ProcLin-300的配比 为 1150ml :9. 2ml :46g :230g :1. 2ml ;抗试剂缓冲液的 pH 值为 7. 5±0. 05。
[0094] 抗试剂缓冲液的配制方法具体如下：
[0095] a)取 Trizma base 27. 85g，NaCl 26. 88g 于 2. 5L 试剂瓶中；
[0096] b)取1150mL纯化水于2. 5L试剂瓶中，充分搅拌直至完全溶解，调节pH至 7. 5 ±0.05;得到溶液A ;
[0097] c)加入吐温-209. 2mL，酪蛋白46g，牛血清白蛋白230g，充分搅拌混匀至完全溶 解；
[0098] d)加入 ProcLin-3001. 2mL，纯化水 860ml 定量至 2300g，充分混匀 lh ;
[0099] e)验证 PH 至为 7. 5 ± 0? 05 ;
[0100] f)使用0. 22 iim滤膜过滤并收集滤液，贴好标签，2~8°C保存。
[0101] 2)、异硫氰酸荧光素标记C反应蛋白单克隆抗体
[0102] 异硫氰酸荧光素标记C反应蛋白单克隆抗体为用异硫氰酸荧光素标记C反应蛋白 单克隆抗体得到的产物，具体方法如下：
[0103] 取lmg C反应蛋白单克隆抗体（厂家：Fitzgerald，货号：10-7893)，用H)10柱子 更换缓冲液（脱去原抗体保存缓冲液，更换为〇. 2mol/L碳酸盐缓冲液PH9. 5,16. 8g碳酸氢 钠溶于l〇〇〇g纯化水中，PH9. 5)悬浮，并通过离心浓缩至5mg/mL，加入浓度为0? 5mg/mL的 异硫氰酸荧光素溶液（溶剂为〇. 2mol/L PH9. 5的碳酸盐缓冲液）100 y L(C反应蛋白单克 隆抗体与异硫氰酸荧光素的配比为lmg :0. 05mg)，混合均匀。室温避光反应20小时，得到 异硫氰酸荧光素标记C反应蛋白单克隆抗体。
[0104] 再使用H)10柱子纯化，用0. 2mol/L碳酸盐缓冲液PH9. 5洗脱，收集黄色液体，保 存于-20°C，得到纯化后异硫氰酸荧光素标记C反应蛋白单克隆抗体。
[0105] 3)、试剂A的制备
[0106] 将上述2)的纯化后异硫氰酸荧光素标记C反应蛋白单克隆抗体与上述1)的抗 试剂缓冲液混匀，得到试剂A，其中异硫氰酸荧光素标记C反应蛋白单克隆抗体的浓度为 0?1y g/mL〇
[0107] 4、试剂B (含一定浓度的碱性磷酸酶标记的C反应蛋白单克隆抗体）
[0108] 1)碱性磷酸酶标记C反应蛋白单克隆抗体
[0109] 碱性磷酸酶标记C反应蛋白单克隆抗体为用碱性磷酸酶标记C反应蛋白另一种单 克隆抗体得到的产物，具体方法如下：
[0110] 取lmg C反应蛋白另一种单克隆抗体（厂家：Fitzgerald，货号：10-7894)，用 H)10柱子更换缓冲液（0. 05mol/L三乙醇胺水溶液PH8. 6)悬浮，并通过离心浓缩至2. 5mg/ mL，加入浓度为 13. 76mg/mL 的活化剂 2-Iminothiolane hydrochloride (2-IT)溶液（2-IT 厂家：thermo fisher scientific，货号：26101 ;溶剂为浓度为 0.05mol/L、pH 为 10. 5 三乙 醇胺水溶液）5 y L，体积比1:80,室温放置20分钟后加甘氨酸终止活化反应，室温下放置10 分钟。再使用Sephadex G25柱子除盐，得到活化后抗体。
[0111] 取1. 5mg碱性磷酸酶（厂家：BBI，批号：1693AA)，上H)10柱子更换缓冲液 (0. 05mol/L三乙醇胺水溶液PH8. 6)并通过离心浓缩至5mg/mL，加入浓度为6. 69mg/ mL 的 Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)溶液 (SMCC 厂家：thermo fisher scientific，货号：22360,溶剂为 DMF，厂家：sigma，货号： 227056) 12 y L，体积比1:40,室温放置20分钟，加入甘氨酸终止活化反应，室温放置10分 钟。使用Sephadex G25柱子除盐，得到活化后碱性磷酸酶。
[0112] 将活化后的C反应蛋白抗体与活化后碱性磷酸酶按lmg C反应蛋白抗体加入lmg 碱性磷酸酶的比例混合，同时加入5 y L 1M氯化镁水溶液混勾，放置4°C反应20小时。
[0113] 使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的C反应蛋白抗体和碱性磷 酸酶，用〇. 〇5mol/L三乙醇胺水溶液PH7. 0洗脱，洗脱流速为0. 75ml/min，柱子直径/长度 为1. 6/60cm，观察出峰位置并比对标准分子图谱收集连接物，将连接物保存于4°C，得到碱 性磷酸酶标记C反应蛋白单克隆抗体。
[0114] 2)、试剂B的